Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’AFM-Telethon e.v. (#21545) et par la subvention de démarrage de Ospedale San Raffaele (OSR) à S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez du moyeu de l’analyse d’Image de l’Institut Pasteur est reconnue pour partager publiquement ses routines MATLAB « Simple Tracker ».

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de San Raffaele Institutional Animal Care.
1. la dissection des muscles postérieurs de la souris
<ol><li>Stériliser les pinces et ciseaux (à la fois droites et courbes) à l’autoclave.</li>
	<li>Préparer et filtrer (0,22 µm) tous les médias (blocage moyen, moyen de digestion, prolifèrent moyen et moyen de différencier) avant de commencer l’expérience (voir Table des...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées qui sont formées par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivée de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation2,3, 4. Afin d’évaluer la différenciation des myoblastes, la procédure commune consiste en cultivant des myoblastes au moyen de différenciation et de...

Le muscle squelettique est un tissu plus grand dans le corps humain, pour un total de 35-40 % de la masse de corps1. Cellules satellites sont des cellules souches musculaires, caractérisées anatomiquement par leur position (juxtaposée à la membrane plasmique, sous la couche basale des fibres musculaires), qui donnent lieu à la prolifération de myoblastes (progéniteurs myogéniques), qui finit par différencier et intégrer les myofibres existants et/ou fondre à forme nouvelle myofibres2,3,4. Leur découverte et les progrès dans l’étude de leur biologie a conduit à un aperçu significatif de développement musculaire et la régénération.
Protocoles d’isoler et de se différencier de myoblastes en myotubes ont été mis au point il y a de nombreuses années et sont encore largement utilisés pour étudier les muscles squelettiques différenciation5,6,7. Cependant, la plupart de ces méthodes représente les procédures statiques qui reposent sur l’analyse des cellules fixées et, par conséquent, ne permettent pas de scientifiques pour explorer pleinement les processus hautement dynamiques, telles que la fusion des myoblastes et de la maturation de la fibre musculaire. L’exemple le plus frappant est le positionnement nucléaire, qui est étroitement contrôlée, avec des noyaux au départ dans le centre de la fibre musculaire et, ensuite, situé à la périphérie après la fibre musculaire maturation8,9. L’imagerie Live est la technique la plus appropriée pour obtenir de plus amples aperçus de ce phénomène étrange.
Nous décrivons ici une méthode qui permet aux scientifiques d’enregistrer des myoblastes différenciation et myotubes formation en time-lapse microscopie et pour effectuer des analyses quantitatives de la poursuite automatique des noyaux de myoblastes. Cette méthode fournit une caractérisation quantitative de haut débit de comportement dynamique et de myoblastes nucléaire au cours de la différenciation et la fusion. Le protocole est divisé en quatre parties différentes, à savoir (1) la collection des muscles des membres postérieurs des souris, (2) l’isolement des myoblastes primaires qui consiste dans la digestion mécanique et enzymatique, myoblastes (3) la prolifération et la différenciation et (4) vivre d’imagerie pour suivre les noyaux au cours des 16 premières heures de la différenciation des myoblastes.
Dans la procédure suivante, les myoblastes sont isolés de souris H2B-GFP et traités avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la GFP-H2B, comme décrit précédemment10. Alternativement, il est possible d’isoler les myoblastes des autres souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans le noyau ou à transfecter les cellules isolées de souris de type sauvage à exprimer une protéine fluorescente dans le noyau, tel que décrit par Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Un positionnement nucléaire au sein de cellules est important pour plusieurs processus cellulaires dans le développement et la régénération. L’exemple plus intrigant de positionnement nucléaire se produit au cours de la différenciation musculaire squelettique. Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées formés par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivés de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation. Bon positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et la fonction. La procédure uniforme pour évaluer la formation la différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes s’appuie sur les cellules fixes analysés par immunofluorescence, qui fait obstacle à l’étude du comportement de mouvement et de la cellule nucléaire au fil du temps. Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de formation de différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes par imagerie de cellules vivantes. Nous fournissons un logiciel pour un suivi automatisé nucléaire afin d’obtenir une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et le comportement de myoblastes (c.-à-d., la trajectoire) au cours de la différenciation et la fusion.

Pour suivre automatiquement les mouvement nucléaire au cours de la différenciation des myoblastes en imagerie live, les noyaux doivent préférentiellement être fluorescent étiquetés. Il est important de noter que l’à l’aide de molécules d’ADN-intercalation n’est pas possible car ces molécules interfèrent avec la prolifération et la différenciation des myoblastes primaires13. À titre d’exemple, la prolifération et la différenciation ont ét?...

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Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Sans protocole, il est possible d’étudier le processus dynamique de différenciation du myoblaste et de formation du myofiber, en particulier le positionnement nucléaire en exploitant l’imagerie cellulaire vivante. L’imagerie cellulaire vivante du myoblaste avec des noyaux cellulaires étrangers permet l’étude de la différenciation du myoblaste dans les cellules vivantes et le suivi automatique des noyaux. La démonstration visuelle aide à comprendre comment combiner l’isolement des cellules primaires avec l’imagerie en direct et l’analyse d’imagerie.Giorga Careccia, doctorante dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec Frederica Colombo. Commencez par récolter les muscles tibialis soleus, extenseur digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps et triceps des deux membres postérieurs d’une souris adulte dans une boîte de Pétri de PBS sur glace. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces à épiler pour enlever soigneusement les tendons et la graisse de chaque muscle et transférer les muscles dans une boîte de Pétri vide.À l’aide de ciseaux incurvés stériles, coupez et hachez les muscles jusqu’à ce qu’une masse uniforme soit obtenue et transférez les morceaux musculaires dans un tube de 50 millilitres. Ajouter ensuite 10 millilitres de milieu de digestion aux morceaux musculaires pour une incubation de 30 minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius à 250 rotations par minute. À la fin de la digestion enzymatique, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de blocage.Et faites tourner l’échantillon par centrifugation. Placez le tube sur la glace et transférez le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres. Centrifugez à nouveau le surnatant.Et re-suspendre la pastille dans un millimètre de DMEM. Complétz-le avec dix pour cent de sérum bovin fœtal, ou FBS, sur la glace. Digérer la pastille réservée en 10 millilitres de milieu de digestion frais comme vient de le démontrer et combiner la pastille digérée avec la suspension cellulaire de réserve, sur la glace.Filtrer les cellules tirées à travers un filtre de 70 micromètres, suivi d’un filtre de 40 micromètres. Et laver les cellules en 15 millimètres de DMEM frais, complété par 10 pour cent FBS. À la fin de la centrifugation, suspendre à nouveau la pastille en trois millilitres de tampon de lyse de globule rouge à température ambiante.Arrêt de la lyse après cinq minutes avec 40 millilitres de PBS et une centrifugation supplémentaire. Suspendre à nouveau la pastille en 20 millilitres de DMEM complétée par 10 pour cent de FBS et pré-plaquer les cellules dans la boîte de Pétri non encoated. Après une heure à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone recueillir la cellule satellite contenant supernatant.Et pré-plaque de la suspension cellulaire deux fois de plus comme démontré. Après le dernier placage, recueillir les cellules satellites par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en 40 millilitres de milieu de prolifération frais. La division des cellules entre deux boîtes de Pétri enduites de collagène de 150 millilitres avec un microgramme par millilitre de doxycycline par plat pour induire l’expression H2BGFP.Et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant deux ou trois jours. Lorsque les myoblastes ont atteint la densité expérimentale appropriée, laver les cellules dans chaque plat avec cinq millilitres de PBS et détacher les cellules du fond de la plaque avec deux millilitres de trypsine par plat à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Confirmez le détachement par microscopie légère et arrêtez la réaction avec cinq millilitres de DMEM plus dix pour cent de FBS par plaque.Pour l’imagerie cellulaire vivante, plaquez deux fois dix à la cinquième cellule dans chaque puits d’une plaque de puits de 12 recouverte de 350 microlitres de milieu de différenciation, complétée par matrice membranaire du sous-sol par puits pendant deux heures. Lorsque les cellules ont adhéré au fond de la plaque, placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de cinq pour cent sur un stade de microscope confocal et utilisez un objectif 20 fois sec pour obtenir des champs de vue avec des centaines de cellules pour acquérir 16 images bits avec 1024 par 1024 pixels par image toutes les six minutes pendant 16 heures. Pour chaque position acquise, générer un fichier tif point multi-images et télécharger et extraire le logiciel zip point fourni dans un dossier sélectionné.Ouvrez l’exemple du dossier de suivi de segmentation et cliquez sur do segmentation dot M pour ouvrir la fenêtre de commande dans Matlab. Modifiez les scripts M point de segmentation dus de sorte que la piste de nom de fichier variable soit le nom du fichier tif et la piste d’entrée de chemin est le dossier où le tif de point est contenu. Cliquez sur exécuter le script.Le résultat de la segmentation sera enregistré sous forme de tapis à points de fichier, tandis que la segmentation des noyaux peut être visualisée dans la figure de sortie. Pour générer les pistes, premier double clic générer des pistes point M dans le même dossier de travail. Ensuite, changez le nom du fichier pour le point de nom du fichier mat point approprié pour les noyaux segmentés.Cliquez sur Exécuter pour exécuter le script. Le résultat du suivi sera enregistré sous forme d’un autre fichier de tapis à points et les pistes générées seront tracées. Évaluer la qualité des pistes.Cliquez d’abord sur le point de suivi de vérification M et modifiez le nom du fichier au nom de tif point approprié. Cliquez ensuite sur la piste de nom du fichier pour utiliser le fichier de tapis à points des pistes et cliquez sur exécuter. Dans la fenêtre de figure, utilisez la barre de défilement inférieure pour sélectionner le noyau.Le noyau sélectionné sera encerclé en rouge, et la trajectoire de la cellule sélectionnée peut être suivie dans le temps à l’aide de la barre supérieure de défilement. Les croix vertes indiquent les noyaux détectés. La prolifération et la différenciation sont fortement altérées dans les myoblastes cultivés avec Hoechst.Comparé à myoblast’s isolé des souris de H2BGFP et cultivé avec la doxycycline ou le type sauvage, myosin chaîne lourde étiquetée myoblastes. L’imagerie cellulaire vivante avec des myoblastes primaires exprimant la protéine H2BGFP permet le suivi des noyaux lors de la différenciation. Les images fusionnées de transmission dans les canaux GFP aux points de temps initiaux et finaux de la période de différenciation permettent l’identification des myotubes et, par conséquent, des noyaux qui finissent par s’intégrer dans les myotubes ou qui ne fusionnent pas dans les myotubes.Après imagerie par microscopie de fluorescence confocale, les noyaux peuvent être segmentés comme démontré et la transformation du bassin versant peut être utilisée pour séparer les objets voisins. Avec cette approche, la plupart des noyaux sont identifiés dans l’image, permettant au mouvement des noyaux d’être suivi comme démontré. Par exemple, il semble que la longueur totale des trajectoires soit légèrement plus élevée pour les cellules tachées de Hoechst.Bien que la différence n’est pas significative. Cependant, le calcul du déplacement total pendant un laps de temps révèle que le déplacement total des cellules tachées de Hoechst est significativement plus petit que celui des cellules non tachées. Comme prévu, la variation annuelle totale pour les cellules non tachées est significativement plus faible par rapport aux cellules tachées de Hoechst.Il est important de suivre le protocole exactement comme démontré en particulier lors de la combinaison des compétences techniques à partir des étapes biologiques avec le microscope confocal et le logiciel utilisé étapes. Pour étudier la différenciation du myoblaste et le positionnement nucléaire dans un autre modèle musculaire d’intérêt, il est possible de transférer le myoblaste isolé avec des protéines nucléaires fluorescentes. Cette technique a ouvert la voie à l’exploration de la dynamique cellulaire et nucléaire lors de la différenciation musculaire et à l’étude des défauts de ce processus.Dans diverses conditions pathologiques telles que les dystrophies musculaires.

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One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...