Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

이 작품은 AFM-텔 레 톤 E.V. (#21545)에 의해 고 스타지오네 산 라파엘 레 (OSR) 씨 그랜트 S.Z. (ZAMBRA5X1000)에 의해 지원 되었다. 파스퇴르의 이미지 분석 허브에서 박사 장 이브 Tinevez 공개적으로 그의 "간단한 추적기" MATLAB 루틴을 공유에 대 한 인정 이다.

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 산 라파엘 레 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 마우스 hindlimb 근육의 해 부
<ol><li>압력가 마로 소독 하 여 핀셋과가 위 (직선 및 곡선)을 소독.</li>
	<li>준비 하 고 실험을 시작 하기 전에 모든 미디어 (매체 차단, 소화 매체, 매체, 확산 및 매체 차별화) (0.22 μ m)을 필터링 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>35 mm 페...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 확산 그리고 감 별 법2,3,를 받아야 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성 되는 4. Myoblast 차별화를 평가 하기 위해 일반적인 절차 myoblasts 매체를 차별화 하 고 MyHC, 차별화, 마커 및의 얼룩에 얼룩이 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 다른 시...

골격 근육 몸 질량1의 35%-40%에 달하는 인체에서 가장 큰 조직 이다. 인공위성 세포는 근육 줄기 세포, 해부학 적 특징 확산 myoblasts (조직적 조상 세포)을 일으키 다, (플라즈마 막 아래 근육 섬유의 기저 lamina에 juxtaposed), 그들의 위치는 결국 차별화 및 기존 myofibers에 통합 그리고/또한 형태 새로운 myofibers2,,34퓨즈. 그들의 발견 및 그들의 생물학 연구에서 근육 발달 및 재생에 중요 한 통찰력을 주도하 고 있다.
격리 하 고 myotubes로 myoblasts 분화 프로토콜 많은 년 전에 개발 되었습니다 하 고 골격 근육 감 별 법5,,67공부에 아직도 널리 이용 된다. 그러나, 이러한 방법의 대부분 고정된 셀의 분석에 의존 하 고, 따라서 완전히 myoblast 퓨전 myofiber 성숙 등 매우 역동적인 과정을 탐구 하는 과학자를 허용 하지 않는 정적 프로시저를 나타냅니다. 가장 눈에 띄는 예는 단단히 통제, 처음에 myofiber의 중심 핵과 이며, 다음, myofiber 성숙8,9후 주변에 있는 핵 위치입니다. 라이브 영상 추가 같은 독특한 현상에 대 한 통찰력을 얻을 수 가장 적합 한 기술입니다.
여기, 우리 과학자 myoblast 차별화 및 myotube 형성 시간 경과 현미경으로 기록 하 고 myoblast 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행할 수 있도록 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 차별화와 퓨전 중 핵 역동성과 myoblast 행동의 높은 처리량 양적 특성을 제공합니다. 프로토콜은 나누어 4 개의 다른 부분, 즉 (1) 컬렉션 (2) 마우스의 hindlimbs에서 근육의 기계 및 효소 소화, (3) myoblast 확산 및 감 별 법, (4)으로 구성 된 기본 myoblasts의 격리 핵 myoblast 차별화의 첫 번째 16 h 내 추적 영상 라이브.
다음 절차에서는 myoblasts H2B GFP 마우스에서 격리 되며 doxycycline H2B GFP 표현, 앞에서 설명한10유도 1 µ g/mL로 치료. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 하거나 transfect 세포 Pimentel 외에 의해 설명 된 대로, 핵에서 형광 단백질을 표현 하기 위해 야생-타입 마우스에서 분리 가능 하다. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

세포 내에서 핵 위치 하는 것은 여러 세포 프로세스 개발 및 재생에 중요 합니다. 핵 위치의 가장 흥미로운 예제 골격 근육 분화 동안 발생합니다. 근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 증식과 분화를 받 다 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성. Myofibers 내에서 정확한 핵 위치 하는 것이 적절 한 근육 재생 및 기능에 대 한 필요 합니다. Myoblast 차별화와 myofiber 형성 평가 하는 일반적인 절차는 고정된 세포 면역 형광 검사, 시간이 지남에 핵 운동 및 셀 동작의 연구를 방해에 의해 분석에 의존 합니다. 여기, 라이브 셀 이미징에 의해 myoblast 차별화와 myofiber 형성의 분석 하는 방법을 설명합니다. 차별화 및 퓨전 중 핵 역동성 및 myoblast 행동 (즉, 궤적)의 높은 처리량 양적 특성을 얻기 위해 자동화 된 핵 추적에 대 한 소프트웨어를 제공 하 고.

자동으로 myoblast 차별화 라이브 영상에서 중 핵 움직임을 따라, 핵 우선적으로 표시 되어야 합니다 놓여있는지. Intercalating DNA 분자를 사용 하는 가능한 이러한 분자 확산과 기본 myoblasts13의 방해 때문에 중요 하다. 예를 들어, 확산 및 감 별 법 또는 Hoechst (그림 1) 없이 교양 기본 myoblasts에서 분석 되었습니다 했습니다. 확산 (<strong clas...

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Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

프로토콜없이, 살아있는 세포 이미징을 악용하여 myoblast 분화 및 근섬유 형성, 특히 핵 포지셔닝의 동적 과정을 조사 할 수 있습니다. 이외 세포 핵을 가진 myoblast의 살아있는 세포 화상 진찰은 살아있는 세포에 있는 myoblast 분화의 연구 결과 및 핵의 자동 추적을 허용합니다. 시각적 데모는 1차 세포 격리와 라이브 이미징 및 이미징 분석을 결합하는 방법을 이해하는 데 도움이 됩니다.프레데리카 콜롬보와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 조르가 카레치아(Giorga Careccia)가 될 것입니다. 티비알리스 밑바닥, 엑스텐소 디지오럼 롱우스, 위트록혈증, 사두근, 삼두근 근육을 성인 마우스의 뒷두발에서 얼음 위의 PBS 페트리 접시에 넣음으로써 시작하십시오. 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 각 근육에서 힘줄과 지방을 조심스럽게 제거하고 근육을 빈 페트리 접시로 옮키게 하십시오.균일한 질량이 얻어지고 근육 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮길 때까지 근육이 잘라내고 다진 멸균 곡선 가위를 사용합니다. 그런 다음 분당 250 회전에서 섭씨 37도 의 수조에 30 분 동안 근육 조각에 소화 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 효소 소화의 끝에서, 차단 매체의 10 밀리리터와 반응을 중지합니다.그리고 원심분리에 의해 샘플을 아래로 회전. 얼음에 튜브를 놓고 새로운 50 밀리리터 튜브로 상수 전송합니다. 상체원분리합니다.그리고 DMEM의 1 밀리미터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음 위에 10% 태아 소 혈청, 또는 FBS로 보충하십시오. 예약된 펠릿을 신선한 소화 매체의 10밀리리터로 소화하고 소화된 펠릿과 예비 셀 서스펜션을 얼음 위에 결합합니다.70 마이크로미터 필터를 통해 끌어온 세포를 변형시키고 40 마이크로미터 필터를 제거합니다. 그리고 15 밀리미터의 신선한 DMEM에서 세포를 씻어 10 % FBS로 보충합니다. 원심 분리의 끝에서, 실온에서 적혈구 용해 완충제의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.PBS의 40 밀리리터와 추가 원심 분리로 5 분 후에 용해를 중지합니다. DMEM의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 10%의 FBS로 보충하고 코팅되지 않은 페트리 접시에 세포를 미리 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 1시간 후 이산화탄소5%가 상류체를 함유한 위성 세포를 수집합니다.그리고 전판 셀 서스펜션은 입증된 바와 같이 2회 더. 마지막 도금 후, 원심분리에 의해 위성 세포를 수집하고 신선한 증식 매체의 40 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. H2BGFP 발현을 유도하기 위해 접시당 독시사이클린의 밀리리터 당 1마이크로그램으로 코팅된 두 콜라겐 페트리 접시로 세포를 분할합니다.그리고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 2~3일 동안 되돌려 보라고 한다. myoblasts가 적절한 실험 밀도에 도달하면, PBS의 5 밀리리터로 각 접시에 세포를 세척하고 5 분 동안 37 섭씨37도에서 접시 당 트립신의 두 밀리리터와 접시 바닥에서 세포를 분리. 가벼운 현미경 검사법에 의한 분리를 확인하고 DMEM의 5 밀리리터와 플레이트 당 10 % FBS로 반응을 중지합니다.살아있는 세포 화상 진찰을 위해, 2 시간 동안 잘 당 지하 막 매트릭스로 보충된 분화 매체의 350 마이크로리터로 코팅된 12개의 웰 플레이트의 각 우물로 5번째 세포에 2배 10배 플레이트를 플레이트. 세포가 플레이트의 바닥에 부착된 경우, 플레이트를 공초점 현미경 단계에 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소 인큐베이터를 배치하고 20배 건조 목표를 사용하여 수백 개의 셀로 시야를 확보하여 16시간 마다 1024x 1024픽셀로 16비트 이미지를 획득한다. 획득한 각 위치에 대해 멀티 프레임 도트 tif 파일을 생성하고 선택한 폴더에 제공된 도트 지퍼 소프트웨어를 다운로드하여 추출합니다.세분화 추적 폴더의 예를 열고 분할 점 M을 클릭하여 Matlab에서 명령 창을 엽니다. 변수 파일 이름 트랙이 tIF 파일 및 경로 입력 트랙의 이름이 점 tif가 포함된 폴더가 되도록 기한 분할 도트 M 스크립트를 변경합니다. 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다.분할의 결과는 파일 점 매트로 저장되며 핵의 분할은 출력 도면에서 시각화될 수 있다. 트랙을 생성하려면 먼저 두 번 클릭하면 동일한 작업 폴더에서 도트 M 트랙을 생성합니다. 다음으로, 파일 이름을 파일 이름 점으로 변경하여 분할된 핵에 적합한 점 매트 파일입니다.실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 추적 의 결과는 다른 점 매트 파일로 저장되고 생성 된 트랙이 플롯됩니다. 트랙의 품질을 평가합니다.먼저 검사 추적 점 M을 두 번 클릭하고 파일 이름을 적절한 점 tif 이름으로 수정합니다. 그런 다음 파일 이름 트랙을 클릭하여 트랙의 도트 매트 파일을 사용하고 실행을 클릭합니다. 그림 창에서 아래 스크롤 막대를 사용하여 핵을 선택합니다.선택한 핵은 빨간색으로 동그라미를 치고, 선택한 셀의 궤적을 위 스크롤 막대를 사용하여 시간에 따라올 수 있다. 녹색 십자가는 검출된 핵을 나타냅니다. 증식과 분화는 Hoechst와 함께 배양된 근세포에서 강하게 손상됩니다.H2BGFP 마우스로부터 분리되고 독시사이클린 또는 야생 유형으로 배양된 myoblast의 myoblasts에 비해, myosin 무거운 사슬은 myoblasts를 표시했습니다. H2BGFP 단백질을 발현하는 1차 근세포와 함께 살아있는 세포 화상 진찰은 분화 도중 핵의 추적을 허용합니다. 분화 기간의 초기 및 최종 시점에서 GFP 채널에서 전송의 병합 된 이미지는 myotubes의 식별을 허용하고 결과적으로 심덩이에 통합결국 핵또는 myotube에 융합하지 않습니다.공초점 형광 현미경검사법에 의한 이미징 후, 핵은 입증된 바와 같이 분할될 수 있고 유역 변환은 근처의 물체를 분리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법으로, 대부분의 핵은 이미지에서 확인되어 핵 운동이 입증된 대로 추적될 수 있게 한다. 예를 들어, 궤적의 총 길이가 Hoechst로 염색된 세포의 경우 약간 더 높은 것으로 보입니다.차이는 중요하지 않지만. 그러나, 시간 경과 동안 총 변위의 계산은 Hoechst로 염색된 세포의 총 변위가 얼룩지지 않은 세포의 총 변위가 스테인드 셀의 결과보다 훨씬 작다는 것을 보여줍니다. 예측된 바와 같이, 염색되지 않은 세포에 대한 총 연간 변이는 Hoechst로 염색된 세포에 비해 상당히 작습니다.생물학적 단계의 기술적 기술을 공초점 현미경 및 소프트웨어 사용 단계와 결합할 때 특히 입증된 프로토콜을 정확하게 따르는 것이 중요합니다. 다른 근육 모델에서 근아세포 분화 및 핵 포지셔닝을 연구하기 위해 형광 핵 단백질로 고립된 myoblast를 이전할 수 있다. 이 기술은 근육 분화 도중 세포및 핵 역학을 탐구하고 이 프로세스에 있는 결점을 더 조사하는 쪽을 포장했습니다.근 이영양증과 같은 다양한 병리학 적 조건하에서.

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Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

연구

생물학

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

운동하는 동안 에너지 시스템의 공헌을 결정

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...