Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

この仕事はあった e. v. (#21545) に AFM テレソンでチェッポ サン ラッファエッレ (OSR) シード権利を与えられた S.Z. (ZAMBRA5X1000) でサポートされています。パスツール研究所の画像解析ハブから博士ジャン = イヴ Tinevez 彼の「単純なトラッカー」MATLAB ルーチンを公開共有するため認められています。

動物を対象とするすべての手順は、サン ラッファエッレ機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. マウスの後肢筋の解剖
<ol><li>ピンセットとはさみ (直線と曲線) をオートクレーブで滅菌します。</li>
	<li>準備し、実験を開始する前にすべてのメディア (ブロック中、消化中、媒体、媒体を区別する) (0.22 μ m) にフィルターを適用 (材料の表...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

筋繊維 (筋線維)、多核巨細胞の細胞増殖と分化の2,3を受ける筋幹細胞 (サテライト細胞) 由来筋前駆細胞 (筋芽細胞) の融合によって形成されます。 4。媒体を区別し、MyHC、分化のマーカーとの染色の染色蛍光抗体法を実行する異なる時点で細胞を固定で筋芽細胞を培養筋芽細胞分化を評価するには、一般的な手順ので構成?...

骨格筋は、本体質量1の 35-40% を合計、人間の体内で最大の組織です。衛星細胞は筋肉細胞、増殖筋芽細胞 (筋前駆細胞) を生じさせる、(細胞膜、筋線維の基底膜下に並べ)、彼らの位置によって特徴付けられる解剖学的結果となった区別するため、既存の筋線維に統合および/またはフォーム新しい筋線維2,3,4ヒューズします。彼らの発見と生物学の研究の進展は、筋肉の発達と再生に重要な洞察力につながっています。
分離し、単に筋芽細胞を分化するプロトコルは何年も前に開発されているおよびまだ広く骨格筋分化5,6,7を調べるために用い。ただし、これらのメソッドのほとんどは、固定細胞の解析に依存し、その結果、筋芽細胞の融合や筋線維の成熟などの非常に動的なプロセスを完全に探検する科学者を許可しない静的なプロシージャを表します。最も顕著な例は、しっかりと規制されており、初期状態で筋線維の中心核と、筋線維の成熟8,9後周辺に位置しを核配置です。ライブ イメージングは、さらに特有の現象についての洞察を取得する最も適切な手法です。
ここでは、科学者タイムラプス顕微鏡による筋芽細胞の分化と筋の形成を記録し、筋芽細胞核の自動追跡から定量的な解析を実行することができる手法について述べる。このメソッドは、分化と融合の中に核ダイナミクスと筋芽細胞挙動の高スループットの定量的な解析を提供します。プロトコルは分かれて 4 つさまざまな部分、すなわち (1) コレクション (2) マウスの後肢筋の機械的および酵素の消化力、(3) 筋芽細胞増殖、分化および (4) は、プライマリの筋芽細胞の分離ライブ イメージング筋芽細胞分化の最初 16 h 内の核を追跡します。
次の手順で筋芽細胞は H2B GFP マウスから隔離され、前述10として、H2B GFP 発現のためのドキシサイクリン 1 μ g/mL で処理しました。また、核の蛍光蛋白質の表現他のトランスジェニック マウスから筋芽細胞を分離する、または前述のピメンテルらによる核の蛍光蛋白質を表現する野生型マウスから分離した細胞を使って可能です。9。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

細胞内の核の配置、開発および再生の複数の細胞プロセスが重要です。核の配置の最も興味深い例は骨格筋の中に発生します。筋繊維 (筋線維) が筋前駆細胞 (筋芽細胞) 由来の筋幹細胞 (サテライト細胞) の増殖と分化を融合して多核巨細胞の細胞です。筋線維内の正しい核配置は、適切な筋肉の再生と機能に必要です。筋芽細胞の分化と筋線維の形成を評価する共通のプロシージャは、蛍光抗体法により、時間の経過とともに核の運動と細胞挙動の研究を妨げる用いて固定セルに依存します。ここでは、生細胞イメージングによる筋芽細胞の分化と筋線維の形成の解析手法について述べる.分化と融合の中に細胞核ダイナミクスと筋芽細胞挙動 (すなわち、軌道) の高スループットの定量的な特徴づけを取得する自動核追跡のためのソフトウェアを提供します。

自動的にライブ イメージングで筋芽細胞分化に非核運動に従う、核が優先的に蛍光に分類します。これらの分子は13主筋芽細胞の分化と増殖を妨害するため、DNA 間をインターカ レート分子を使用して実現可能なないが注意することが重要です。例として、増殖と分化をプライマリ筋芽細胞培養ヘキスト (図 1) の有無で分析さ?...

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Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

骨格筋は、特に核の配置に依存する非常にダイナミックなプロセスです。ここでは、我々 は筋芽細胞の分化と筋層の間の生きているセルイメージ投射によって核の動きを追跡する自動追跡から情報を抽出することにより核動態の定量的な解析を実行する方法をについて説明します。

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

プロトコルを使用しない場合、生細胞イメージングを利用して、ミオブラスト分化と筋繊維形成の動的過程、特に核ポジショニングを調べることができます。異種細胞核を有する筋芽細胞の生細胞イメージングは、生細胞における筋芽細胞分化と核の自動追跡の研究を可能にする。視覚的なデモンストレーションは、一次細胞分離とライブイメージングおよびイメージング解析を組み合わせる方法を理解するのに役立ちます。フレデリカ・コロンボとの手順をデモンストレーション, ジョルガ・カレジカ, 私たちの研究室で博士課程の学生になります.脛骨ソレウス、伸張ジジットロンサス、胃頭筋、四頭筋、三頭筋を成虫マウスの両後肢から氷上のPBSのペトリ皿に収穫することから始めます。滅菌はさみとピンセットを使用して、各筋肉から腱と脂肪を慎重に取り除き、筋肉を空のペトリ皿に移します。無菌湾曲したはさみを使用して、均一な塊が得られるまで筋肉を切断し、ミンチし、筋肉片を50ミリリットルのチューブに移します。その後、1分間に250回転で37°Cの水浴で30分のインキュベーションのために筋肉片に消化媒体の10ミリリットルを追加します。酵素消化の終わりに、ブロッキング培地の10ミリリットルで反応を停止する。そして、遠心分離によってサンプルをスピンダウン。チューブを氷の上に置き、上澄み物を新しい50ミリリットルチューブに移します。再び上清を遠心分離します。そして、ペレットをDMEMの1ミリメートルで再中断します。氷の上に10%の牛血清、またはFBSでそれを補う。ちょうど実証したように新鮮な消化培地の10ミリリットルで予約ペレットを消化し、氷の上で、予備細胞の懸濁液と消化されたペレットを組み合わせます。引っ張られた細胞を70マイクロメートルのフィルターでひずみ、続いて40マイクロメートルのフィルターを続けます。そして、10%FBSを補った新鮮なDMEMの15ミリメートルで細胞を洗います。遠心分離の終了時に、ペレットを室温で3ミリリットルの赤血球リシスバッファーに再懸濁させる。PBSの40ミリリットルと追加の遠心分離で5分後に溶精を停止します。ペレットを10%FBSで補ったDMEMの20ミリリットルで再懸濁し、コーティングされていないペトリ皿に細胞をプレプレートします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間後に上清を含む衛星細胞を収集する。そして、実証したように細胞懸濁液をさらに2回プレプレートする。最後のめっきの後、遠心分離によって衛星細胞を収集し、新鮮な増殖培地の40ミリリットルにペレットを再中断する。2つのコラーゲンの間で細胞を分割し、150ミリリットルのペトリ皿を1皿当たり1ミリグラムのドキシサイクリンでコーティングし、H2BGFP発現を誘導した。そして、細胞を2〜3日間培養インキュベーターに戻す。筋芽細胞が適切な実験密度に達したら、各皿の細胞を5ミリリットルのPBSで洗い、1皿あたり2ミリリットルのトリプシンを37°Cでプレート底から5分間取り除きます。光顕微鏡による剥離を確認し、DMEMの5ミリリットル+プレート当たり10%FBSで反応を停止します。生細胞イメージングの場合、350マイクロリットルの分化培地でコーティングされた12のウェルプレートのウェルに20〜5番目の細胞を2回プレートし、2時間の間、ウェルあたり基膜マトリックスを補充する。細胞がプレートの底に付着したら、プレートを37°C、二酸化炭素インキュベーターを共焦点顕微鏡ステージに5%置き、20回乾燥した目的を使用して数百個の細胞を有する視野を得て、16時間毎に1フレームあたり1024 x 1024ピクセルの16ビット画像を取得します。獲得したポジションごとに、マルチフレームドットtifファイルを生成し、選択したフォルダに用意されているドットzipソフトウェアをダウンロードして解凍します。セグメンテーション トラッキング フォルダの例を開き、[セグメンテーションドット M を実行] をクリックして、Matlab でコマンド ウィンドウを開きます。可変ファイル名トラックが tif ファイルの名前になるように、セグメント化ドット M スクリプトを変更し、パス入力トラックはドット tif が含まれるフォルダになります。[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。セグメンテーションの結果はファイルドットマットとして保存され、核のセグメンテーションは出力図で視覚化できます。トラックを生成するには、最初にダブルクリックすると、同じ作業フォルダ内のトラックドット M を生成します。次に、ファイル名を、セグメント化された核に適したドット Mat ファイルのファイル名を変更します。[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。トラッキングの結果は別のドットマットファイルとして保存され、生成されたトラックがプロットされます。トラックの品質を評価します。まず、チェックトラッキングドットMをダブルクリックし、ファイル名を適切なドットtif名に変更します。次に、ファイル名トラックをクリックしてトラックのドットマットファイルを使用し、[実行]をクリックします。図ウィンドウで、下のスクロールバーを使用して核を選択します。選択した核は赤で囲まれ、選択したセルの軌跡は上部スクロールバーを使用して時間に従うことができます。緑色の十字は検出された核を示す。増殖と分化は、Hoechstで培養された筋芽細胞において強く損なわれる。ミオブラストはH2BGFPマウスから単離され、ドキシサイクリンまたは野生型で培養されたのと比較して、ミオシン重鎖は筋芽細胞と標識した。H2BGFPタンパク質を発現する原発性筋芽細胞を用いた生細胞イメージングは、分化中の核の追跡を可能にする。分化期間の初期および最終時点でのGFPチャンネルでの伝送の画像をマージし、ミオチューブの識別を可能にし、その結果、ミオチューブに統合されるか、またはミオチューブに融合しない核。共焦点蛍光顕微鏡によるイメージング後、核は実証されているようにセグメント化することができ、流域変換は近くの物体を分離するために使用することができる。このアプローチでは、ほとんどの核が画像内で特定され、実証されているように核運動を追跡することができます。例えば、Hoechstで染色された細胞の軌道の全長がわずかに高くなるように見えます。違いは重要ではありませんが。しかし、タイムラプス中の総変位の計算は、Hoechstで染色された細胞の総変位が染色されていない細胞の変位よりも有意に小さいことを明らかにする。予測通り、染色されていない細胞の年間総変動は、Hoechstで染色された細胞と比較して有意に小さい。生物学的ステップの技術スキルを共焦点顕微鏡およびソフトウェア使用ステップと組み合わせる際に、特に実証されたプロトコルに従うことが重要です。目的の別の筋肉モデルにおける筋芽細胞分化と核ポジショニングを研究するために、単離された心芽細胞を蛍光核タンパク質で転写することが可能である。この技術は、筋肉分化中の細胞および核ダイナミクスを探求し、このプロセスの欠陥をさらに調査する道を開いた。筋肉ジストロフィーなどの様々な病理学的条件下で.

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筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

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