Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af AFM-Telethon at E.V. (#21545) og Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskud til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra hubben billede analyse af Institut Pasteur er anerkendt for offentligt deler sin "Simple Tracker" MATLAB rutiner.

Alle procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt af San Raffaele institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. dissektion af mus hindlimb muskler
<ol><li>Sterilisere pincet og saks (både lige og buede) ved autoklavering.</li>
	<li>Forberede og filtrere (0,22 µm) alle medier (blokerende medium, fordøjelsen medium, prolifererende medium og differentiering medium) før du starter eksperimentet (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Sætte 5 mL af fosfatbufferet saltop...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler, der er dannet ved fusion af muskel prækursorer celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering2,3, 4. For at vurdere myoblast differentiering, består den fælles procedure i dyrkning af myoblasts i differentiere medium og fastsættelse af celler på forskellige tidspunkter til at udføre immunofluorescens farvning for...

Skeletmuskulatur er den største væv i den menneskelige krop, sammentælling 35-40% af kroppens masse1. Satellit celler er muskel stamceller, anatomisk karakteriseret ved deres position (sammenstillet til plasma-membran nedenunder basal lamina af muskelfibre), som giver anledning til prolifererende myoblasts (myogenic stamceller), som i sidste ende differentiere og integrere i eksisterende myofibers og/eller smelter sammen og form nye myofibers2,3,4. Deres opdagelse og fremskridt i undersøgelsen af deres biologi har ført til betydelig indsigt i muskel udvikling og regeneration.
Protokoller til at isolere og differentiere myoblasts i myotubes er blevet udviklet for mange år siden og er stadig meget udbredt at studere skeletmuskulatur differentiering5,6,7. Men de fleste af disse metoder udgør statisk procedurer, der er afhængige af analysen af faste celler og derfor ikke tillader videnskabsfolk til fuldt ud at udforske meget dynamiske processer som myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksempel er nukleare positionering, som er stramt reguleret med kerner først i midten af myofiber og derefter placeret i periferien efter myofiber modning8,9. Live imaging er den mest hensigtsmæssige teknik til at opnå yderligere indsigt i sådan en ejendommelige fænomen.
Her, beskriver vi en metode, der gør det muligt for forskere at optage myoblast differentiering og myotube dannelse af time-lapse mikroskopi og udføre kvantitative analyser fra den automatiske sporing af myoblast kerner. Denne metode giver en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd under differentiering og fusion. Protokollen er opdelt i fire forskellige dele, nemlig (1) samling af muskler fra hindlimbs af mus, (2) isolering af primære myoblasts, der består i mekaniske og enzymatiske fordøjelse, (3) myoblast spredning og differentiering og (4) Live imaging til at spore kerner inden for de første 16 h af myoblast differentiering.
I følgende procedure er myoblasts isoleret fra H2B-normal god landbrugspraksis mus og behandlet med 1 µg/mL af doxycyclin at fremkalde H2B-normal god landbrugspraksis udtryk, som tidligere beskrevet10. Alternativt er det muligt at isolere myoblasts fra andre Transgene mus, der udtrykker en fluorescerende proteiner i kernen eller transfect cellerne isoleret fra wild-type mus til at udtrykke en fluorescerende proteiner i kernen, som beskrevet af Pimentel mfl. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Nukleare positionering i celler er vigtige for flere cellulære processer i udvikling og regeneration. Den mest spændende eksempel på nukleare positionering opstår under skeletmuskulatur differentiering. Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler dannes ved fusion af muskel forløber celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering. Korrekt nuklear placering inden for myofibers er nødvendig for korrekt muskel regenerering og funktion. Den fælles procedure for vurdering af myoblast differentiering og myofiber dannelse bygger på faste cellerne analyseres ved immunfluorescens, som hindrer studiet af nukleare bevægelse og celle opførsel over tid. Her, beskriver vi en metode til analyse af myoblast differentiering og myofiber dannelsen af levende celle billeddannelse. Vi leverer en software til automatiseret nukleart sporingen at opnå en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd (dvs. bane) under differentiering og fusion.

Automatisk følge nukleare bevægelse under myoblast differentiering i live imaging, bør atomkerner fortrinsvis fluorescently mærket. Det er vigtigt at bemærke, at ved hjælp af DNA-intercalating molekyler ikke er muligt da disse molekyler forstyrre spredning og differentiering af primær myoblasts13. Som et eksempel, er spredning og differentiering blevet analyseret i primære myoblasts kulturperler med eller uden Hoechst (figur 1)...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

At udnytte Live Imaging til Track kerner under Myoblast differentiering og Fusion

Skeletmuskulatur differentiering er en yderst dynamisk proces, som især afhængig af nukleare positionering. Her, beskriver vi en metode til at spore kerner bevægelser af levende celle imaging under myoblast differentiering og myotube dannelse og udføre en kvantitativ karakterisering af kerner dynamics af uddrager information af automatisk sporing.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Uden protokol er det muligt at undersøge den dynamiske proces med myoblastdifferentiering og myofiberdannelse, især nuklear positionering ved at udnytte levende cellebilleddannelse. Levende celle billeddannelse af myoblast med udenlandske cellekerner tillader studiet af myoblast differentiering i levende celler og automatisk sporing af kerner. Visuel demonstration hjælper med at forstå, hvordan man kombinerer primær celleisolering med levende billedbehandling og billeddannelsesanalyse.Demonstrere proceduren med Frederica Colombo, vil være Giorga Careccia, en ph.d.-studerende i vores laboratorium. Begynd med at høste tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps og triceps muskler fra begge bagben af en voksen mus i en petriskål af PBS på is. Brug steril saks og pincet til omhyggeligt at fjerne sener og fedt fra hver muskel og overføre musklerne i en tom petriskål.Ved hjælp af sterile buede saks skåret og hakke musklerne, indtil en ensartet masse er opnået, og overføre muskelstykker til en 50 milliliter rør. Derefter tilsættes 10 milliliter fordøjelsesmedium til muskelstykkerne for en 30 minutters inkubation i et 37 grader celsius vandbad ved 250 rotationer i minuttet. Ved afslutningen af den enzymatiske fordøjelse skal reaktionen stoppes med 10 milliliter blokerende medium.Og drej prøven ned ved centrifugering. Rørret røret på is og overfør supernatanten til et nyt 50 milliliterrør. Centrifuge supernatant igen.Og re-suspendere pellet i en millimeter DMEM. Supplere det med ti procent føtal kvæg serum, eller FBS, på is. Fordøje den reserverede pellet i 10 milliliter frisk fordøjelsesmedium som netop påvist og kombinere den fordøjede pellet med reservecellesuspensionen på is.Strain de trukket celler gennem en 70 mikrometer filter, efterfulgt af en 40 mikrometer filter. Og vask cellerne i 15 millimeter frisk DMEM, suppleret med 10 procent FBS. Ved centrifugeringsafslutningen suspenderes pelletet igen i tre milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer ved stuetemperatur.Stop lysis efter fem minutter med 40 milliliter PBS og en ekstra centrifugering. Re-suspendere pellet i 20 milliliter DMEM suppleret med 10 procent FBS og pre-plade cellerne i ubestrøget petriskål. Efter en time ved 37 grader celsius og fem procent kuldioxid indsamle satellit celle, der indeholder supernatant.Og forplade celle suspensionen to gange mere som påvist. Efter den sidste plettering indsamles satellitcellerne ved centrifugering, og pelleten suspenderes igen i 40 milliliter friskspredningsmedium. Opdelingen cellerne mellem to kollagen belagt 150 milliliter Petri retter med et mikrogram per milliliter doxycyclin pr skål til at fremkalde H2BGFP udtryk.Og returnere cellerne til cellekultur kuvøse i to eller tre dage. Når myoblasterne har nået den relevante eksperimentelle tæthed, vaskes cellerne i hver skål med fem milliliter PBS, og cellerne tages ud af pladebunden med to milliliter Trypsin pr. ret ved 37 grader celsius i fem minutter. Bekræft løsrivelse ved lysmikroskopi og stop reaktionen med fem milliliter DMEM plus ti procent FBS pr. plade.For levende celle billeddannelse, plade to gange ti til den femte celler i hver brønd af en 12 godt plade belagt med 350 mikroliter af differentiering medium, suppleret med kælder membran matrix per brønd i to timer. Når cellerne har holdt sig til bunden af pladen, skal du placere pladen i en 37 grader celsius og fem procent kuldioxid inkubator på en konfokal mikroskop fase og bruge en 20 gange tør mål for at opnå synsfelter med hundredvis af celler til at erhverve 16 bit billeder med 1024 af 1024 pixels pr ramme hvert sjette minut i 16 timer. For hver erhvervet position, generere en multi frame dot tif fil og hente og udtrække prik zip software, der leveres i en valgt mappe.Åbn eksemplet med segmentationssporingsmappe, og klik på gør segmentationspr. Rediger de forfaldne segmenteringspr.-scripts, så det variable filnavnspor er navnet på det tif-fil- og stiinputspor, der er den mappe, hvor punkt-tif'en er indeholdt. Klik på Kør for at køre scriptet.Resultatet af segmenteringen gemmes som en fildtmåtte, mens segmenteringen af kernerne kan visualiseres i outputfiguren. Hvis du vil generere sporene, skal du først dobbeltklikke på generer spor dot M i samme arbejdsmappe. Dernæst skal du ændre filnavnet til filnavn punkt den relevante prik Mat fil for den segmenterede kerner.Klik på Kør for at køre scriptet. Resultatet af sporingen gemmes som en anden dot mat fil og de genererede spor vil blive afbildet. At evaluere kvaliteten af sporene.Dobbeltklik først på kontrolsporingsdr. Klik derefter på filnavnspor for at bruge dot mat-filen på sporene, og klik på Kør. I figurvinduet skal du bruge det nederste rullepanel til at markere kernen.Den valgte kerne vil blive omgivet med rødt, og den valgte celles bane kan følges med tiden ved hjælp af det øverste rullepanel. Grønne kors angiver de fundne kerner. Spredning og differentiering er stærkt svækket i myoblaster dyrket med Hoechst.Sammenlignet med myoblast's isoleret fra H2BGFP mus og dyrket med doxycyclin eller vilde type, myosin tunge kæde mærket myoblaster. Levende cellebilleddannelse med primære myoblaster, der udtrykker H2BGFP-proteinet, gør det muligt at spore kernerne under differentiering. Fusionerede billeder af transmission i GFP kanaler på de første og sidste tidspunkt i differentiering periode, tillader identifikation af myotubes og dermed kerner, der ender med at blive integreret i myotubes eller som ikke smelter i myotubes.Efter billeddannelse ved konfokal fluorescensmikroskopi kan kernerne segmenteres som påvist, og vandskeltransformering kan bruges til at adskille objekter i nærheden. Med denne tilgang er de fleste af kernerne identificeret i billedet, så kernebevægelsen kan spores som påvist. For eksempel fremgår det, at den samlede længde af bane er lidt højere for celler, der er plettet med Hoechst.Selv om forskellen ikke er signifikant. Beregningen af den samlede forskydning i løbet af en tidsforskydning afslører imidlertid, at den samlede forskydning af de celler, der er plettet med Hoechst, er betydeligt mindre end for uindgroede celler. Som forudsagt er den samlede årlige variation for de uindgroede celler betydeligt mindre sammenlignet med celler, der er plettet med Hoechst.Det er vigtigt at følge protokollen nøjagtigt som påvist, især når man kombinerer de tekniske færdigheder fra de biologiske trin med det konfokale mikroskop og software, der anvendes trin. At studere myoblast differentiering og nuklear positionering i en anden muskel model af interesse er det muligt at overføre isolerede myoblast med fluorescerende nukleart protein. Denne teknik banede vejen for at udforske cellulære og nukleare dynamik under muskel differentiering og yderligere undersøge fejl i disse processer.Under forskellige patologiske tilstande såsom muskelsvind.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Bestemmelse af bidrag af Energy Systems under træning

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse af SNARE-medieret membranfusion anvendelse af en enzymatisk Cellefusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende cellebilleddannelse af blodpladegravulation og sekretion under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live celle Fluorescens mikroskopi for at observere væsentlige processer under mikrobielle cellevækst

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...