Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Detta arbete var stöds av AFM-Telethon att E.V. (#21545) och Ospedale San Raffaele (OSR) utsäde bidraget till S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez från navet bild analys av Institut Pasteur är erkänt för att offentligt dela sin ”enkel Tracker” MATLAB-rutiner.

Alla förfaranden som berör animaliska ämnen godkändes av San Raffaele institutionella djur vård och användning kommittén.
1. dissektion av mus bakbenet muskler
<ol><li>Sterilisera pincett och sax (både raka och böjda) i autoklav.</li>
	<li>Förbereda och filtrera (0,22 µm) alla medier (blockerande medel, matsmältningen medium, frodas medium, och differentiera medium) innan experimentet (se Tabell för material).</li>
	<li>Lägg 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler som bildas genom fusion av prekursorer muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering2,3, 4. För att bedöma gorgina differentiering, består det gemensamma förfarandet av odlingsskålar myoblasts gäller att differentiera medium och åtgärda cellerna vid olika tidpunkter att utföra immunofluorescen...

Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i den mänskliga kroppen, totalt 35-40% av kroppen massa1. Satellit celler är muskelstamceller, anatomiskt kännetecknas av deras position (kontrasteras till plasmamembranet, under den basala lamina av muskelfibrer), som ger upphov till prolifererande myoblasts (myogenic progenitorceller), som så småningom differentiera och integrera i befintliga myofibers eller säkring till formuläret ny myofibers2,3,4. Deras upptäckt och framsteg i studien av deras biologi har lett till betydande insikter i muskelutveckling och förnyelse.
Protokoll att isolera och differentieras myoblasts till myotubes har utvecklats för många år sedan och fortfarande ofta används för att studera skelettmuskulaturen differentiering5,6,7. De flesta av dessa metoder utgör dock statiska procedurer som förlitar sig på en analys av fasta celler och, följaktligen, inte tillåter forskare att fullt utforska högdynamiska processer, såsom gorgina fusion och myofiber mognad. Det mest slående exemplet är kärnkraft positionering, som är hårt reglerad, med kärnor från början i mitten av myofiber och, sedan, ligger på periferin efter myofiber mognad8,9. Levande imaging är den lämpligaste tekniken för att få ytterligare insikter om sådant märkliga fenomen.
Här beskriver vi en metod som gör det möjligt för forskare att registrera gorgina differentiering och myotube bildandet av time-lapse Mikroskopi och utföra kvantitativa analyser från automatisk spårning av gorgina atomkärnor. Denna metod ger en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende under differentiering och fusion. Protokollet är uppdelad i fyra olika delar, nämligen (1) samling av muskler från bakbenen av möss, (2) isolering av primära myoblasts som består i mekaniska och enzymatisk nedbrytning, (3) gorgina proliferation och differentiering och (4) Live imaging att spåra atomkärnor inom de första 16 h gorgina differentiering.
I följande procedur, är myoblasts isolerade från H2B-GFP möss och behandlas med 1 µg/mL av doxycyklin att inducera H2B-GFP uttryck, som tidigare beskrivits10. Alternativt är det möjligt att isolera myoblasts från andra transgena möss som uttrycker ett fluorescerande protein i cellkärnan eller transfect celler isolerade från vildtyp möss att uttrycka ett fluorescerande protein i cellkärnan, som beskrivs av Pimentel et al. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Nukleära positionering inom celler är viktigt för flera cellulära processer i utveckling och förnyelse. Det mest spännande exemplet på nukleära positionering sker under skelettmuskulaturen differentiering. Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler bildas genom fusion av föregångare muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering. Korrekt nukleära positionering inom myofibers krävs för korrekt muskel förnyelse och funktion. Det enhetliga förfarandet att bedöma gorgina differentiering och myofiber bildandet är beroende av fasta cellerna analyseras av immunofluorescens, vilken hindrar studiet av kärntekniska rörelsen och cell beteende över tid. Här, beskriver vi en metod för analys av gorgina differentiering och myofiber bildandet av levande cell imaging. Vi erbjuder en programvara för automatiserad nukleära tracking för att få en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende (dvs banan) under differentiering och fusion.

Att automatiskt följa kärntekniska rörelsen under gorgina differentiering i levande imaging, bör företrädesvis atomkärnor märkas fluorescently. Det är viktigt att notera att använda DNA-infoga molekyler inte är möjligt eftersom dessa molekyler störa proliferation och differentiering av primära myoblasts13. Som ett exempel, har proliferation och differentiering analyserats i primära myoblasts odlade med eller utan Hoechst (figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Att utnyttja levande Imaging till spår kärnor under gorgina differentiering och Fusion

Skelettmuskulaturen differentiering är en mycket dynamisk process, som särskilt bygger på nukleära positionering. Här, beskriver vi en metod att spåra atomkärnor rörelser av levande cell imaging under gorgina differentiering och myotube bildning och utföra en kvantitativ karakterisering av atomkärnor dynamik genom att extrahera information från automatisk spårning.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Utan protokoll är det möjligt att undersöka den dynamiska processen för myoblast differentiering och myofiberbildning, i synnerhet kärnpositionering genom att utnyttja levande cell avbildning. Live cell imaging av myoblast med främmande cellkärnor tillåta studiet av myoblast differentiering i levande celler och den automatiska spårning av kärnorna. Visuell demonstration hjälper till med att förstå hur man kombinerar primär cellisolering med livebildtagning och bildanalys.Demonstrera förfarandet med Frederica Colombo, kommer att Giorga Careccia, en doktorand i vårt laboratorium. Börja med att skörda tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps och triceps muskler från båda bakbenen av en vuxen mus i en Petri maträtt pbs på is. Använd steril sax och pincett för att försiktigt ta bort senor och fett från varje muskel och överföra musklerna till en tom Petriskål.Använda steril böjda sax skära och finhacka musklerna tills en enhetlig massa erhålls och överföra muskelbitarna till en 50 milliliter tub. Tillsätt sedan 10 milliliter av digestion medium till muskelbitarna för en 30 minuters inkubation i en 37 graders celsius vattenbad på 250 rotationer per minut. I slutet av den enzymatiska matsmältningen, stoppa reaktionen med 10 milliliter blockerande medium.Och snurra ner provet genom centrifugeringen. Placera röret på is och överför supernatanten till ett nytt 50 milliliterrör. Centrifugera supernatanten igen.Och åter avbryta pelleten i en millimeter av DMEM. Komplettera den med tio procent fetala nötkreatur serum, eller FBS, på is. Smält den reserverade pelleten i 10 milliliter färskt matsmältningsmedium som just visat och kombinera den smälta pelleten med reservcellsupphängningen, på is.Sila de dragna cellerna genom ett 70-mikrometerfilter, följt av ett 40-mikrometerfilter. Och tvätta cellerna i 15 millimeter färsk DMEM, kompletterad med 10 procent FBS. Vid slutet av centrifugeringen, åter upphäva pelleten i tre milliliter av röda blodkroppar lys buffert vid rumstemperatur.Stoppa lysen efter fem minuter med 40 milliliter PBS och en extra centrifugering. Åter upphäva pelleten i 20 milliliter DMEM kompletteras med 10 procent FBS och pre-plate cellerna i obestruket Petriskål. Efter en timme vid 37 grader celsius och fem procent koldioxid samla satellitcellen innehåller supernatant.Och pre-plate cellen suspensionen ytterligare två gånger som visat. Efter den sista pläteringen, samla satellitcellerna genom centrifugering och åter upphäva pelleten i 40 milliliter av färskt spridningsmedium. Den dela cellerna mellan två kollagen belagda 150 milliliter Petriskålar med ett mikrogram per milliliter av doxycyklin per maträtt för att inducera H2BGFP uttryck.Och återför cellerna till cellodlingsinkubatorn i två eller tre dagar. När myoblasterna har nått lämplig experimentell densitet, tvätta cellerna i varje skål med fem milliliter PBS och lossa cellerna från tallrikbottnar med två milliliter Trypsin per skålen vid 37 grader celsius i fem minuter. Bekräfta lossning genom lätt mikroskopi och stoppa reaktionen med fem milliliter DMEM plus tio procent FBS per platta.För levande cell imaging, platta två gånger tio till de femte cellerna i varje brunn av en 12 väl platta belagd med 350 mikroliter av differentiering medium, kompletterad med källaren membran matris per brunn i två timmar. När cellerna har anslutit sig till botten av plattan, placera plattan i en 37 grader celsius och fem procent koldioxid inkubator på en konfokal mikroskop skede och använda en 20 gånger torr mål att få synfält med hundratals celler att förvärva 16 bitars bilder med 1024 av 1024 pixlar per bild var sjätte minut i 16 timmar. För varje förvärvade position, generera en multi frame dot tif-fil och ladda ner och extrahera den punkt zip-programvara som tillhandahålls i en vald mapp.Öppna exemplet med segmenteringsspårningsmapp och klicka på gör segmenteringspunkt M för att öppna kommandofönstret i Matlab. Ändra de förfallna segmenteringspunktens M-skript så att variabeln filnamnspåret är namnet på tif-filen och sökvägsindataspåret är den mapp där punkten tif finns. Klicka på kör för att köra skriptet.Resultatet av segmenteringen kommer att sparas som en fil punkt matta, medan segmentering av atomkärnor kan visualiseras i utdata siffran. Om du vill generera spåren, dubbelklickar du först på Generera spår punkt M i samma arbetsmapp. Därefter ändrar du filnamnet till filnamn peka lämplig punkt Mat fil för segmenterade atomkärnor.Klicka på Kör om du vill köra skriptet. Resultatet av spårningen kommer att sparas som en annan punkt matta fil och de genererade spåren kommer att ritas. För att utvärdera kvaliteten på spåren.Dubbelklicka först på checkspårningspunkten M och ändra filnamnet till lämpligt punkt tif-namn. Klicka sedan på filnamnsspåret om du vill använda spårens punktmattfil och klicka på kör. I figurfönstret använd den nedre rullningslisten för att välja kärnan.Den valda kärnan kommer att ringas in i rött, och banan för den valda cellen kan följas i tid med hjälp av den övre rullningslisten. Gröna kors indikerar de upptäckta kärnorna. Spridning och differentiering är starkt nedsatt i myoblasts odlade med Hoechst.Jämfört med myoblast är isolerade från H2BGFP möss och odlade med doxycyklin eller vild typ, myosin tung kedja märkt myoblaster. Live cell imaging med primära myoblasts uttrycker H2BGFP proteinet tillåter spårning av atomkärnorna under differentiering. Sammanslagna bilder av överföring i GFP-kanaler vid de inledande och sista tidpunkterna för differentieringsperioden, tillåta identifiering av myotubes och följaktligen kärnor som hamnar integrera i myotubes eller som inte smälter samman i myotubes.Efter avbildning genom confocal fluorescensmikroskopi, kan kärnorna segmenteras som visat och vattendelare omvandla kan användas för att separera närliggande objekt. Med detta tillvägagångssätt identifieras de flesta av kärnorna i bilden, vilket gör att kärnorna rörelse som ska spåras som visats. Till exempel verkar det som om den totala längden på banor är något högre för celler färgas med Hoechst.Även om skillnaden inte är betydande. Uträkning av den totala förskjutningen under en tidsförlopp avslöjar dock att den totala förskjutningen av cellerna som färgats med Hoechst är betydligt mindre än för obefläckade celler. Som förutspått den totala årliga variationen för de obefläckade cellerna är betydligt mindre jämfört med celler som färgas med Hoechst.Det är viktigt att följa protokollet exakt som visats i synnerhet när man kombinerar de tekniska färdigheterna från de biologiska stegen med konfokalmikroskopet och programvaran som används steg. Att studera myoblast differentiering och nukleära positionering i en annan muskel modell av intresse är det möjligt att överföra isolerade myoblast med fluorescerande kärnprotein. Denna teknik banade väg för att utforska cellulär och nukleär dynamik under muskeldifferentiering och att ytterligare undersöka defekter i dessa processer.Under olika patologiska tillstånd såsom Muskulära dystrophies.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Mus bröst epitelceller formen Mammospheres Under Lactogenic Differentiering

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

En praktisk inställning till genetiska inducerbara Fate Mapping: En visuell guide till Mark och spår celler In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Fastställande av bidrag Energy Systems under träning

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cellbildning av blodplättdiplanering och utsöndring under flöde

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Levande cellen fluorescensmikroskopi för att iaktta nödvändiga processer under mikrobiell celltillväxt

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...