Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da AFM-Telethon a E.V. (#21545) e con la concessione di seme di Ospedale San Raffaele (OSR) a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez dall'Hub di analisi di immagine dell'Institut Pasteur è riconosciuto per condividere pubblicamente la sua routine MATLAB "Semplice Tracker".

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di uso e San Raffaele istituzionale Animal Care.
1. dissezione dei muscoli hindlimb del mouse
<ol><li>Sterilizzare in autoclave pinzette e forbici (sia dritti e curve).</li>
	<li>Preparare e filtro (0,22 µm) tutti i media (blocco medio, digestione medio, medio di proliferazione e differenziazione medio) prima di iniziare l'esperimento (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Mettere 5 mL di tam...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Fibre muscolari (myofibers) sono multinucleate che si formano dalla fusione di cellule precursori muscolari (mioblasti) derivata da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione2,3, 4. Per valutare stimola il differenziamento, la procedura comune consiste di coltura mioblasti in differenziando le medie e fissare le cellule in diversi momenti per eseguire immunofluorescen...

Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo umano, per un totale di 35% - 40% della massa del corpo1. Le cellule satelliti sono cellule staminali del muscolo, anatomicamente caratterizzate dalla loro posizione (giustapposti alla membrana del plasma, sotto la lamina basale delle fibre muscolari), che danno origine ai mioblasti proliferanti (cellule progenitrici miogenico), che alla fine differenziare e integrare nelle miofibre esistenti e/o fusibile per formare nuove miofibre2,3,4. La loro scoperta e i progressi nello studio della loro biologia ha portato a significativi approfondimenti lo sviluppo muscolare e la rigenerazione.
Protocolli per isolare e differenziare i mioblasti in miotubi sono stati sviluppati molti anni fa e sono ancora ampiamente utilizzati per lo studio del muscolo scheletrico differenziazione5,6,7. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi rappresentano procedure statiche che si basano sull'analisi delle celle fisse e, di conseguenza, non consentono agli scienziati di esplorare pienamente processi altamente dinamici, come fusione dei mioblasti e maturazione miofibre. L'esempio più eclatante è il posizionamento del nucleare, che è strettamente regolata, con nuclei inizialmente nel centro della myofiber e, quindi, situata alla periferia dopo miofibre maturazione8,9. La formazione immagine dal vivo è la tecnica più appropriata per ottenere ulteriori approfondimenti tale fenomeno peculiare.
Qui, descriviamo un metodo che consente agli scienziati di registrare dei mioblasti differenziazione e miotubi formazione da microscopia time-lapse e per eseguire analisi quantitative dall'inseguimento automatico dei nuclei dei mioblasti. Questo metodo fornisce una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle nucleare dinamiche e dei mioblasti comportamento durante la differenziazione e la fusione. Il protocollo è diviso in quattro parti, vale a dire (1) l'insieme di muscoli dalle zampe posteriori di topi, (2) l'isolamento di mioblasti primari che consiste nella digestione meccanica ed enzimatica, (3) dei mioblasti proliferazione e differenziazione e (4) live imaging per tenere traccia di nuclei all'interno le prime 16 ore di differenziamento dei mioblasti.
Nella procedura seguente, mioblasti sono isolate da topi H2B-GFP e trattati con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l'espressione di H2B-GFP, come descritto in precedenza10. In alternativa, è possibile isolare i mioblasti da altri topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente nel nucleo o a transfect le cellule isolate da topi wild-type per esprimere una proteina fluorescente nel nucleo, come descritto da Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Nucleare di posizionamento all'interno delle cellule è importante per molteplici processi cellulari, nello sviluppo e rigenerazione. L'esempio più intrigante di posizionamento nucleare si verifica durante la differenziazione del muscolo scheletrico. Fibre muscolari (myofibers) sono cellule multinucleated formate dalla fusione delle cellule del precursore di muscolo (mioblasti) derivati da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione. Corretto posizionamento nucleare all'interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguata e la funzione. La procedura comune per valutare la formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti si basa su celle fisse analizzate mediante immunofluorescenza, che ostacola lo studio del comportamento delle cellule e del movimento nucleare nel corso del tempo. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi della formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive. Mettiamo a disposizione un software per il rilevamento automatizzato ottenere una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle dinamiche nucleare e comportamento dei mioblasti (vale a dire, la traiettoria) durante la differenziazione e la fusione nucleare.

Per seguire automaticamente movimento nucleare durante la differenziazione dei mioblasti in vivo imaging, i nuclei fluorescente preferenzialmente devono essere etichettati. È importante notare che utilizzando molecole intercalanti del DNA non è fattibile perché queste molecole interferiscono con la proliferazione e la differenziazione di mioblasti primari13. Ad esempio, proliferazione e differenziazione sono state analizzate in mioblasti primari coltivate con o ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Senza protocollo, è possibile indagare il processo dinamico di differenziazione dei mioblasti e di formazione della miofibra, in particolare il posizionamento nucleare sfruttando l'imaging a cellule vive. L'imaging a cellule vive di mioblasto con nuclei cellulari estranei consente lo studio della differenziazione dei mioblasti nelle cellule viventi e il tracciamento automatico dei nuclei. La dimostrazione visiva aiuta a capire come combinare l'isolamento delle cellule primarie con l'imaging dal vivo e l'analisi dell'imaging.A dimostrare la procedura con Frederica Colombo, sarà Giorga Careccia, dottoranda nel nostro laboratorio. Inizia raccogliendo i muscoli tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadricipite e tricipiti da entrambi gli arti posteriori di un topo adulto in una piastra di Petri di PBS sul ghiaccio. Utilizzare forbici sterili e pinzette per rimuovere con cura i tendini e il grasso da ogni muscolo e trasferire i muscoli in una piastra di Petri vuota.Utilizzando forbici curve sterili tagliare e tritare i muscoli fino a ottenere una massa uniforme e trasferire i pezzi muscolari in un tubo da 50 millilitri. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di digestione ai pezzi muscolari per un'incubazione di 30 minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius a 250 rotazioni al minuto. Alla fine della digestione enzimatica, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di blocco.E spin giù il campione per centrifugazione. Posizionare il tubo sul ghiaccio e trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 50 millilitri. Centrifuga di nuovo il supernatante.E sospendere di nuovo il pellet in un millimetro di DMEM. Completalo con il dieci per cento di siero bovino fetale, o FBS, sul ghiaccio. Digerire il pellet riservato in 10 millilitri di mezzo di digestione fresco come appena dimostrato e combinare il pellet digerito con la sospensione della cella di riserva, sul ghiaccio.Filtrare le cellule estratte attraverso un filtro da 70 micrometri, seguito da un filtro da 40 micrometri. E lavare le cellule in 15 millimetri di DMEM fresco, integrato con fbs al 10%. Al termine della centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi a temperatura ambiente.Fermare la llisi dopo cinque minuti con 40 millilitri di PBS e un'ulteriore centrifugazione. Sospendere nuovamente il pellet in 20 millilitri di DMEM integrati con FBS al 10% e pre-placcare le celle in una piastra di Petri non patinato. Dopo un'ora a 37 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica raccolgono la cellula satellitare contenente supernatante.E pre-piastra la sospensione cellulare altre due volte come dimostrato. Dopo l'ultima placcatura, raccogliere le cellule satellitari per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di mezzo di proliferazione fresco. La divisione delle cellule tra due piastre petri rivestite di collagene da 150 millilitri con un microgrammo per millilitro di doxiciclina per piatto per indurre l'espressione di H2BGFP.E riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per due o tre giorni. Quando i mioblasti hanno raggiunto l'appropriata densità sperimentale, lavare le cellule in ogni piatto con cinque millilitri di PBS e staccare le cellule dai fondi della piastra con due millilitri di triptina per piatto a 37 gradi celsius per cinque minuti. Confermare il distacco tramite microscopia ottica e interrompere la reazione con cinque millilitri di DMEM più il dieci per cento fbs per piastra.Per l'imaging di cellule vive, la piastra due volte dieci alla quinta cella in ogni pozzo di una piastra di 12 pozzaggi rivestita con 350 microlitri di mezzo di differenziazione, integrata con matrice di membrana basale per pozzo per due ore. Quando le cellule hanno aderito alla parte inferiore della piastra, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e cinque per cento su uno stadio di microscopio confocale e utilizzare un obiettivo 20 volte asciutto per ottenere campi visivo con centinaia di celle per acquisire immagini a 16 bit con 1024 per 1024 pixel per fotogramma ogni sei minuti per 16 ore. Per ogni posizione acquisita, generare un file tif a punti multi frame e scaricare ed estrarre il software dot zip fornito in una cartella selezionata.Aprite l'esempio della cartella di rilevamento della segmentazione e fate clic su do segmentation dot M per aprire la finestra di comando in Matlab. Modificare gli script dot M di segmentazione dovuti in modo che la traccia del nome file variabile sia il nome del file tif e la traccia di input del percorso sia la cartella in cui è contenuto il punto tif. Fare clic su Esegui per eseguire lo script.Il risultato della segmentazione verrà salvato come un tappetino punto file, mentre la segmentazione dei nuclei può essere visualizzato nella figura di output. Per generare le tracce, fare doppio clic su genera tracce punto M nella stessa cartella di lavoro. Quindi, modificate il nome del file in nome file, puntate il file Mat punto appropriato per i nuclei segmentati.Fare clic su Esegui per eseguire lo script. Il risultato del tracciamento verrà salvato come un altro file di tappetino punto e le tracce generate verranno tracciate. Per valutare la qualità delle tracce.Fare innanzitutto doppio clic sul punto di rilevamento dei controlli M e modificare il nome del file con il nome tif del punto appropriato. Quindi fare clic su traccia nome file per utilizzare il file del tappetino punto delle tracce e fare clic su Esegui. Nella finestra della figura utilizzare la barra di scorrimento inferiore per selezionare il nucleo.Il nucleo selezionato verrà cerchiato in rosso e la traiettoria della cella selezionata può essere seguita nel tempo utilizzando la barra di scorrimento superiore. Le croci verdi indicano i nuclei rilevati. La proliferazione e la differenziazione sono fortemente compromesse nei mioblasti coltivati con Hoechst.Rispetto al mioblasto isolato dai topi H2BGFP e coltivato con doxiciclina o tipo selvatico, miosina pesante catena etichettata mioblasti. L'imaging di cellule vive con mioblasti primari che esprimono la proteina H2BGFP consente il tracciamento dei nuclei durante la differenziazione. Le immagini unite di trasmissione nei canali GFP nei punti iniziali e finali del periodo di differenziazione, consentono l'identificazione di miotubi e di conseguenza nuclei che finiscono per integrarsi in miotubi o che non si fondono in miotubi.Dopo l'imaging mediante microscopia a fluorescenza confocale, i nuclei possono essere segmentati come dimostrato e la trasformata spartiacque può essere utilizzata per separare gli oggetti vicini. Con questo approccio, la maggior parte dei nuclei sono identificati nell'immagine, permettendo al movimento dei nuclei di essere tracciato come dimostrato. Ad esempio, sembra che la lunghezza totale delle traiettorie sia leggermente più alta per le celle macchiate con Hoechst.Anche se la differenza non è significativa. Tuttavia, il calcolo dello spostamento totale durante un time lapse rivela che lo spostamento totale delle celle macchiate di Hoechst è significativamente inferiore a quello delle cellule non macchiate. Come previsto, la variazione annuale totale per le cellule non macchiate è significativamente più piccola rispetto alle cellule macchiate di Hoechst.È importante seguire il protocollo esattamente come dimostrato in particolare quando si combinano le competenze tecniche dei passaggi biologici con il microscopio confocale e il software utilizzato. Per studiare la differenziazione del mioblasto e il posizionamento nucleare in un altro modello muscolare di interesse è possibile trasferire mioblasti isolati con proteine nucleari fluorescenti. Questa tecnica ha spianato la strada all'esplorazione della dinamica cellulare e nucleare durante la differenziazione muscolare e all'ulteriore indagine dei difetti in questi processi.In varie condizioni patologiche come distrofie muscolari.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Ricerca

Biologia

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Determinare il contributo dei sistemi di energia durante l&#39;allenamento

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...