Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el AFM Telethon e.v. (#21545) y por el Ospedale San Raffaele (OSR) semilla a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez desde el centro de análisis de imagen del Instituto Pasteur es reconocido por compartir públicamente sus rutinas MATLAB "Simple Tracker".

Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el San Raffaele institucional Animal cuidado y uso.
1. disección de los músculos del miembro posterior del ratón
<ol><li>Esterilice en autoclave pinzas y tijeras (rectas y curvas).</li>
	<li>Preparar y filtro (0,22 μm) todos los medios de comunicación (bloqueo medio, medio de digestión, medio de la proliferación y diferenciando medio) antes de empezar el experimento (véase Tabla de materiales).</li>
	...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Las fibras musculares (myofibers) son células multinucleadas que se forman por la fusión de las células musculares precursores (mioblastos) derivada de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación2,3, 4. Para evaluar la diferenciación de mioblastos, el procedimiento común consiste en el cultivo de mioblastos en diferenciar el medio y la fijación de las células en di...

Músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo humano, por un total de 35% - 40% de la masa del cuerpo1. Las células satélite son células madre de músculo, caracterizadas anatómicamente por su posición (yuxtapuesto a la membrana plasmática, por debajo de la lámina basal de las fibras musculares), que dan lugar a la proliferación de mioblastos (células progenitoras miogénica), que eventualmente diferenciar e integrar en myofibers existentes o fusible forma nuevo myofibers2,3,4. Su descubrimiento y los avances en el estudio de su biología ha llevado a importantes conocimientos en desarrollo muscular y la regeneración.
Protocolos para aislar y diferenciar mioblastos a miotubos han sido desarrollados hace muchos años y siguen siendo ampliamente utilizados para el estudio de diferenciación de músculo esquelético5,6,7. Sin embargo, la mayoría de estos métodos representan procedimientos estáticos que se basan en el análisis de las células fijas y, en consecuencia, no permiten a los científicos explorar procesos altamente dinámicos, como la fusión de mioblastos y maduración del myofiber. El ejemplo más llamativo es nuclear, que es estrictamente regulado, con los núcleos inicialmente en el centro de la myofiber y, luego, situado en la periferia después myofiber maduración8,9. En proyección de imagen es la técnica más adecuada para obtener mayor información sobre un fenómeno tan peculiar.
Aquí, describimos un método que permite a los científicos realizar diferenciación y myotube formación de mioblastos por microscopia Time-lapse y realizar análisis cuantitativos de seguimiento automático de núcleos mioblastos. Este método proporciona una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de comportamiento dinámica y mioblastos nuclear durante la diferenciación y la fusión. El protocolo se divide en cuatro partes diferentes, a saber: (1) la colección de músculos de los miembros posteriores de los ratones, (2) el aislamiento de mioblastos primario que consiste en la digestión mecánica y enzimática, la proliferación de mioblastos (3) y la diferenciación y (4) en vivo imagen de seguimiento de núcleos dentro de las 16 h de la diferenciación de mioblastos.
En el procedimiento siguiente, mioblastos aislados de ratones H2B-GFP y tratados con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B, como se describió anteriormente10. Alternativamente, es posible aislar los mioblastos de otros ratones transgénicos que expresan una proteína fluorescente en el núcleo o transfectar las células aisladas de ratones de tipo salvaje para expresar una proteína fluorescente en el núcleo, como se describe por Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Posicionamiento nuclear dentro de las células es importante para múltiples procesos celulares en el desarrollo y regeneración. El ejemplo más fascinante del posicionamiento nuclear ocurre durante la diferenciación del músculo esquelético. Las fibras musculares (myofibers) está formadas por la fusión de células precursoras de músculo (mioblastos) derivadas de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación de células multinucleadas. Correcta posición nuclear en myofibers es necesaria para la regeneración muscular adecuada y la función. El procedimiento común para evaluar la formación de la diferenciación y del myofiber mioblastos se basa en las células fijas analizadas por inmunofluorescencia, que impide el estudio del comportamiento de movimiento y de la célula nuclear con el tiempo. Aquí, describimos un método para el análisis de diferenciación y myofiber formación de mioblastos por proyección de imagen de células vivas. Ofrecemos un software para el seguimiento automatizado nuclear obtener una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de nuclear dinámica y comportamiento de mioblastos (es decir, la trayectoria) durante la diferenciación y la fusión.

Para seguir automáticamente movimiento nuclear durante la diferenciación de mioblastos en proyección de imagen de vivo, los núcleos deben preferentemente fluorescente etiquetarse. Es importante tener en cuenta que utilizando moléculas intercalantes de ADN no es factible porque estas moléculas interfieren con la proliferación y diferenciación de mioblastos primarios13. Por ejemplo, proliferación y diferenciación han sido analizados en primaria mioblastos c...

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Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Sin protocolo, es posible investigar el proceso dinámico de diferenciación de mioblast y formación de miofibra, en particular el posicionamiento nuclear mediante la explotación de imágenes de células vivas. Las imágenes celulares vivas de mioblast con núcleos celulares extraños permiten el estudio de la diferenciación de mioblast en células vivas y el seguimiento automático de los núcleos. La demostración visual ayuda a comprender cómo combinar el aislamiento de células primarias con imágenes en vivo y análisis de imágenes.Demostrando el procedimiento con Frederica Colombo, estará Giorga Careccia, estudiante de doctorado en nuestro laboratorio. Comience por cosechar el soleus tibialis, extensor digitorum longus, gastrocnemius, cuádriceps y músculos tríceps de ambas extremidades posteriores de un ratón adulto en un plato Petri de PBS en hielo. Usa tijeras y pinzas estériles para eliminar cuidadosamente los tendones y la grasa de cada músculo y transferir los músculos a una placa Petri vacía.Usando tijeras curvas estériles cortadas y picando los músculos hasta obtener una masa uniforme y transferir las piezas musculares a un tubo de 50 mililitros. Luego agregue 10 mililitros de medio de digestión a las piezas musculares para una incubación de 30 minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados a 250 rotaciones por minuto. Al final de la digestión enzimática, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de bloqueo.Y gira la muestra por centrifugación. Coloque el tubo sobre hielo y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros. Centrifugar el sobrenadante otra vez.Y re-suspende el pellet en un milímetro de DMEM. Suplementarlo con un diez por ciento de suero bovino fetal, o FBS, sobre hielo. Digerir el pellet reservado en 10 mililitros de medio de digestión fresca como acaba de demostrar y combinar el pellet digerido con la suspensión de la célula de reserva, sobre hielo.Tensar las células extraídas a través de un filtro de 70 micrómetros, seguido de un filtro de 40 micrómetros. Y lavar las células en 15 milímetros de DMEM fresco, complementado con 10 por ciento DE FBS. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tónifica de glóbulos rojos a temperatura ambiente.Detener la lelisis después de cinco minutos con 40 mililitros de PBS y una centrifugación adicional. Re-suspender el pellet en 20 mililitros de DMEM complementados con 10 por ciento FBS y pre-placa las células en plato Petri sin recubrimiento. Después de una hora a 37 grados centígrados y el cinco por ciento de dióxido de carbono recogen la célula del satélite que contiene sobrenadante.Y pre-placa la suspensión celular dos veces más como se demostró. Después del último chapado, recoger las células del satélite por centrifugación y volver a suspender el pellet en 40 mililitros de medio de proliferación fresca. Dividir las células entre dos colágeno recubiertos 150 mililitros Petri platos con un microgramo por mililitro de doxiciclina por plato para inducir la expresión H2BGFP.Y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante dos o tres días. Cuando los mioblastos hayan alcanzado la densidad experimental adecuada, lave las células en cada plato con cinco mililitros de PBS y separe las células de los fondos de la placa con dos mililitros de Tripppsin por plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Confirme el desprendimiento por microscopía ligera y detenga la reacción con cinco mililitros de DMEM más un diez por ciento de FBS por placa.Para la imagen de células vivas, placa dos veces diez a la quinta célula en cada pozo de una placa de 12 pozos recubierto con 350 microlitros de medio de diferenciación, complementado con matriz de membrana sótano por pozo durante dos horas. Cuando las células se hayan adherido a la parte inferior de la placa, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados y cinco por ciento en una etapa de microscopio confocal y utilice un objetivo 20 veces seco para obtener campos de visión con cientos de células para adquirir imágenes de 16 bits con 1024 por 1024 píxeles por fotograma cada seis minutos durante 16 horas. Para cada posición adquirida, genere un archivo tif de punto de varias tramas y descargue y extraiga el software de cremallera de puntos proporcionado en una carpeta seleccionada.Abra el ejemplo de la carpeta de seguimiento de segmentación y haga clic en hacer el punto de segmentación M para abrir la ventana de comandos en Matlab. Cambie los scripts de punto M de la segmentación debida para que la pista de nombre de archivo variable sea el nombre del archivo tif y la pista de entrada de ruta de acceso sea la carpeta donde está contenido el tif de punto. Haga clic en Ejecutar para ejecutar el script.El resultado de la segmentación se guardará como una estera de puntos de archivo, mientras que la segmentación de los núcleos se puede visualizar en la figura de salida. Para generar las pistas, primero haga doble clic en generar pistas punto M en la misma carpeta de trabajo. A continuación, cambie el nombre de archivo para que el nombre de archivo apunte el archivo de tapete de punto adecuado para los núcleos segmentados.Haga clic en Ejecutar para ejecutar el script. El resultado del seguimiento se guardará como otro archivo de alfombra de puntos y las pistas generadas se trazarán. Evaluar la calidad de las pistas.En primer lugar, haga doble clic en el punto de seguimiento de comprobación M y modifique el nombre de archivo al nombre de tif de punto adecuado. A continuación, haga clic en la pista de nombre de archivo para utilizar el archivo de alfombra de puntos de las pistas y haga clic en ejecutar. En la ventana de la figura utilice la barra de desplazamiento inferior para seleccionar el núcleo.El núcleo seleccionado se rodeará en rojo, y la trayectoria de la celda seleccionada se puede seguir en el tiempo utilizando la barra de desplazamiento superior. Las cruces verdes indican los núcleos detectados. La proliferación y la diferenciación se ven fuertemente deterioradas en los mioblastos cultivados con Hoechst.En comparación con los ratones aislados de H2BGFP y cultivados con doxiciclina o tipo salvaje, la cadena pesada de miosina etiquetaba mioblastos. La imagen celular en vivo con mioblastos primarios que expresan la proteína H2BGFP permite el seguimiento de los núcleos durante la diferenciación. Las imágenes combinadas de transmisión en los canales GFP en los puntos de tiempo inicial y final del período de diferenciación, permiten la identificación de miotubos y, en consecuencia, núcleos que terminan integrándose en miotubos o que no se fusionan en miotubos.Después de la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia confocal, los núcleos se pueden segmentar como se demuestra y la transformación de la cuenca hidrográfica se puede utilizar para separar objetos cercanos. Con este enfoque, la mayoría de los núcleos se identifican en la imagen, lo que permite realizar un seguimiento del movimiento de los núcleos como se demuestra. Por ejemplo, parece que la longitud total de las trayectorias es ligeramente mayor para las celdas teñidas con Hoechst.Aunque la diferencia no es significativa. Sin embargo, el cálculo del desplazamiento total durante un lapso de tiempo revela que el desplazamiento total de las celdas teñidas con Hoechst es significativamente menor que el de las celdas no manchadas. Como se predijo, la variación anual total de las células no manchadas es significativamente menor en comparación con las células teñidas con Hoechst.Es importante seguir el protocolo exactamente como se ha demostrado en particular al combinar las habilidades técnicas de los pasos biológicos con el microscopio confocal y los pasos utilizados por el software. Para estudiar la diferenciación de mioblastos y el posicionamiento nuclear en otro modelo muscular de interés es posible transferir mioblast aislado con proteína nuclear fluorescente. Esta técnica allanó el camino para explorar la dinámica celular y nuclear durante la diferenciación muscular y para investigar más a fondo los defectos en estos procesos.Bajo diversas condiciones patológicas como distrofias musculares.

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The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...