Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de AFM-Telethon e.v. (#21545) en door de toekenning van het Ospedale San Raffaele (OSR) zaad aan S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez vanaf de Hub van de beeld-analyse van het Institut Pasteur is erkend voor het publiekelijk delen van zijn "Eenvoudige Tracker" MATLAB routines.

Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door het San Raffaele institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. dissectie van muis stuk spieren
<ol><li>Pincetten en scharen (zowel rechte als gebogen) in autoclaaf steriliseren.</li>
	<li>Bereiden en te filteren (0,22 µm) alle media (blokkerende medium, spijsvertering medium, prolifererende medium en differentiatie van medium) voordat het experiment (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Zet 5 mL-fosfa...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen die worden gevormd door de fusie van precursoren spiercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die ondergaan van de proliferatie en differentiatie2,3, 4. Om te beoordelen myoblast differentiatie, bestaat de uniforme procedure voor het kweken van myoblasts in de differentiatie van de middelgrote en tot vaststelling van de cellen op verschillende tijdst...

Skeletspieren is het grootste weefsel in het menselijk lichaam, totaal 35% - 40% van het lichaam massa1. Satelliet cellen zijn de cellen van de stam van het spier, anatomisch gekenmerkt door hun positie (naast aan het plasma-membraan, onder de basale lamina van spiervezels), die aanleiding geven tot delende myoblasts (myogenic voorlopercellen), die uiteindelijk differentiëren en integreren in bestaande myofibers en/of zekering formulier nieuwe myofibers2,3,4. Hun ontdekking en de vooruitgang in de studie van hun biologie heeft geleid tot belangrijke inzichten in spierontwikkeling en regeneratie.
Protocollen te isoleren en te onderscheiden van myoblasts in myotubes vele jaren geleden ontwikkeld en zijn nog steeds gebruikte om te studeren van skeletspieren differentiatie5,6,7. Meeste van deze methoden betekenen echter statische procedures die afhankelijk zijn van de analyse van vaste cellen en, bijgevolg, laat niet wetenschappers hoogdynamische processen, zoals myoblast fusion en rijping van de myofiber volledig te verkennen. Het meest opvallende voorbeeld is nucleaire positionering, die is strak geregeld, met kernen in eerste instantie in het midden van de myofiber en, vervolgens, gelegen aan de rand na8,9van de rijping van de myofiber. Levende imaging is de meest geschikte techniek om nadere te verkrijgen inzichten in dergelijk merkwaardige fenomeen.
Hier beschrijven we een methode waarmee wetenschappers met het opnemen van myoblast differentiatie en myotube vorming door time-lapse microscopie en kwantitatieve analyses uitvoeren van de automatisch bijhouden van myoblast kernen. Deze methode biedt een high-throughput kwantitatieve karakterisering van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag tijdens de differentiatie en fusion. Het protocol is onderverdeeld in vier verschillende delen, namelijk (1) het innen van de spieren van de hindlimbs van muizen, (2) het isolement van de primaire myoblasts, die in de mechanische en enzymatische spijsvertering, (3) myoblast proliferatie en differentiatie, en (4 bestaat) Live imaging voor het bijhouden van de kernen binnen de eerste 16 h myoblast differentiatie.
In de volgende procedure, zijn myoblasts van muizen H2B-GFP werd geïsoleerd en behandeld met 1 µg/mL doxycycline ertoe H2B-GFP expressie, als eerder beschreven10. Als alternatief, is het mogelijk om te isoleren van de myoblasts van andere transgene muizen die uitdrukking geven aan een fluorescente proteïne in de celkern of naar de cellen die geïsoleerd van wild-type muizen uitspreken een fluorescente proteïne in de celkern, zoals beschreven door Pimentel et al. transfect. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Nucleaire positionering binnen cellen is belangrijk voor meerdere cellulaire processen in ontwikkeling en regeneratie. Het meest intrigerende voorbeeld van nucleaire positionering optreedt tijdens de differentiatie van de skeletspieren. Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen gevormd door de fusie van spier voorlopercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die proliferatie en differentiatie ondergaan. Juiste nucleaire positionering binnen myofibers is vereist voor de juiste spier regeneratie en functie. De uniforme procedure te beoordelen myoblast differentiatie en myofiber vorming is afhankelijk van vaste cellen geanalyseerd door immunofluorescentie, die de studie van nucleaire verkeer en cel gedrag na verloop van tijd belemmert. Hier beschrijven we een methode voor de analyse van myoblast differentiatie en myofiber formatie door levende cel imaging. We bieden een software voor geautomatiseerde nucleaire tracking te verkrijgen van een kwantitatieve karakterisering van hoge-doorvoer van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag (dat wil zeggen, het traject) tijdens de differentiatie en fusion.

Als u wilt automatisch volgen nucleaire beweging tijdens myoblast differentiatie in levende imaging, moeten de kernen bij voorkeur worden fluorescently aangeduid. Het is belangrijk op te merken dat met behulp van DNA-intercalating moleculen niet haalbaar is omdat deze moleculen met de proliferatie en differentiatie van primaire myoblasts13 interfereren. Als voorbeeld, hebben de proliferatie en differentiatie in primaire myoblasts gekweekt met of zonder Hoechst (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion

Skeletspieren differentiatie is een uiterst dynamisch proces, die met name gebaseerd op nucleaire positionering is. Hier beschrijven we een methode voor het bijhouden van de bewegingen van de kernen door levende cel imaging tijdens myoblast differentiatie en myotube vorming en voor het uitvoeren van een kwantitatieve karakterisering van de dynamiek van de kernen door het extraheren van informatie van automatisch bijhouden.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Zonder protocol is het mogelijk om het dynamische proces van myoblast differentiatie en myofibervorming te onderzoeken, met name nucleaire positionering door gebruik te maken van live celbeeldvorming. Live celbeeldvorming van myoblast met vreemde celkernen maken de studie van myoblast differentiatie in levende cellen en de automatische tracking van de kernen mogelijk. Visuele demonstratie helpt bij het begrijpen hoe primaire celisolatie te combineren met live imaging en imaging analyse.Het aantonen van de procedure met Frederica Colombo, zal Giorga Careccia, een promovendus in ons laboratorium. Begin met het oogsten van de tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps, en triceps spieren van beide achterste ledematen van een volwassen muis in een petrischaaltje van PBS op ijs. Gebruik steriele schaar en pincet om zorgvuldig te verwijderen van de pezen en vet uit elke spier en de overdracht van de spieren in een lege petrischaal.Met behulp van steriele gebogen schaar knippen en gehakt van de spieren tot een uniforme massa is verkregen en de overdracht van de spierstukken naar een 50 milliliter buis. Voeg vervolgens 10 milliliter spijsverteringsmedium toe aan de spierstukken voor een incubatie van 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius bij 250 rotaties per minuut. Aan het einde van de enzymatische spijsvertering, stop de reactie met 10 milliliter blokkeermedium.En draai het monster door centrifugatie. Zet de buis op ijs en breng de supernatant in een nieuwe 50 milliliter buis. Centrifuge de supernatant weer.En de pellet opnieuw op te schorten in een millimeter DMEM. Vul het aan met tien procent foetaal runderserum, of FBS, op ijs. Verteren de gereserveerde pellet in 10 milliliter vers spijsvertering medium zoals net aangetoond en combineer de verteerd pellet met de reserve cel suspensie, op ijs.Zeef de getrokken cellen door een filter van 70 micrometer, gevolgd door een filter van 40 micrometer. En was de cellen in 15 millimeter verse DMEM, aangevuld met 10 procent FBS. Aan het einde van de centrifugatie, opnieuw opschorten de pellet in drie milliliter van rode bloedcel lyse buffer bij kamertemperatuur.Het stoppen van de lysis na vijf minuten met 40 milliliter PBS en een extra centrifugatie. Stel de pellet opnieuw op in 20 milliliter DMEM aangevuld met 10 procent FBS en pre-plate de cellen in ongecoat petrischaal. Na een uur op 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide verzamelen de satellietcel met supernatant.En pre-plate de cel suspensie nog twee keer zoals aangetoond. Na de laatste beplating, verzamel de satellietcellen door centrifugatie en opnieuw op te schorten de pellet in 40 milliliter van verse proliferatie medium. De splitsing van de cellen tussen twee collageen gecoate 150 milliliter Petri gerechten met een microgram per milliliter doxycycline per schotel te induceren H2BGFP expressie.En breng de cellen terug naar de celkweek incubator voor twee of drie dagen. Wanneer de myoblasten de juiste experimentele dichtheid hebben bereikt, was de cellen in elk gerecht met vijf milliliter PBS en maak de cellen vijf minuten los van de plaatbodems met twee milliliters Trypsin per schaal bij 37 graden Celsius. Bevestig loslating door lichte microscopie en stop de reactie met vijf milliliter DMEM plus tien procent FBS per plaat.Voor live cel beeldvorming, plaat twee keer tien tot de vijfde cellen in elke put van een 12 goed plaat bekleed met 350 microliters van differentiatie medium, aangevuld met kelder membraan matrix per put voor twee uur. Wanneer de cellen zich aan de onderkant van de plaat hebben gehouden, plaatst u de plaat in een 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide incubator op een confocale microscoopfase en gebruik een 20 keer droog doel om gezichtsvelden te verkrijgen met honderden cellen om 16-bits beelden te verwerven met 1024 bij 1024 pixels per frame elke zes minuten gedurende 16 uur. Voor elke verworven positie genereert u een multi frame dot tif-bestand en download en extrahert u de dot zip-software in een geselecteerde map.Open het voorbeeld van de map segmentatietracking en klik op segmentatiepunt M doen om het opdrachtvenster in Matlab te openen. Wijzig de due segmentatie dot M-scripts, zodat het variabele bestandsnaamspoor de naam is van het tif-bestands- en padinvoerspoor de map waarin de punttif is opgenomen. Klik op uitvoeren om het script uit te voeren.Het resultaat van de segmentatie wordt opgeslagen als een file dot mat, terwijl de segmentatie van de kernen kan worden gevisualiseerd in de uitvoer figuur. Als u de tracks wilt genereren, genereert u eerst met dubbele klik tracks dot M in dezelfde werkmap. Wijzig vervolgens de bestandsnaam in bestandsnaam punt het juiste puntmatbestand voor de gesegmenteerde kernen.Klik op Uitvoeren om het script uit te voeren. Het resultaat van de tracking wordt opgeslagen als een ander dot mat-bestand en de gegenereerde tracks worden uitgezet. Om de kwaliteit van de sporen te evalueren.Klik eerst op de controletrackingpunt M en wijzig de bestandsnaam naar de juiste naam dot tif. Klik vervolgens op het spoor van bestandsnaam om het puntmatbestand van de tracks te gebruiken en klik op uitvoeren. Gebruik in het figuurvenster de onderste schuifbalk om de kern te selecteren.De geselecteerde kern wordt in het rood omcirkeld en de baan van de geselecteerde cel kan op tijd worden gevolgd met behulp van de bovenste schuifbalk. Groene kruizen geven de gedetecteerde kernen aan. Proliferatie en differentiatie zijn sterk aangetast in myoblasts gekweekt met Hoechst.Vergeleken met myoblast's geïsoleerd van H2BGFP muizen en gekweekt met doxycycline of wild type, myosin zware keten gelabeld myoblasts. Live celbeeldvorming met primaire myoblasten die het H2BGFP-eiwit uitdrukken, maakt het mogelijk om de kernen tijdens differentiatie te volgen. Samengevoegde beelden van transmissie in GFP-kanalen op de eerste en laatste tijdstippen van de differentiatieperiode, maken de identificatie van myotubes en dus kernen mogelijk die uiteindelijk integreren in myotubes of die niet samensmelten in myobuizen.Na beeldvorming door confocale fluorescentiemicroscopie, kunnen de kernen worden gesegmenteerd zoals aangetoond en kan de keerpunttransformatie worden gebruikt om nabijgelegen objecten te scheiden. Met deze aanpak worden de meeste kernen in het beeld geïdentificeerd, waardoor de kernbeweging kan worden gevolgd zoals aangetoond. Zo blijkt bijvoorbeeld dat de totale lengte van de trajecten iets hoger is voor cellen die met Hoechst zijn gekleurd.Hoewel het verschil niet significant is. Echter, berekening van de totale verplaatsing tijdens een time lapse blijkt dat de totale verplaatsing van de cellen bevlekt met Hoechst is aanzienlijk kleiner dan die van niet-gekleurde cellen. Zoals voorspeld is de totale jaarlijkse variatie voor de niet-gekleurde cellen aanzienlijk kleiner in vergelijking met cellen bevlekt met Hoechst.Het is belangrijk om het protocol precies te volgen zoals aangetoond in het bijzonder bij het combineren van de technische vaardigheden van de biologische stappen met de confocale microscoop en software gebruikte stappen. Om myoblast differentiatie en nucleaire positionering te bestuderen in een ander spiermodel van belang is het mogelijk om geïsoleerde myoblast over te dragen met fluorescerend nucleair eiwit. Deze techniek maakte de weg vrij om cellulaire en nucleaire dynamiek tijdens spierdifferentiatie te verkennen en defecten in deze processen verder te onderzoeken.Onder verschillende pathologische aandoeningen zoals spierdystrofies.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Het bepalen van de bijdrage van de Energy Systems tijdens de training

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...