Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Эта работа было поддержано AFM-телемарафон в е.в. (#21545) и Грант Seed Ospedale San Raffaele (OSR) для с.з. (ZAMBRA5X1000). Д-р Жан-Ив Tinevez от центра анализа изображения Пастера признал публично обмена его «Простой Tracker» MATLAB процедуры.

Все процедуры с участием животных темы были утверждены San Raffaele институциональных животное уход и использование Комитета.
1. препарирование мыши задних конечностей мышцы
<ol><li>Стерилизуйте пинцета и ножницы (прямые и изогнутые) путем автоклавирования.</li>
	<li>Подготовить и ...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Мышечных волокон (myofibers) являются многоядерные клетки, которые образуются сплавливанием прекурсоров мышечных клеток (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки2,-3, <sup...

Скелетных мышц является крупнейшим ткани в организме человека, на сумму 35% - 40% массы тела1. Спутниковое клетки являются мышечных стволовых клеток, анатомически характеризуется их позицию (juxtaposed на плазматической мембране, под базальной пластинки мышечных волокон), дают основания для пролиферирующих сомитов (миогенных прогениторных клеток), который в конечном итоге дифференцировать и интегрировать в существующие myofibers и/или предохранитель в форме новых myofibers2,3,4. Их открытие и прогресс в изучении их биологии привело к значительным понимание развития мышц и регенерации.
Протоколы изоляции и дифференцировать сомитов в myotubes были разработаны много лет назад и до сих пор широко используются для изучения скелетных мышц дифференциация5,6,7. Однако большинство этих методов представляют собой статические процедур, которые полагаются на анализ фиксированных клеток и, следовательно, не позволяют ученым в полной мере изучить весьма динамических процессов, таких как слияние myoblast и myofiber созревания. Наиболее ярким примером является ядерная позиционирования, которая жестко регулируется, с ядрами первоначально в центре myofiber и, затем, расположенных на периферии после myofiber созревания8,9. Живой изображений является наиболее приемлемый метод для получения дальнейших понимание такой своеобразный феномен.
Здесь мы описываем метод, который позволяет ученым для записи myoblast дифференциация и myotube формирования покадровой микроскопии и выполнить количественный анализ от автоматического отслеживания myoblast ядер. Этот метод обеспечивает высок объём количественной характеристики ядерной динамики и myoblast поведения во время дифференциация и фьюжн. Протокол разделен на четыре части, а именно: (1) коллекции мышц от гомотерия мышей, (2) изоляции первичных сомитов, которая состоит в механических и ферментативного пищеварения, (3) myoblast распространения и дифференциации и (4) живой изображений для отслеживания ядер в течение первых 16 h myoblast дифференцировки.
В следующей процедуре сомитов изолированы от мышей H2B-GFP и относились с 1 мкг/мл доксициклин побудить H2B-GFP выражение, как описано выше10. В качестве альтернативы можно изолировать сомитов от других трансгенных мышей, которые выражают флуоресцентный белок в ядре или transfect клетки, изолированные от мышей дикого типа выразить флуоресцентный белок в ядре, как описано в Пиментел и др. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Ядерные позиционирование внутри клетки имеет важное значение для нескольких клеточных процессов развития и регенерации. Наиболее интригующим примером ядерной позиционирования происходит во время дифференциация скелетных мышц. Многоядерные клетки, сформирована сплавливанием мышечных клеток-предшественников (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки мышечных волокон (myofibers). Правильное позиционирование ядерных в myofibers требуется для надлежащего мышечной регенерации и функции. Общие процедуры для оценки формирования дифференциации и myofiber myoblast опирается на фиксированные клетки анализируемой иммунофлюоресценции, который препятствует изучение поведения ядерных движения и клеток со временем. Здесь мы описываем метод для анализа myoblast дифференциация и myofiber формирования на живых клеток. Мы предоставляем программное обеспечение для автоматизированной ядерный отслеживания для получения количественной характеристики высок объём ядерного динамики и myoblast поведения (т.е. траектории) во время дифференциация и фьюжн.

Автоматически следовать ядерной движение во время myoblast дифференциация в живых изображений, ядра должны преференциально дневно обозначаться. Важно отметить, что использование молекулы ДНК, интеркалирующие невозможно потому, что эти молекулы вмешиваться в пролиферац...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Использование живых изображений для ядер трек во время Myoblast дифференциация и фьюжн

Очень динамичный процесс, который особенно зависит от ядерной позиционирования является дифференциация скелетных мышц. Здесь мы описываем метод для выполнения количественная характеристика динамики ядер путем извлечения информации из автоматического отслеживания и отслеживания движения ядер у Вообразимый живой клетки во время формирования дифференциации и myotube myoblast.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Без протокола можно исследовать динамический процесс дифференциации миобластов и формирования миофиберов, в частности ядерное позиционирование, используя живую клеточную визуализацию. Визуализация живых клеток миобласта с ядрами инородных клеток позволяет изучать дифференциацию миобластов в живых клетках и автоматическое отслеживание ядер. Визуальная демонстрация помогает понять, как сочетать изоляцию первичных клеток с живыми изображениями и анализом изображений.Демонстрация процедуры с Фредерикой Коломбо, будет Giorga Careccia, аспирант в нашей лаборатории. Начните с сбора tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, четырехглавых и трицепс мышц от обеих задних конечностей взрослой мыши в чашку Петри PBS на льду. Используйте стерильные ножницы и пинцет, чтобы тщательно удалить сухожилия и жир из каждой мышцы и перенести мышцы в пустую чашку Петри.Использование стерильных изогнутых ножниц вырезать и фарш мышц до однородной массы получены и передачи мышц частей в 50 миллилитров трубки. Затем добавьте 10 миллилитров среды пищеварения к мышечным кусочкам в течение 30 минут инкубации в водяной бане 37 градусов по Цельсию при 250 вращениях в минуту. В конце энзиматической пищеварения, остановить реакцию с 10 миллилитров блокирующей среды.И спина вниз образца центрифугации. Поместите трубку на лед и перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку. Центрифуга супернатант снова.И повторно приостановить гранулы в один миллиметр DMEM. Дополните его десятью процентами сыворотки крупного рогатого скота плода, или FBS, на льду. Переварить зарезервированные гранулы в 10 миллилитров свежего пищеварения среды, как только что продемонстрировали и объединить переваренные гранулы с резервной подвески клеток, на льду.Процедить вытянутые клетки через 70-метровый фильтр, а затем 40-метровый фильтр. И мыть клетки в 15 миллиметров свежего DMEM, дополненный 10 процентов FBS. В конце центрифугации повторно приостанавливайте гранулы в трех миллилитров буфера лиза красных кровяных телец при комнатной температуре.Остановка лиза через пять минут с 40 миллилитров PBS и дополнительной центрифугации. Повторно приостановить гранулы в 20 миллилитров DMEM дополняется 10 процентов FBS и предварительно пластины клеток в неокрашенных Петри блюдо. Через час при 37 градусах цельсия и пяти процентах углекислого газа собирают спутниковую ячейку, содержащую супернатант.И предварительно пластины подвески клетки еще два раза, как попродемонстрировано. После последнего покрытия соберите спутниковые ячейки путем центрифугации и повторно приостановите гранулы в 40 миллилитров свежей среды пролиферации. Разделить клетки между двумя коллагеновым покрытием 150 миллилитров Петри блюда с одним микрограммом на миллилитр доксициклина на блюдо, чтобы вызвать экспрессию H2BGFP.И вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры на два-три дня. Когда миобласты достигли соответствующей экспериментальной плотности, мыть клетки в каждом блюде с пятью миллилитров PBS и отделить клетки от дна пластины с двумя миллилитров трипсина на блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Подтвердите отслоение световой микроскопией и остановите реакцию с помощью пяти миллилитров DMEM плюс десять процентов FBS на тарелку.Для живой визуализации клеток, пластины два раза десять-пятые клетки в каждом хорошо 12 хорошо пластины покрыты 350 микролитров дифференциации среды, дополненный матрицы мембраны подвала на колодец в течение двух часов. Когда клетки прилипли к нижней части пластины, поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа инкубатор на стадии конфокального микроскопа и использовать 20 раз сухой цели для получения полей зрения с сотнями клеток, чтобы приобрести 16 битных изображений с 1024 к 1024 пикселей на кадр каждые шесть минут в течение 16 часов. Для каждой приобретенной позиции создать многокамерный точечный tif файл и загрузить и извлечь программное обеспечение на молнии точки, представленное в выбранной папке.Откройте пример папки отслеживания сегментации и нажмите do segmentation dot M, чтобы открыть командное окно в Matlab. Измените скрипты точки M должной сегментации так, чтобы трек с переменным именем файла — это название файла tif, а трек ввода пути — папка, в которой содержится точка tif. Нажмите запустить, чтобы запустить сценарий.Результат сегментации будет сохранен в качестве коврика точки файла, в то время как сегментация ядер может быть визуализирована на рисунке вывода. Для создания треков, первый двойной клик генерировать треки точка M в той же рабочей папке. Затем измените имя файла, чтобы указать имя соответствующей точки Мат файл для сегментированных ядер.Нажмите Run, чтобы запустить скрипт. Результат отслеживания будет сохранен в качестве другого файла точечного коврика, а генерируемые треки будут построены. Оценить качество треков.Сначала дважды щелкните точку отслеживания проверки M и измените имя файла на соответствующее имя точка tif. Затем нажмите на трек имени файла, чтобы использовать файл коврика точки треков и нажмите запустить. В окне рисунка используйте нижнюю планку прокрутки для выбора ядра.Выбранное ядро будет обведено красным цветом, а траектория выбранной ячейки может быть соблюдена во времени с помощью верхней планки прокрутки. Зеленые кресты указывают на обнаруженные ядра. Распространение и дифференциация сильно нарушены в миобластах, культурных с Hoechst.По сравнению с myoblast изолированы от H2BGFP мышей и культурируются с доксициклина или дикого типа, миозин тяжелой цепи помечены миобласты. Визуализация живых клеток с первичными миобластами, выражаюми белок H2BGFP, позволяет отслеживать ядра во время дифференциации. Слитые изображения передачи в каналах GFP в начальных и конечных точках времени периода дифференциации, позволяют идентифицировать миотуберы и, следовательно, ядра, которые в конечном итоге интегрируются в миотуберы или которые не сливаются в миотуберы.После визуализации с помощью конфокального микроскопии флуоресценции ядра могут быть сегментированы, как это было продемонстрировано, а преобразование водораздела может быть использовано для разъединения близлежащих объектов. При этом подходе большинство ядер идентифицируются на изображении, что позволяет отслеживать движение ядер, как это попродемонстрировано. Например, кажется, что общая длина траекторий немного выше для клеток, окрашенных Hoechst.Хотя разница не является значительным. Тем не менее, вычисление полного перемещения во время промежутка времени показывает, что общее перемещение клеток, окрашенных Hoechst значительно меньше, чем у необложных клеток. Как и предсказывалось, общая годовая вариация для необляхих клеток значительно меньше по сравнению с клетками, окрашенными в Hoechst.Важно следовать протоколу именно так, как это было продемонстрировано, в частности, при объединении технических навыков от биологических шагов с конфокальный микроскоп и программное обеспечение, используемое шаги. Для изучения дифференциации миобластов и ядерного позиционирования в другой интересной мышечной модели можно перенести изолированный миобласт с флуоресцентным ядерным белком. Этот метод проложил путь к изучению клеточной и ядерной динамики во время дифференциации мышц и дальнейшему исследованию дефектов в этих процессах.При различных патологических состояниях, таких как мышечная дистрофия.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Мышь эпителиальных клеток молочной форме Mammospheres Во лактогенный Дифференциация

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Флуоресцентная маркировка COS-7 выражая SNAP-теги Белки Fusion для живых изображений сотовый

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Определение вклада Energy Systems во время тренировки

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Анализ SNARE-опосредованного слияния мембран помощью ферментативного анализа слияния клеток

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell Imaging дегрануляции и секреции тромбоцитов под потоком

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...