Name: exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Bu eser AFM-Telethon E.V. (#21545) için ve Ospedale San Raffaele (OSR) tohum Grant için S.Z. (ZAMBRA5X1000) tarafından desteklenmiştir. Dr. Jean-Yves Tinevez Institut Pasteur görüntü analiz merkezden genel olarak onun "Basit izci" MATLAB rutinleri paylaşımı için kabul edilmektedir.

Hayvan konular içeren tüm yordamları San Raffaele kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. fare hindlimb kasları diseksiyon
<ol><li>Cımbız ve makas (düz ve eğri) tarafından ısıyla sterilize.</li>
	<li>Hazırlamak ve deney başlamadan önce tüm medya (engelleme orta, sindirim orta, orta Proliferasyona ve orta ayırt) (0,22 µm) filtre ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL 35 mm kas koleksiyonu için ...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration.">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li><li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells/Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans.">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).</li><li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle.">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. , (2017).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging.">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells.">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li><li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4.">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li><li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression.">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100 (2016).</li><li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation.">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central Available from: <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016)</li><li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).</li><li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering.">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li></ol>

Kas lifleri (myofibers) kas kök yayılması ve farklılaşma2,3tabi bu hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon kas öncüleri hücre (myoblasts) tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir, 4. Myoblast farklılaşma değerlendirmek için orta farklılaştırılması ve MyHC, bir işareti farklılaşma ve, boyama boyama ayirt gerçekleştirmek için farklı zaman noktalarda hücreleri tamir myoblasts Kültür ge...

Kas iskelet % 35-40 beden kitle%1toplam insan vücudundaki en büyük dokudur. Uydu hücrelerdir kas kök hücre, anatomik olarak karakterize Proliferasyona myoblasts (myogenic progenitör hücre) ortaya çıkmasına, (kas liflerinin Bazal lamina altından plazma zarı için bitişik), onların konuma göre hangi sonunda ayırt etmek ve varolan myofibers entegre ve/veya sigorta formu yeni myofibers2,3,4' e. Onların keşif ve biyolojilerinin çalışma sürüyor kas geliştirme ve yenileme önemli anlayışlar için açmıştır.
Protokolleri yalıtmak ve myoblasts myotubes ayırt etmek için yıllar önce geliştirilmiş ve hala yaygın olarak kas iskelet farklılaşma5,6,7incelemek için kullanılır. Ancak, bu yöntemlerin çoğu sabit hücreleri analizine dayanan ve sonuç olarak, bilim adamları tam olarak myoblast fusion ve myofiber olgunlaşma gibi son derece dinamik süreçler keşfetmek izin vermez statik yordamlar temsil eder. En çarpıcı örnek nükleer konumlandırma, hangi sıkıca başlangıçta myofiber merkezinde çekirdek ile düzenlenir ve, sonra sonra myofiber olgunlaşma8,9çevre bulunan olmasıdır. Canlı görüntüleme daha da kendine özgü bir fenomen anlayışlar elde etmek için en uygun bir tekniktir.
Burada, bilim adamları tarafından hızlandırılmış mikroskopi myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu kaydetmek için ve kantitatif analizleri myoblast çekirdeği otomatik izleme üzerinden gerçekleştirmek için sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem yüksek üretilen iş bir nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış sırasında farklılaşma ve füzyon sağlar. Protokol dört farklı parçalar, yani kas fareler, (2) hindlimbs üzerinden (1 topluluğu mekanik ve Enzimatik sindirim, (3) myoblast yayılması ve farklılaşma ve (4) oluşan birincil myoblasts yalıtım ayrılmıştır çekirdeği ilk 16 h myoblast farklılaşma içinde izlemek için görüntüleme yaşıyor.
Aşağıdaki yordamda, myoblasts H2B GFP fareler izole ve 1 µg/mL olarak yukarıda açıklanan10H2B GFP ifade ikna etmek için Doksisiklin ile tedavi. Alternatif olarak, myoblasts çekirdeği floresan bir protein hızlı diğer transgenik fareler gelen izole veya çekirdek, floresan bir protein hızlı farelerde vahşi-tip üzerinden Pimentel ve ark tarafından açıklandığı gibi izole hücreler transfect mümkündür. 9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>chicken embryos extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE-650-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9263-1G</td>
			<td>125units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.78 units/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxyciclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red blood cells lysis medium</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>40 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase</td>
			<td>70 mg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proliferation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>20%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutammine</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>1 &#8240;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chichen embryo extract</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered 0.22um</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploiting live imaging to track nuclei during myoblast differentiation and fusion

Nükleer içindeki hücreleri konumlandırma geliştirme ve yenileme içinde birden çok hücresel süreçler için önemlidir. Nükleer konumlandırma en ilginç örnek kas iskelet farklılaşma sırasında oluşur. Kas lifleri (myofibers) kas öncül hücreleri (myoblasts) kas kök bu yayılma ve farklılaşma geçmesi hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir. Doğru nükleer myofibers içinde konumlandırma uygun kas rejenerasyon ve işlevi için gereklidir. Sabit hücreleri tarafından incelendi nükleer hareketi ve hücre davranış çalışmanın zaman içinde engellemektedir ayirt myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu değerlendirmek için genel yordamı kullanır. Burada, canlı hücre görüntüleme tarafından myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir yüksek-den geçerek nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış (yani, yörünge) sırasında farklılaşma ve füzyon elde etmek nükleer otomatik izleme için bir yazılım sağlar.

Otomatik olarak myoblast farklılaşma canlı görüntüleme sırasında nükleer hareketi takip etmek, çekirdeklerin tercihen fluorescently biçiminde etiketlenmiş olmalıdır. Bu moleküller nükleer silahların yayılmasına karşı birincil myoblasts13farklılaşma ile müdahale çünkü DNA enterkalasyon molekülleri kullanarak mümkün olmadığını unutmamak gerekir. Örnek olarak, yayılmasını önleme ve farklılaşma birincil myoblasts ile ya da ezel?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion at JoVE.com

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Protokol olmadan, canlı hücre görüntülemesi nden yararlanılarak miyoblast farklılaşması ve miyofiber oluşumunun dinamik sürecini, özellikle nükleer konumlandırmayı araştırmak mümkündür. Yabancı hücre çekirdekleri ile miyoblast Canlı hücre görüntüleme canlı hücrelerde miyoblast farklılaşması ve çekirdeklerin otomatik izleme çalışma sağlar. Görsel gösteri, birincil hücre izolasyonu ile canlı görüntüleme ve görüntüleme analizinin nasıl birleştirilebildiğini anlamada yardımcı olur.Frederica Colombo ile prosedürü gösteren, Giorga Careccia, bizim laboratuvarda bir doktora öğrencisi olacaktır. Tibialis soleus, ekstansör digitorum longus, gastroknemius, kuadriseps ve yetişkin bir farenin her iki arka ekstremitesinden triceps kasları buz üzerinde PBS bir Petri kabına hasat ile başlayın. Her kastendinin tendonu ve yağını dikkatlice çıkarmak ve kasları boş bir Petri kabına aktarmak için steril makas ve cımbız kullanın.Tek tip bir kitle elde edilene kadar kasları kesip kıyasve karmayı steril kavisli makas kullanarak ve 50 mililitrelik bir tüp kas parçaları aktarın. Sonra dakikada 250 rotasyonlar bir 37 derece santigrat su banyosu nda 30 dakikalık bir kuluçka için kas parçaları sindirim orta 10 mililitre ekleyin. Enzimatik sindirim sonunda, bloke orta 10 mililitre ile reaksiyonu durdurun.Ve örneği santrifüjle aşağı çevirin. Tüpü buza yerleştirin ve süpernatant'ı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Yine süpernatant santrifüj.Ve bir milimetrelik DMEM'de peleti yeniden askıya alın. %10 fetal büyükbaş serumu ya da FBS ile buz üzerinde tamamla. Sadece gösterildiği gibi taze sindirim ortamı 10 mililitre ayrılmış pelet sindirin ve rezerv hücre süspansiyon ile sindirilmiş pelet birleştirmek, buz üzerinde.Çekilen hücreleri 70 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve ardından 40 mikrometrelik bir filtre uygulayın. Ve hücreleri 15 milimetre taze DMEM'de yıkayın, yüzde 10 FBS ile tamamlayın. Santrifüj sonunda, oda sıcaklığında kırmızı kan hücre lisis tampon üç mililitre pelet yeniden askıya.40 mililitre PBS ve ek bir santrifüj ile beş dakika sonra lysis durdurma. DMEM 20 mililitre pelet yeniden askıya 10 yüzde FBS ile desteklenir ve ön plaka hücreleri kaplamasız Petri çanak. 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit bir saat sonra supernatant içeren uydu hücresi toplamak.Ve ön plaka hücre süspansiyonu gösterildiği gibi iki kez daha. Son kaplama sonra, santrifüj ile uydu hücreleri toplamak ve taze çoğalma orta 40 mililitre pelet yeniden askıya. H2BGFP ekspresyonu indüklemek için iki kollajen kaplı 150 mililitre Petri yemekleri arasında hücreleri bölünmüş yemek başına doksisiklin başına bir mikrogram ile.Ve hücreleri iki ya da üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Miyoblastlar uygun deneysel yoğunluğa ulaştığında, her tabaktaki hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri tabak diplerinden, tabak başına iki mililitre Trypsin ile 5 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede ayırın. Işık mikroskobu ile kopmayı onaylayın ve plaka başına beş mililitre DMEM artı %10 FBS ile reaksiyonu durdurun.Canlı hücre görüntüleme için, plaka iki saat boyunca iyi başına bodrum membran matris ile desteklenen, farklılaşma orta 350 mikrolitre ile kaplanmış bir 12 iyi plaka her kuyu içine beşinci hücrelere iki kez on. Hücreler plakanın altına yapıştığında, plakayı konfokal mikroskop aşamasına 37 derece ve yüzde beş karbondioksit kuvöze yerleştirin ve 16 saat boyunca her altı dakikada bir 1024 ile 16 bit görüntü elde etmek için yüzlerce hücreyle görüş alanlarını elde etmek için 20 kat kuru bir hedef kullanın. Edinilen her konum için, çok kareli nokta tif dosyası oluşturun ve seçili bir klasörde sağlanan nokta zip yazılımını karşıdan yükleyin ve ayıklayın.Segmentasyon izleme klasörü örneğini açın ve Matlab'daki komut penceresini açmak için segmentasyon nokta M'yi tıklatın. Değişken dosya adı parçasıtif dosyasının adı ve yol giriş parçası nokta tif'in bulunduğu klasör olacak şekilde son bölümlendirme nokta M komut dosyalarını değiştirin. Komut dosyasını çalıştırmak için çalıştır'ı tıklatın.Segmentasyon sonucu bir dosya nokta paspas olarak kaydedilir, çekirdeklerin segmentasyonu çıkış şeklinde görselleştirilmiş olabilir. Parçaları oluşturmak için, ilk çift tıklatma aynı çalışma klasöründe nokta M parçalarını oluşturur. Ardından, dosya adını, parçalı çekirdekler için uygun nokta Mat dosyasını işaret etmek için değiştirin.Komut dosyasını çalıştırmak için Çalıştır'ı tıklatın. İzleme nin sonucu başka bir nokta paspas dosyası olarak kaydedilir ve oluşturulan parçalar çizilir. Parçaların kalitesini değerlendirmek için.Önce onay izleme nokta M'yi çift tıklatın ve dosya adını uygun nokta tif adı ile değiştirin. Ardından parçaların nokta mat dosyasını kullanmak için dosya adı parçasını tıklatın ve çalıştır'ı tıklatın. Şekil penceresinde çekirdeği seçmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın.Seçili çekirdek kırmızı daire içine alınacak ve seçilen hücrenin yörüngesi üst kaydırma çubuğu kullanılarak zamanında izlenebilir. Yeşil haçlar tespit edilen çekirdekleri gösteriyor. Hoechst ile kültürlü miyoblastlarda proliferasyon ve farklılaşma güçlü bir şekilde bozulur.Miyoblastın H2BGFP farelerinden izole edilmesiyle karşılaştırıldığında ve doksisiklin veya yabani tipile kültürlenmiş miyozin ağır zincir miyoblastlar olarak etiketlenmiştir. H2BGFP proteinini ifade eden primer miyoblastlar ile canlı hücre görüntülemesi farklılaşma sırasında çekirdeklerin izlenmesine olanak sağlar. Farklılaşma döneminin ilk ve son zaman noktalarında GFP kanallarında iletimin birleştirilmiş görüntüleri, miyotüplerin ve dolayısıyla miyotüplere entegre olan veya miyotube'lara kaynaşmayan çekirdeklerin tanımlanmasına olanak sağlar.Konfokal floresan mikroskopisi ile görüntüleme den sonra, çekirdekler gösterildiği gibi bölünebilir ve havza dönüşümü yakındaki nesneleri ayırmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımla, çekirdeklerin çoğu görüntüde tanımlanır ve çekirdek hareketinin gösterildiği gibi izlenmesine izin verilir. Örneğin, yörüngelerin toplam uzunluğu Hoechst ile boyanmış hücreler için biraz daha yüksek görünür.Aradaki fark önemli olmasa da. Ancak, bir zaman atlamalı sırasında toplam deplasman hesaplama Hoechst ile lekeli hücrelerin toplam yerinden lekesiz hücrelerin önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koymaktadır. Tahmin edildiği gibi lekelenmemiş hücreler için toplam yıllık varyasyon Hoechst ile lekeli hücrelere göre önemli ölçüde daha küçüktür.Biyolojik adımlardaki teknik becerilerin konfokal mikroskop ve kullanılan yazılımlarla birleştirilmesinde protokolün özellikle gösterildiği gibi takip etmek önemlidir. İlgi başka bir kas modelinde miyoblast farklılaşması ve nükleer konumlandırmayı incelemek için izole miyoblastı floresan nükleer protein ile aktarmak mümkündür. Bu teknik, kas farklılaşması sırasında hücresel ve nükleer dinamikleri keşfetmenin ve bu süreçlerdeki kusurların daha da araştırılmasının yolunu açmıştır.Kas distrofileri gibi çeşitli patolojik koşullar altında.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Egzersiz sırasında Enerji Sistemlerinin Katkısı Belirlenmesi

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...