Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

وأيد هذا العمل قبل فؤاد-الحفل الخيري إلى أ. ف. (#21545) ومنحة البذور المستشفى سان رافائيل (OSR) إلى S.Z. (ZAMBRA5X1000). الدكتور جان-إيف تينيفيز من "مركز تحليل الصورة" من معهد باستور المسلم لتقاسم علنا إجراءات MATLAB "تعقب بسيطة" له.

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في سان رافائيل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1-تشريح العضلات اللكتات الماوس
<ol><li>تعقيم الملقط ومقص (مستقيمة ومنحنية) بالتعقيم.</li>
	<li>إعداد وتصفية جميع وسائل الإعلام (حظر المتوسطة، متوسطة الهضم، تنتشر المتو?...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي يتم تشكيلها من قبل دمج خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتمايز2،3، 4. تقييم التمايز ميوبلاست، الإجرا?...

الهيكل العظمى والعضلات من الأنسجة أكبر في الجسم البشري، وبلغ مجموعها 35-40 ٪ من كتلة الجسم1. الخلايا الأقمار الصناعية هي الخلايا الجذعية العضلية، تشريحيا تتميز بموقفهم (محاذياً لغشاء البلازما، تحت الصفيحة القاعدية لألياف العضلات)، التي تؤدي إلى تكاثر myoblasts (الخلايا السلف شذوذ)، وفي نهاية المطاف يفرق ودمج ميوفيبيرس القائمة و/أو الصمامات بشكل جديد ميوفيبيرس2،،من34. اكتشافهم والتقدم المحرز في دراسة تلك الأحياء أدى إلى أفكاراً هامة في تنمية العضلات والتجدد.
بروتوكولات لعزل وتفرق ميوبلاستس في ميوتوبيس قد وضعت منذ سنوات عديدة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيكل العظمى والعضلات التمايز5،،من67. بيد أن معظم هذه الطرق تمثل الإجراءات الثابتة التي تعتمد على تحليل الخلايا الثابتة، ونتيجة لذلك، عدم السماح للعلماء بالكامل استكشاف عمليات ديناميكية للغاية، مثل ميوبلاست الانصهار والنضج ميوفيبير. المثال الأكثر إثارة للدهشة هو تحديد المواقع النووية، التي محكم التنظيم، مع الأنوية في البداية في مركز ميوفيبير، وثم، تقع في المحيط بعد نضوج ميوفيبير8،9. تصوير الحية هو الأسلوب الأكثر ملاءمة الحصول على المزيد من الأفكار في هذه ظاهرة غريبة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للعلماء لتسجيل تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري وإجراء تحليلات كمية من التعقب التلقائي لنواة ميوبلاست. يوفر هذا الأسلوب الفائق وصف كمية للسلوك وديناميات وميوبلاست النووية خلال التمايز والانصهار. البروتوكول وينقسم إلى أربعة أجزاء مختلفة، وهي: (1) جمع عضلات من هيندليمبس الفئران، (2) عزل myoblasts الأولية التي تتكون في الهضم الميكانيكي والانزيميه، وانتشار (3) ميوبلاست والتفريق (4) ويعيش التصوير لتعقب الأنوية داخل ح 16 الأولى من التمايز ميوبلاست.
في الإجراء التالي، وتعزل من الفئران H2B-التجارة والنقل ميوبلاستس وتعامل مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل، كما هو موضح سابقا10. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل ميوبلاستس من الفئران المحورة وراثيا الأخرى التي تعبر عن بروتين فلوري في النواة أو ترانسفيكت الخلايا المعزولة من الفئران البرية من نوع للتعبير عن بروتين فلوري في النواة، كما هو موضح بيمنتل et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

المواقع النووية داخل الخلايا مهم للعمليات الخلوية متعددة في مجال التنمية والتجدد. المثال الأكثر إثارة للاهتمام لتحديد المواقع النووية يحدث أثناء تمايز الهيكل العظمى والعضلات. ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي شكلتها انصهار خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتفرقة. المواقع النووية الصحيح داخل ميوفيبيرس مطلوب من أجل تجديد العضلات السليمة والدالة. إجراءات مشتركة لتقييم تشكيل التمايز وميوفيبير ميوبلاست يعتمد على الخلايا الثابتة تحليلها بواسطة الفلورة، مما يعوق دراسة سلوك الحركة وخلية نووية على مر الزمن. هنا، نحن تصف أسلوباً لتحليل تشكيل التمايز وميوفيبير وميوبلاست بتصوير الخلايا الحية. نحن نقدم برنامج لتعقب النووي الآلي للحصول على وصف كمي الفائق ديناميات النووية والسلوك ميوبلاست (أي المسار) خلال التمايز والانصهار.

تلقائياً اتباع حركة النووية خلال التمايز ميوبلاست في تصوير حية، الأنوية ينبغي أن ترتبط بشكل تفضيلي يكون فلوريسسينتلي المسمى. من المهم ملاحظة أن استخدام جزيئات الحمض النووي إينتيركالاتينج ليس ممكناً لأن هذه الجزيئات تتداخل مع انتشار والتفريق بين myoblasts الابتدائية<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

استغلال التصوير الحي إلى نويات المسار خلال ميوبلاست التمايز والانصهار

الهيكل العظمى والعضلات والتفريق هو عملية ديناميكية للغاية، التي تعتمد خاصة على المواقع النووية. وهنا يصف لنا طريقة لتعقب تحركات الأنوية بتصوير الخلية الحية أثناء تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست والقيام بوصف كمي لديناميات الأنوية باستخراج المعلومات من التعقب التلقائي.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

بدون بروتوكول، من الممكن التحقيق في العملية الديناميكية لتمايز myoblast وتشكيل myofiber، ولا سيما تحديد المواقع النووية عن طريق استغلال التصوير الخلية الحية. التصوير الخلية الحية من myoblast مع نواة الخلية الأجنبية تسمح لدراسة تمايز myoblast في الخلايا الحية والتتبع التلقائي للنيات. يساعد العرض التوضيحي المرئي في فهم كيفية الجمع بين عزل الخلايا الأساسية مع التصوير الحي وتحليل التصوير.إظهار الإجراء مع فريدريكا كولومبو، سيكون جيوغا Careccia، طالب دكتوراه في مختبرنا. تبدأ عن طريق حصاد soleus tibialis، extensororum لونجوس، gastrocnemius، رباعية، والعضلات ثلاثية الرؤوس من كلا الأطراف الخلفية من الماوس الكبار في طبق بيتري من برنامج تلفزيوني على الجليد. استخدام مقص معقمة والملاقط لإزالة بعناية الأوتار والدهون من كل عضلة ونقل العضلات إلى طبق بيتري فارغة.باستخدام مقص منحني معقم قطع و mince العضلات حتى يتم الحصول على كتلة موحدة ونقل القطع العضلية إلى أنبوب 50 ملليلتر. ثم إضافة 10 ملليلتر من الهضم المتوسط لقطع العضلات لاحتضان لمدة 30 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية في 250 دوران في الدقيقة الواحدة. في نهاية الهضم الأنزيمي ، أوقف التفاعل مع 10 ملليلتر من الحجب المتوسط.وتدور أسفل العينة عن طريق الطرد المركزي. ضع الأنبوب على الجليد ونقل المابير إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي المُتفوّع مرة أخرى.وإعادة تعليق بيليه في ملليمتر واحد من DMEM. تكملة ذلك مع عشرة في المئة مصل البقر الجنين، أو FBS، على الجليد. هضم بيليه محفوظة في 10 ملليلتر من طازج هضم المتوسطة كما أظهرت للتو والجمع بين بيليه هضم مع تعليق الخلية الاحتياطية, على الجليد.سلالة الخلايا المسحوبة من خلال مرشح 70 ميكرومتر، تليها مرشح 40 ميكرومتر. وغسل الخلايا في 15 ملليمتر من DMEM الطازجة، تستكمل مع 10 في المئة FBS. في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة في درجة حرارة الغرفة.وقف التحلل بعد خمس دقائق مع 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وطارد مركزي إضافي. إعادة تعليق بيليه في 20 ملليلتر من DMEM تكمل مع 10 في المئة FBS وطبقة قبل الخلايا في طبق بيتري غير المصقول. بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون جمع الخلية الساتلية التي تحتوي على افر.وقبل لوحة تعليق الخلية مرتين أكثر كما هو موضح. بعد الطلاء الماضي، وجمع الخلايا الأقمار الصناعية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من متوسطة الانتشار الطازجة. تقسيم الخلايا بين اثنين من الكولاجين المغلفة 150 ملليلتر أطباق بيتري مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين في الطبق الواحد للحث على التعبير H2BGFP.وتعيد الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة يومين أو ثلاثة أيام. عندما وصلت myoblasts كثافة التجريبية المناسبة، وغسل الخلايا في كل طبق مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا من قيعان لوحة مع مليلترين من التربسين في طبق في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تأكيد انفصال عن طريق المجهر الخفيفة ووقف رد الفعل مع خمسة ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى عشرة في المئة FBS لكل لوحة.للتصوير الخلية الحية، لوحة مرتين عشرة إلى الخلايا الخامسة في كل بئر من لوحة 12 جيدا المغلفة مع 350 ميكروليتر من التمايز المتوسطة، وتستكمل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر لمدة ساعتين. عندما تلتزم الخلايا بأسفل اللوحة ، ضع اللوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة 5 في المئة لثاني أكسيد الكربون في مرحلة المجهر confocal واستخدام هدف جاف 20 مرة للحصول على حقول الرؤية مع مئات الخلايا للحصول على صور 16 بت مع 1024 بكسل في الإطار الواحد كل ست دقائق لمدة 16 ساعة. لكل موضع المكتسبة، إنشاء ملف متعددة الإطار نقطة tif وتحميل واستخراج برنامج zip نقطة المقدمة في مجلد محدد.فتح مثال مجلد تتبع التجزئة وانقر فوق do تجزئة نقطة M لفتح إطار الأوامر في Matlab. تغيير البرامج النصية لتجزئة المستحق M بحيث مسار اسم ملف المتغير هو اسم ملف tif والمسار مسار الإدخال هو المجلد حيث يتم تضمين tif نقطة. انقر فوق تشغيل لتشغيل البرنامج النصي.سيتم حفظ نتيجة تجزئة كصعرة نقطة ملف، في حين يمكن تصور تجزئة النوى في الرقم الناتج. لإنشاء المسارات ، أول انقر نقرا مزدوجا توليد المسارات نقطة M في نفس مجلد العمل. بعد ذلك، قم بتغيير اسم الملف إلى اسم الملف نقطة ملف Mat نقطة المناسبة للنيات المجزأة.انقر فوق تشغيل لتشغيل البرنامج النصي. سيتم حفظ نتيجة التتبع كملف آخر من النقاط و سيتم رسم المسارات التي تم إنشاؤها. لتقييم جودة المسارات.انقر أولاً مزدوج نقطة تعقب الاختيار M وتعديل اسم الملف إلى اسم tif نقطة المناسبة. ثم انقر فوق ملف اسم المسار لاستخدام ملف حصيرة نقطة من المسارات وانقر فوق تشغيل. في إطار الشكل استخدام شريط التمرير السفلي لتحديد النواة.سيتم نقل النواة المحددة باللون الأحمر، ويمكن اتباع مسار الخلية المحددة في الوقت المناسب باستخدام شريط التمرير العلوي. تشير الصلبان الخضراء إلى النوى المكتشفة. ضعفت انتشار وتمايز بقوّة في myoblasts يُزرع مع هويشست.بالمقارنة مع myoblast معزولة عن الفئران H2BGFP وزرع مع دوكسيسكلين أو نوع البرية، سلسلة الميوسين الثقيلة المسمى myoblasts. التصوير الخلية الحية مع myoblasts الأولية التي تعبر عن بروتين H2BGFP يسمح تتبع النوى أثناء التمايز. الصور المدمجة من انتقال في قنوات GFP في نقطة الوقت الأولي والأخير من فترة التمايز، تسمح بتحديد ميوتيوب وبالتالي النوى التي ينتهي الاندماج في ميوتيوب أو التي لا تنصهر في ميوتوب.بعد التصوير عن طريق المجهر الفلوري confocal، يمكن تقسيم النوى كما أظهرت وتحويل مستجمعات المياه يمكن استخدامها لفصل الأجسام القريبة. مع هذا النهج، يتم تحديد معظم النوى في الصورة، مما يسمح للحركة النووية أن يتم تعقب كما هو موضح. على سبيل المثال، يبدو أن الطول الإجمالي للمسارات أعلى قليلاً بالنسبة للخلايا الملطخة بـ Hoechst.على الرغم من أن الفرق ليس كبيرا. ومع ذلك ، فإن حساب النزوح الكلي خلال فترة زمنية يكشف عن أن النزوح الكلي للخلايا الملطخة بهيشت أصغر بكثير من الخلايا غير المطّهية. كما هو متوقع فإن الاختلاف السنوي الإجمالي للخلايا غير المطّطة أصغر بكثير مقارنة بالخلايا الملطخة بـ Hoechst.من المهم اتباع البروتوكول تماما كما هو موضح على وجه الخصوص عند الجمع بين المهارات التقنية من الخطوات البيولوجية مع المجهر confocal والبرمجيات المستخدمة الخطوات. لدراسة التمايز myoblast وتحديد المواقع النووية في نموذج آخر من العضلات الفائدة فمن الممكن لنقل myoblast معزولة مع البروتين النووي الفلورسنت. وقد مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف الديناميات الخلوية والنووية أثناء تمايز العضلات ومواصلة التحقيق في العيوب في هذه العمليات.تحت ظروف مرضية مختلفة مثل dystrophies العضلات.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

الخلايا الظهارية الثديية شكل الماوس Mammospheres خلال التمايز المولد للبن

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

تحديد مساهمة لأنظمة الطاقة أثناء ممارسة الرياضة

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...