Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av AFM-Telethon til E.V. (#21545) og til Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskudd til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra bildet analyse sentrum av Institut Pasteur er anerkjent for offentlig deler hans "Enkel Tracker" MATLAB rutiner.

Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av San Raffaele institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. Disseksjon av musen hindlimb muskler
<ol><li>Sterilisere pinsett og saks (både rette og buede) av autoklavering.</li>
	<li>Forberede og filtrere (0.22 µm) alle media (blokkerer medium, fordøyelsen medium, voksende medium, og skiller middels) før du starter eksperimentet (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Sett 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) i 35...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler som dannes ved blanding av prekursorer muskelceller (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering2,3, 4. For å vurdere myoblast differensiering, består den felles prosedyren av dyrking myoblasts skille medium og feste cellene på ulike tidspunkt å utføre immunofluorescence flekker for MyHC, en markør av differensiering og ...

Skjelettmuskulatur er den største vev i kroppen, totalt 35% - 40% av kroppen masse1. Satellitt celler er muskel-stamceller, anatomisk preget av sin posisjon (satt sammen til plasma membranen, under den basale lamina av muskel fiber), som gir opphav til voksende myoblasts (myogenic stamfar celler), som til slutt skille og integrere i eksisterende myofibers og/eller sikring til skjemaet ny myofibers2,3,4. Funnet og fremgang i studiet av deres biologi har ført til betydelig innsikt i muskelutvikling og regeneration.
Protokoller å isolere og skille myoblasts i myotubes har blitt utviklet mange år siden og fortsatt er mye brukt til å studere Skjelettmuskel differensiering5,6,7. Men representerer de fleste av disse metodene statisk prosedyrer som stole på analyse av fast celler, og derfor tillater ikke forskere helt utforske svært dynamisk prosesser, for eksempel myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksemplet er kjernefysiske posisjonering, som er strengt regulert, med kjerner først i midten av myofiber, og deretter plassert i periferien etter myofiber modning8,9. Live bildebehandling er den mest passende teknikken for å få ytterligere innsikt i så merkelig fenomen.
Her beskriver vi en metode som gjør at forskerne å registrere myoblast differensiering og myotube dannelsen av time-lapse mikroskopi og utføre kvantitative analyser fra den automatiske sporingen av myoblast kjerner. Denne metoden gir høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast oppførsel under differensiering og fusion. Protokollen er delt inn i fire ulike deler, nemlig (1) samling av musklene hindlimbs mus, (2) isolering av primære myoblasts som består av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen, (3) myoblast spredning og differensiering og (4) Live bildebehandling spore kjerner innenfor de første 16 h myoblast differensiering.
Fremgangsmåten er myoblasts isolert fra H2B-GFP mus og behandlet med 1 µg/mL av doxycycline å indusere H2B-GFP uttrykk, som beskrevet tidligere10. Alternativt er det mulig å isolere myoblasts fra andre transgene mus som uttrykker et fluorescerende protein i kjernen eller transfect celler isolert fra vill-type mus å uttrykke et fluorescerende protein i kjernen, som beskrevet ved Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Kjernefysisk posisjonering i celler er viktig for flere cellulære prosesser i utvikling og regeneration. Det mest spennende eksempelet på kjernefysiske posisjonering oppstår under Skjelettmuskel differensiering. Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler av fusjon av muskel precursor celler (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering. Riktig kjernefysiske posisjonering i myofibers er nødvendig for riktig muskulære og funksjon. Den vanlige prosedyren for å vurdere myoblast differensiering og myofiber formasjon er avhengig av faste celler analysert av immunofluorescence, som hindrer studiet av kjernefysiske bevegelse og celle oppførsel over tid. Her beskriver vi en metode for analyse av myoblast differensiering og myofiber dannelsen av levende celle tenkelig. Vi tilbyr en programvare for automatisert kjernefysiske sporing å få høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast atferd (dvs. banen) under differensiering og fusion.

Å automatisk følge kjernefysiske bevegelse under myoblast differensiering i live bildebehandling, skal kjerner fortrinnsvis være fluorescently merket. Det er viktig å merke seg at ved hjelp av DNA-intercalating molekyler ikke er mulig fordi disse molekylene forstyrre spredning og differensiering av primære myoblasts13. Som et eksempel, er spredning og differensiering analysert i primære myoblasts kultivert med eller uten Hoechst (figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Utnytte Live bildebehandling til spor kjerner Myoblast differensiering og Fusion

Skjelettmuskel differensiering er en svært dynamisk prosess, som bruker spesielt kjernefysisk posisjonering. Her beskriver vi en metode å spore kjerner bevegelser av levende celle tenkelig under myoblast differensiering og myotube formasjon og utføre kvantitativ karakteristikk av kjerner dynamikken ved gitt informasjon automatisk sporing.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Uten protokoll er det mulig å undersøke den dynamiske prosessen med myoblastdilatering og myofiberdannelse, spesielt kjernefysisk posisjonering ved å utnytte levende celleavbildning. Levende celleavbildning av myoblast med fremmedcellekjerner tillater studiet av myoblastdilatering i levende celler og automatisk sporing av kjernene. Visuell demonstrasjon hjelper med å forstå hvordan du kombinerer primær celleisolasjon med live bildebehandling og bildeanalyse.Viser prosedyren med Frederica Colombo, vil være Giorga Careccia, en ph.d.-student i vårt laboratorium. Begynn med å høste tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps og triceps muskler fra begge baklemmer av en voksen mus inn i en Petriskål av PBS på is. Bruk steril saks og pinsett for å forsiktig fjerne sener og fett fra hver muskel og overføre musklene til en tom petriskål.Ved hjelp av steril buet saks kuttet og hakke musklene til en jevn masse er oppnådd og overføre muskelbitene til en 50 milliliter tube. Tilsett deretter 10 milliliter fordøyelsesmedium til muskelbitene i en 30 minutters inkubasjon i et 37 grader celsius vannbad ved 250 rotasjoner per minutt. På slutten av den enzymatiske fordøyelsen, stopp reaksjonen med 10 milliliter blokkerende medium.Og spinne ned prøven ved sentrifugering. Plasser røret på is og overfør supernatanten til et nytt 50 milliliter rør. Sentrifuger supernatanten igjen.Og re-suspendere pellet i en millimeter dmem. Supplere det med ti prosent fosterbovin serum, eller FBS, på is. Fordøy den reserverte pelleten i 10 milliliter frisk fordøyelsesmedium som nettopp demonstrert og kombiner den fordøyde pelleten med reservecellesuspensjonen, på is.Sil de trukket cellene gjennom et 70 mikrometerfilter, etterfulgt av et 40 mikrometerfilter. Og vask cellene i 15 millimeter fersk DMEM, supplert med 10 prosent FBS. På slutten av sentrifugeringen, re-suspendere pellet i tre milliliter av røde blodlegemer lysis buffer ved romtemperatur.Stoppe lysis etter fem minutter med 40 milliliter PBS og en ekstra sentrifugering. Re-suspendere pellet i 20 milliliter DMEM supplert med 10 prosent FBS og pre-plate cellene i ubestrøket Petri parabolen. Etter en time ved 37 grader celsius og fem prosent karbondioksid samle satellittcellen som inneholder supernatant.Og pre-plate cellen suspensjon to ganger som demonstrert. Etter den siste plating, samle satellittceller ved sentrifugering og re-suspendere pellet i 40 milliliter av fersk spredning medium. Dele cellene mellom to kollagen belagt 150 milliliter Petri retter med ett mikrogram per milliliter doxycycline per tallerken for å indusere H2BGFP uttrykk.Og returnere cellene til cellekulturinkubatoren i to eller tre dager. Når myoblastene har nådd riktig eksperimentell tetthet, vask cellene i hver tallerken med fem milliliter PBS og løsne cellene fra platebunnen med to milliliter Trypsin per tallerken ved 37 grader celsius i fem minutter. Bekreft løsrivelse ved lett mikroskopi og stopp reaksjonen med fem milliliter DMEM pluss ti prosent FBS per plate.For levende celleavbildning, plate to ganger ti til femte celler i hver brønn av en 12 brønnplate belagt med 350 mikroliter differensiering medium, supplert med kjeller membran matrise per brønn i to timer. Når cellene har holdt seg til bunnen av platen, plasser platen i en 37 graders celsius og fem prosent karbondioksidinkubator på et konfokalt mikroskopstadium og bruk et 20 ganger tørt mål for å oppnå synsfelt med hundrevis av celler for å skaffe 16-biters bilder med 1024 innen 1024 piksler per ramme hvert sjette minutt i 16 timer. For hver ervervede posisjon, generere en multi frame dot tif fil og laste ned og pakke ut dot zip programvare som tilbys i en valgt mappe.Åpne eksemplet med segmenteringssporingsmappe, og klikk gjør segmenteringspunkt M for å åpne kommandovinduet i Matlab. Endre due segmentering punkt M skript slik at variabelen filnavn sporet er navnet på tif filen og banen inndataspor er mappen der dot tif er inneholdt. Klikk Kjør for å kjøre skriptet.Resultatet av segmenteringen vil bli lagret som en filprikkmattematte, mens segmenteringen av kjernene kan visualiseres i utdatafiguren. Hvis du vil generere sporene, må du først dobbeltklikke generere spor punkt M i samme arbeidsmappe. Deretter endrer du filnavnet til filnavnet peker riktig dot Mat-fil for segmenterte kjerner.Klikk Kjør for å kjøre skriptet. Resultatet av sporingen lagres som en annen punktmattefil, og de genererte sporene vil bli plottet. For å evaluere kvaliteten på sporene.Dobbeltklikk først på kontrollsporingspunktet M og endre filnavnet til riktig punkttifnavn. Klikk deretter på filnavnspor for å bruke dot mat-filen i sporene og klikk kjør. I figurvinduet bruker du det nedre rullefeltet til å velge kjernen.Den valgte kjernen vil bli sirklet i rødt, og banen til den valgte cellen kan følges i tide ved hjelp av det øvre rullefeltet. Grønne kors indikerer de oppdagede kjernene. Spredning og differensiering er sterkt svekket i myoblaster dyrket med Hoechst.Sammenlignet med myoblast er isolert fra H2BGFP mus og kultivert med doxycyklin eller vill type, myosin tung kjede merket myoblaster. Levende celleavbildning med primære myoblaster som uttrykker H2BGFP-proteinet tillater sporing av kjernene under differensiering. Sammenslåtte bilder av overføring i GFP-kanaler på de første og siste tidspunktene i differensieringsperioden, tillater identifisering av myotubes og dermed kjerner som ender opp med å integrere seg i myotubes eller som ikke smelter inn i myotubes.Etter avbildning av konfokal fluorescensmikroskopi, kan kjernene segmenteres som demonstrert og vannskille forvandles kan brukes til å skille nærliggende objekter. Med denne tilnærmingen identifiseres de fleste kjernene i bildet, slik at kjernene bevegelse kan spores som demonstrert. For eksempel ser det ut til at den totale lengden på banene er litt høyere for celler farget med Hoechst.Selv om forskjellen ikke er signifikant. Beregning av den totale forskyvningen i løpet av en tidsforløp avslører imidlertid at den totale forskyvningen av cellene farget med Hoechst er betydelig mindre enn for ustained celler. Som spådd er den totale årlige variasjonen for de uopphetede cellene betydelig mindre sammenlignet med celler farget med Hoechst.Det er viktig å følge protokollen nøyaktig som demonstrert spesielt når du kombinerer de tekniske ferdighetene fra de biologiske trinnene med det konfokale mikroskopet og programvaren som brukes trinn. For å studere myoblast differensiering og kjernefysisk posisjonering i en annen muskelmodell av interesse er det mulig å overføre isolert myoblast med fluorescerende kjernefysisk protein. Denne teknikken banet vei for å utforske cellulær og kjernefysisk dynamikk under muskeldiensiering og å undersøke feil i disse prosessene ytterligere.Under ulike patologiske forhold som muskeldystrofier.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Bestemme Bidrag av energisystemene under trening

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende celle-bildebehandling av blodplategradering og sekresjon under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live celle fluorescens mikroskopi å observere viktige prosesser under mikrobiell cellevekst

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...