Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי AFM-מופע ההתרמה כדי E.V. (#21545) ועל ידי המענק זרע Ospedale סן רפאלה (OSR) כדי ש ז (ZAMBRA5X1000). ד ר ז'אן-איב Tinevez מהרכזת ניתוח תמונה של מכון פסטר הוא הודה לשיתוף פומבי הרגלים "פשוטה אירועי הכיבוי" MATLAB.

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי סן רפאלה אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.
1. ניתוח של השרירים hindlimb העכבר
<ol><li>לחטא פינצטה ומספריים (שני ישרים ועקומים) על ידי autoclaving.</li>
	<li>להכין ולסנן (0.22 מיקרומטר) בכל אמצעי התקשורת (חסימה בינוני, בינוני עיכול, מתרבים בינונ...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול2,3, 4. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן ?...

שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% - 40% של מסת גוף1. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.
פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בידול5,6,7. עם זאת, רוב השיטות האלה מייצגים סטטי שגרות אשר מסתמכים על הניתוח של תאים קבוע, כתוצאה מכך, תאפשר למדענים לחקור תהליכים מאוד דינמי, כגון myoblast פיוז'ן וההתבגרות myofiber באופן מלא. הדוגמה הבולט ביותר היא מיקום הגרעין, אשר הוא, עם גרעינים בתחילה במרכז myofiber, והיא, לאחר מכן, הממוקמים בפריפריה אחרי myofiber ההבשלה8,9. הדמיה חיה היא הטכניקה המתאימה ביותר כדי להשיג עוד תובנות תופעה מוזרה שכזו.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים להקליט בידול myoblast היווצרות myotube על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות, כדי לבצע ניתוח כמותי החל מעקב אוטומטי של גרעינים myoblast. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה כמותיים אפיון של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast במהלך התמיינות ופיוז'ן. הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים שונים, כלומר (1) אוסף של השרירים hindlimbs של עכברים, (2) בידודו של ראשי myoblasts המורכבת עיכול אנזימטי ועל מכניים, התפשטות (3) myoblast, בידול ו (4) חיים הדמיה כדי לעקוב אחר גרעינים בתוך ה 16 הראשונה של בידול myoblast.
בהליך הבא, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים, שטופלו µg 1/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP, כפי שתואר קודם לכן10. לחלופין, זה אפשרי כדי לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר על ידי פימנטל ואח. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז'ן.

לעקוב באופן אוטומטי של גרעיני התנועה במהלך התמיינות myoblast בתחום ההדמיה בשידור חי, הגרעינים יש מעדיפים fluorescently לתייג. חשוב לציין כי באמצעות מולקולות DNA-intercalating הוא לא ריאלי כי מולקולות אלה להפריע התפשטות ובידול של ראשי myoblasts13. לדוגמה, התפשטות ובידול יש כבר ניתח?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

ללא פרוטוקול, ניתן לחקור את התהליך הדינמי של ההתברות myoblast ואת היווצרות myofiber, במיוחד מיקום גרעיני על ידי ניצול הדמיה של תאים חיים. הדמיית תאים חיים של מיובלסט עם גרעיני תאים זרים מאפשרת לחקור את ההתבוללות myoblast בתאים חיים ואת המעקב האוטומטי של הגרעינים. הדגמה חזותית מסייעת בהבנה כיצד לשלב בידוד תאים ראשי עם הדמיה חיה וניתוח הדמיה.הדגמת ההליך עם פרדריקה קולומבו, תהיה ג'ורגה קרצ'יה, דוקטורנט במעבדה שלנו. התחל על ידי קצירת סוליוס tibialis, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps, ואת שרירי תלת ראשי משני הגפיים האחוריות של עכבר בוגר לתוך צלחת פטרי של PBS על קרח. השתמש מספריים סטריליים פינצטה להסיר בזהירות את הגידים והשומן מכל שריר ולהעביר את השרירים לתוך צלחת פטרי ריקה.באמצעות מספריים מעוקל סטרילי לחתוך טחון השרירים עד מסה אחידה מתקבלת ולהעביר את חתיכות השריר לצינור 50 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר של עיכול בינוני לחתיכות השריר עבור דגירה 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 250 סיבובים לדקה. בסוף העיכול האנזימטי, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום חסימה.ולסובב את הדגימה על ידי צנטריפוגה. מניחים את הצינור על קרח ומעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 50 מיליליטר. צנטריפוגה העל-טבעית שוב.ולהשעות מחדש את גלולה במילימטר אחד של DMEM. להשלים אותו עם עשרה אחוזים סרום בקר עוברי, או FBS, על קרח. לעכל את גלולה שמורות 10 מיליליטר של מדיום עיכול טרי כפי שהוכח רק ולשלב את גלולה מתעכל עם ההשעיה תא מילואים, על קרח.מסננים את התאים שנמשכו דרך מסנן 70 מיקרומטר, ואחריו מסנן 40 מיקרומטר. ולשטוף את התאים ב 15 מילימטרים של DMEM טרי, בתוספת 10 אחוז FBS. בסוף הצנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום בטמפרטורת החדר.עצירת תמוגה לאחר חמש דקות עם 40 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה נוספת. להשעות מחדש את גלולה ב 20 מיליליטר של DMEM בתוספת 10 אחוז FBS מראש צלחת התאים בצלחת פטרי מצופה. לאחר שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני לאסוף את תא הלווין המכיל על טבעי.ו pre-plate ההשעיה התא פעמיים נוספות כפי שהודגם. לאחר הציפוי האחרון, לאסוף את תאי הלוויין על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב 40 מיליליטר של מדיום התפשטות טרי. לפצל את התאים בין שני קולגן מצופה 150 מיליליטר צלחות פטרי עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין לכל מנה כדי לגרום לביטוי H2BGFP.ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבות התא במשך יומיים או שלושה. כאשר myoblasts הגיעו לצפיפות הניסוי המתאימה, לשטוף את התאים בכל מנה עם חמישה מיליליטר של PBS ולנתק את התאים מתחתית הצלחת עם שני מיליליטר של טריפסין למנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אשר ניתוק על ידי מיקרוסקופ אור ולעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של DMEM ועוד עשרה אחוז FBS לכל צלחת.להדמיית תאים חיים, צלחת פעמיים עשר לתאים החמישיים לתוך כל באר של 12 צלחת גם מצופה 350 microliters של מדיום בידול, בתוספת מטריצת קרום מרתף ל הבאר במשך שעתיים. כאשר התאים דבקו בחלק התחתון של הצלחת, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני אינקובטור על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי ולהשתמש במטרה יבשה 20 פעמים כדי להשיג שדות תצוגה עם מאות תאים לרכוש תמונות 16 סיביות עם 1024 על ידי 1024 פיקסלים למסגרת כל שש דקות במשך 16 שעות. עבור כל מיקום שנרכש, ליצור קובץ tif נקודה מסגרת מרובה ולהוריד ולחלץ את תוכנת zip נקודה המסופקת בתיקיה שנבחרה.פתח את הדוגמה של תיקיית מעקב אחר פילוח ולחץ על בצע פילוח נקודה M כדי לפתוח את חלון הפקודה ב- Matlab. שנה את קבצי ה- Script של נקודה M של פילוח התשלום כך שהרצועה של שם קובץ המשתנה היא שם קובץ ה- tif ומסלול הקלט של הנתיב היא התיקיה שבה ה- dot tif כלול. לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script.תוצאת הפילוח תישמר כמחצלת נקודה של קובץ, בעוד שניתן יהיה לדמיין את פילוח הגרעינים בנתון הפלט. כדי ליצור את הרצועות, לחץ תחילה פעמיים על צור רצועות נקודה M באותה תיקיית עבודה. לאחר מכן, שנה את שם הקובץ לנקודת שם הקובץ את קובץ הנקודה Mat המתאים עבור הגרעינים המקטעים.לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script. תוצאת המעקב תישמר כקובץ מחצלת נקודה אחר והרצועות שנוצרו יתוותו. כדי להעריך את איכות הרצועות.תחילה לחץ פעמיים על סימן המעקב אחר שיק M ושנה את שם הקובץ לשם tif המתאים. לאחר מכן לחץ על רצועת שם קובץ כדי להשתמש בקובץ מחצלת הנקודות של הרצועות ולחץ על הפעל. בחלון הדמות השתמש בפס הגלילה התחתון כדי לבחור בגרעין.הגרעין שנבחר יהיה מוקף בעיגול באדום, ואת המסלול של התא הנבחר ניתן לעקוב בזמן באמצעות פס הגלילה העליון. צלבים ירוקים מצביעים על הגרעינים שזוהו. התפשטות והתמדה נפגעים מאוד ב myoblasts מתורבת עם Hoechst.בהשוואה למיובלסט המבודד מעכברי H2BGFP ומתורבת עם דוקסיציקלין או סוג פראי, מיוסין שרשרת כבדה שכותרתו myoblasts. הדמיה של תאים חיים עם מיובלסטים ראשוניים המבטאת את חלבון H2BGFP מאפשרת מעקב אחר הגרעינים במהלך ההידול. תמונות ממוזגות של שידור בערוצי GFP בנקודות הזמן הראשוניות והסופיות של תקופת ההידול, מאפשרות זיהוי של מיוטובים וכתוצאה מכך גרעינים שבסופו של דבר משתלבים במיאוטובות או שלא מתמזגים לתוך מיוטובים.לאחר הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית, ניתן לקטע את הגרעינים כפי שהוכח והפיכת קו פרשת המים יכולה לשמש להפרדת עצמים סמוכים. בגישה זו, רוב הגרעינים מזוהים בתמונה, ומאפשרים מעקב אחר תנועת הגרעינים כפי שהוכח. לדוגמה, נראה כי האורך הכולל של המסלולים הוא מעט גבוה יותר עבור תאים מוכתמים Hoechst.למרות שההבדל אינו משמעותי. עם זאת, חישוב של התזוזה הכוללת במהלך זמן לשגות מגלה כי התזוזה הכוללת של התאים מוכתמים Hoechst הוא קטן באופן משמעותי מזה של תאים נגועים. כפי שחזו את השונות השנתית הכוללת עבור התאים שאינם נגועים הוא קטן באופן משמעותי בהשוואה לתאים מוכתמים עם Hoechst.חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול בדיוק כפי שהוכח במיוחד כאשר משלבים את הכישורים הטכניים מהשלבים הביולוגיים עם מיקרוסקופ קונפוקל ותוכנה בשימוש בשלבים. כדי ללמוד את ההתברמות myoblast ומיצוב גרעיני במודל שריר אחר של עניין ניתן להעביר מיובלסט מבודד עם חלבון גרעיני פלואורסצנטי. טכניקה זו סללה את הדרך לחקור את הדינמיקה התאית והגרעין במהלך דידול שרירים ולחקור עוד יותר פגמים בתהליכים אלה.בתנאים פתולוגיים שונים כגון דיסטרופות שרירים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

לקבוע את התרומה של מערכות אנרגיה במהלך פעילות גופנית

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...