Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela AFM-Teleton para E.V. (#21545) e pela Ospedale San Raffaele (OSR) semente subvenção para S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez do centro de análise de imagem do Institut Pasteur é reconhecido por compartilhar publicamente suas rotinas MATLAB "Simples Tracker".

Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso e San Raffaele institucional Cuidado Animal.
1. a dissecação dos músculos do membro posterior de rato
<ol><li>Esterilize as pinças e tesouras (retas e curvas) em autoclave.</li>
	<li>Preparar e filtro (0,22 µm) todas as mídias (bloqueio médio, médio de digestão, proliferando médio e diferenciando médio) antes de iniciar o experimento (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Colocar ...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas que são formadas pela fusão de células precursoras de músculo (mioblastos) derivada de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação2,3, 4. Para avaliar a diferenciação de myoblast, o procedimento comum consiste de cultivo mioblastos em diferenciar médio e fixação das células em pontos de tempo diferentes p...

Músculo esquelético é o tecido maior no corpo humano, totalizando 35% - 40% da massa do corpo1. Células satélites são células-tronco musculares, anatomicamente caracterizadas por sua posição (justaposta a membrana plasmática, por baixo da lâmina basal das fibras musculares), que dão origem à proliferação de mioblastos (células progenitoras miogênico), que eventualmente diferenciar e integrar myofibers existentes e/ou fusível para formulário novo myofibers2,3,4. O progresso no estudo de sua biologia e sua descoberta levou a insights significativos sobre o desenvolvimento muscular e regeneração.
Protocolos para isolar e diferenciar mioblastos em myotubes foram desenvolvidos há muitos anos e ainda são largamente usados para estudar o músculo esquelético diferenciação5,6,7. No entanto, a maioria desses métodos representa procedimentos estáticos que dependem da análise de células fixas e, consequentemente, não permitir que os cientistas a explorar plenamente os processos altamente dinâmicos, como fusão de myoblast e maturação de miofibras. O exemplo mais marcante é o posicionamento nuclear, que é fortemente regulamentado, com núcleos inicialmente no centro das miofibras e, em seguida, localizada na periferia das miofibras maturação8,9. Imagem ao vivo é a técnica mais apropriada para obter ainda mais insights sobre um fenômeno tão peculiar.
Aqui, descrevemos um método que permite aos cientistas para gravar myoblast formação de diferenciação e myotube pela microscopia de lapso de tempo e realizar análises quantitativas do rastreamento automático de núcleos myoblast. Este método fornece uma caracterização quantitativa da elevado-throughput de nuclear dinâmica e myoblast comportamento durante a diferenciação e fusão. O protocolo é dividido em quatro partes diferentes, ou seja, (1) a coleção dos músculos de um dos membros posteriores dos ratos, (2) o isolamento dos mioblastos primários que consiste na digestão enzimática e mecânico, (3) myoblast proliferação e diferenciação e (4) viva da imagem latente para rastrear núcleos dentro o primeiro 16 h de diferenciação myoblast.
No procedimento a seguir, mioblastos são isolados de ratos H2B-GFP e tratados com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP, como descrito anteriormente,10. Alternativamente, é possível isolar os mioblastos de outros ratos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente no núcleo ou transfect as células isoladas de ratos do selvagem-tipo de expressar uma proteína fluorescente no núcleo, conforme descrito por Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Posicionamento nuclear dentro de células é importante para vários processos celulares em desenvolvimento e regeneração. O exemplo mais intrigante de posicionamento nuclear ocorre durante a diferenciação do músculo esquelético. Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas, formadas pela fusão de células precursoras dos músculos (mioblastos) derivadas de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação. Correto posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função. O procedimento comum para avaliar a formação de diferenciação e miofibras myoblast se baseia em células fixas analisadas por imunofluorescência, que dificulta o estudo do comportamento de movimento e célula nuclear ao longo do tempo. Aqui, descrevemos um método para a análise da formação de diferenciação e miofibras myoblast por imagens de células vivas. Nós fornecemos um software automatizado de controle nuclear obter uma caracterização quantitativa da elevado-produção de nuclear dinâmica e comportamento de myoblast (ou seja, a trajetória) durante a diferenciação e fusão.

Para seguir automaticamente o movimento nuclear durante a diferenciação de myoblast em imagens ao vivo, os núcleos devem preferencialmente ser fluorescente etiquetados. É importante notar que usar moléculas de DNA-intercalante não é viável porque estas moléculas interferem com a proliferação e diferenciação de mioblastos primária13. Como exemplo, proliferação e diferenciação foram analisados em mioblastos primários cultivados com ou sem Hoechst (...

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Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Sem protocolo, é possível investigar o processo dinâmico de diferenciação myoblast e formação de miofibras, em particular o posicionamento nuclear explorando imagens de células vivas. Imagens de células vivas de míobios com núcleos celulares estranhos permitem o estudo da diferenciação myoblast em células vivas e o rastreamento automático dos núcleos. A demonstração visual ajuda a entender como combinar o isolamento celular primário com a análise de imagens e imagens ao vivo.Demonstrando o procedimento com Frederica Colombo, será Giorga Careccia, doutoranda em nosso laboratório. Comece colhendo os músculos tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadríceps e tríceps de ambos os membros traseiros de um rato adulto em uma placa de Petri de PBS no gelo. Use tesouras e pinças estéreis para remover cuidadosamente os tendões e a gordura de cada músculo e transfira os músculos para uma placa de Petri vazia.Usando uma tesoura curva estéril cortada e pica-se os músculos até que uma massa uniforme seja obtida e transfira as peças musculares para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de digestão às peças musculares para uma incubação de 30 minutos em um banho de água de 37 graus celsius a 250 rotações por minuto. No final da digestão enzimática, pare a reação com 10 mililitros de meio de bloqueio.E girar a amostra por centrifugação. Coloque o tubo no gelo e transfira o supernatante para um novo tubo de 50 mililitros. Centrifugar o supernante novamente.E suspenda a pelota em um milímetro de DMEM. Suplementá-lo com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, no gelo. Digerir a pelota reservada em 10 mililitros de meio de digestão fresco como apenas demonstrado e combinar a pelota digerida com a suspensão celular de reserva, no gelo.Coe as células puxadas através de um filtro de 70 micrômetros, seguido por um filtro de 40 micrômetros. E lave as células em 15 milímetros de DMEM fresco, suplementado com 10% de FBS. No final da centrifugação, suspenda a pelota em três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos à temperatura ambiente.Parar a lise após cinco minutos com 40 mililitros de PBS e uma centrifugação adicional. Suspenda a pelota em 20 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS e pré-emplaquem as células em placa de Petri não revestida. Depois de uma hora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono coletar a célula satélite contendo supernasce.E pré-placa a suspensão da célula mais duas vezes como demonstrado. Após o último revestimento, colete as células satélites por centrifugação e suspenda a pelota em 40 mililitros de meio de proliferação fresca. A divisão das células entre dois colágenos revestidos 150 mililitros placas de Petri com um micrograma por mililitro de doxiciclina por placa para induzir a expressão H2BGFP.E devolva as células à incubadora de cultura celular por dois ou três dias. Quando os myoblasts atingirem a densidade experimental apropriada, lave as células em cada prato com cinco mililitros de PBS e retire as células do fundo da placa com dois mililitros de Trypsin por prato a 37 graus celsius por cinco minutos. Confirme o desprendimento por microscopia leve e pare a reação com cinco mililitros de DMEM mais 10% de FBS por placa.Para imagens de células vivas, a placa duas vezes dez a quinta células em cada poço de uma placa de 12 poços revestida com 350 microliters de meio de diferenciação, complementada com matriz de membrana por porão por poço por duas horas. Quando as células aderirem à parte inferior da placa, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono em um estágio de microscópio confocal e use um objetivo 20 vezes seco para obter campos de visão com centenas de células para adquirir imagens de 16 bits com 1024 por 1024 pixels por quadro a cada seis minutos durante 16 horas. Para cada posição adquirida, gere um arquivo de ponto de ponto multi quadro e baixe e extraia o software de ponto zip fornecido em uma pasta selecionada.Abra o exemplo da pasta de rastreamento de segmentação e clique em fazer o ponto de segmentação M para abrir a janela de comando no Matlab. Alterar os scripts M de ponto de segmentação devido para que a faixa de nome do arquivo variável seja o nome do arquivo tif e da faixa de entrada do caminho é a pasta onde o ponto tif está contido. Clique em executar para executar o script.O resultado da segmentação será salvo como um tapete de ponto de arquivo, enquanto a segmentação dos núcleos pode ser visualizada na figura de saída. Para gerar as faixas, primeiro clique duplo gerar faixas ponto M na mesma pasta de trabalho. Em seguida, altere o nome do arquivo para apontar o arquivo dot Mat apropriado para os núcleos segmentados.Clique em Executar para executar o script. O resultado do rastreamento será salvo como outro arquivo de tapete de ponto e as faixas geradas serão plotadas. Para avaliar a qualidade das faixas.Primeiro clique duas vezes no ponto de rastreamento de verificação M e modifique o nome do arquivo para o nome de ponto tif apropriado. Em seguida, clique na faixa de nome do arquivo para usar o arquivo do tapete de ponto das faixas e clique em executar. Na janela da figura use a barra de rolagem inferior para selecionar o núcleo.O núcleo selecionado será circulado em vermelho, e a trajetória da célula selecionada pode ser seguida a tempo usando a barra de rolagem superior. Cruzes verdes indicam os núcleos detectados. Proliferação e diferenciação são fortemente prejudicadas em myoblasts cultivados com Hoechst.Comparado ao myoblast isolado de camundongos H2BGFP e cultivado com doxiciclina ou tipo selvagem, a cadeia pesada de miosina rotulou myoblasts. Imagens de células vivas com myoblasts primários expressando a proteína H2BGFP permitem o rastreamento dos núcleos durante a diferenciação. Imagens mescladas de transmissão nos canais GFP nos pontos de tempo inicial e final do período de diferenciação, permitem a identificação de miotubos e, consequentemente, núcleos que acabam se integrando aos miótubos ou que não se fundem em miostutos.Após a imagem por microscopia de fluorescência confocal, os núcleos podem ser segmentados como demonstrado e a transformação da bacia hidrográfica pode ser usada para separar objetos próximos. Com essa abordagem, a maioria dos núcleos são identificados na imagem, permitindo que o movimento dos núcleos seja rastreado como demonstrado. Por exemplo, parece que o comprimento total das trajetórias é ligeiramente maior para células manchadas com Hoechst.Embora a diferença não seja significativa. No entanto, a computação do deslocamento total durante um lapso de tempo revela que o deslocamento total das células manchadas com Hoechst é significativamente menor do que o de células não manchadas. Como previsto, a variação anual total das células não manchadas é significativamente menor em comparação com as células manchadas com Hoechst.É importante seguir o protocolo exatamente como demonstrado em particular ao combinar as habilidades técnicas das etapas biológicas com o microscópio confocal e as etapas utilizadas pelo software. Para estudar a diferenciação myoblast e o posicionamento nuclear em outro modelo muscular de interesse é possível transferir móblassto isolado com proteína nuclear fluorescente. Essa técnica abriu caminho para explorar a dinâmica celular e nuclear durante a diferenciação muscular e investigar ainda mais os defeitos nesses processos.Sob várias condições patológicas, como distrofias musculares.

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Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...