Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

دعمت هذا العمل جزئيا بالمنح البحثية الجبهة الإسلامية للإنقاذ (PS12/00866) من معهد الصحة كارلوس الثالث، مدريد، إسبانيا؛ ش الفقرة Europeo فوندو التنمية الإقليمية (فدر)؛ الأحمر لبحوث أون سيدا (RIS)، إيسسيي-ريتيك (RD16/0025/0002) وبرنامج سيركا/محافظة كاتالونيا. يشكر المؤلفون ريتروفيرولوجي والفيروسية مختبر إيمونوباثولوجي من معهد d'Investigacions Biomèdiques آب/أغسطس Pi I سونير (إيديبابس). نشكر ت. Escribà وجيم-روفيرا هورتادو جيم للمساعدة و Cufí س. من مكتب نقل التكنولوجيا والمعرفة لتوجيهاتها في حماية الاختراع.

لهذه الدراسة، تم الحصول على الموافقة الخطية، علم من جميع المواضيع وموافقة اللجنة الأخلاقية (Comitè Ètic d 'Investigació Clínica،"مستشفى عيادة"، برشلونة؛ والموافقة على عدد شتلويرث/سداسي كلورو البنزين/2014).
1-إعداد الكولسترول-بنك دبي الوطني
<ol><li>حل بنك دبي الوطني-الكوليسترول (494.63 ميغاواط؛ ...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

الكوليسترول المسمى الفلورسنت استراتيجية واعدة لتحليل والتحقيق في خصائص واستقلاب الكوليسترول الطبيعية في المختبر. مميزاتها الرئيسية هي أنه يمكن أن تتناولها الخلايا، ويسمح لداخل الخلية والغشاء توزيع الدراسات، ويمكن تطبيقها على نسبة الكولسترول في الدم افلوكس فحوصات مثل هذا البروتوكول (<s...

ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، هي الحالية الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم مرض القلب الاقفاري والسكتة الدماغية (في حساب إجمالي الوفيات 15.2 مليون)1. كلاهما أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية) التي يمكن أن تكون مسبوقة بتصلب الشرايين وتمزق لويحات عصيدة في الأوعية الدموية2،3.
تصلب الشرايين هو سفينة جدار مرض تحريضية التي الضامة وخلايا T وخلايا ماست والخلايا الجذعية التسلل البطانة وتتراكم في الدم، في نهاية المطاف تشكيل لويحات تصلب الشرايين. يقدم لويحات تصلب الشرايين الدهون البلورات الأساسية ونسبة الكولسترول في الدم، ويتضح من قياسات الموجات فوق الصوتية ب-وضع الاستبانة البطانية السباتي الوسائط سمك4،5. الضامة، ينفذ efflux الكولسترول نحو جزيئات الدهن يقبلون بالوسائل مستقبلات كاسيت (ABC) ملزمة ATP ABCA1، ATP ملزمة كاسيت الفصيلية ز الأعضاء 1 (ABCG1)، ومستقبلات الزبال ريال والثنائي. ويعتبر عدم التوازن في تدفق نسبة الكولسترول في الدم وافلوكس في الضامة عملية رئيسية في تصلب الشرايين بدء6. افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ويعتبر خطوة أساسية في القضاء على نسبة الكولسترول في الدم من الأنسجة الطرفية للبلازما والكبد في عملية تسمى الكوليسترول عكس النقل (RCT). يتم نقل الكوليسترول في الدم من الضامة أساسا إلى الابوليبوبروتين A1 (ApoA1) الموجودة على سطح جزيئات البروتين الدهني الكثافة (HDL). ثم النقل HDLs الكوليسترول إلى الكبد لإفراز وإعادة استعمال7،،من89.
تقليديا، الكولسترول وصفت الإذاعة التريتيوم (3ح) قد استخدمت في نسبة الكولسترول في الدم افلوكس10. إشارة الانبعاثات من النظائر المشعة هي حساسة للغاية10؛ ومع ذلك، يعرض الكولسترول وصفت الإذاعة المعوقات الواضحة مثل بروتوكولات طويلة وخطر التعرض للإشعاعات المؤينة، والحاجة إلى مرافق النشاط الإشعاعي الخاصة والمعدات لضمان المناولة الآمنة للانبعاثات المشعة. على العكس من ذلك، أدرجت الأسفار بنجاح في تقنيات التشخيص نظراً لبساطته في الكشف عن إشارة الفلورسنت، وتشكيله واسعة من فلوروفوريس المتاحة، و سلامة11. استخدمت عدة والاستيرولات المسمى الفلورسنت لدراسة الأيض نسبة الكولسترول في الدم بما في ذلك ديهيدرورجوستيرول (مع الأسفار الجوهرية)، والكوليسترول دانسيل، 4, 4-ديفلورو-3 أ، 4adiaza-s-إينداسيني (بوديبي)-نسبة الكولسترول في الدم، و 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (دبي-الكوليسترول في الدم). خاصة، يقدم بنك دبي الوطني-الكوليسترول كفاءة امتصاص في الخلايا البشرية12. اثنين مختلفة بنك دبي الوطني المسمى الكولسترول المتوفرة حاليا: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-بنك دبي الوطني) و 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-بنك دبي الوطني؛ الشكل 1). نسبة الكولسترول في الدم المسمى مع مجموعة 22-بنك دبي الوطني قد تناسب الدراسات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم، بينما 25-دبي-الكولسترول وهي تستخدم أساسا في الغشاء الخلوي ديناميات البحث13،14.
هي خطوط الخلايا المستخدمة عادة في نسبة الكولسترول في الدم في المختبر فحوصات efflux الوحيدات مثل الخلايا مثل الخلايا البشرية THP-1 المستمدة من سرطان الدم أو الخلايا 264.7 الخام موريني15J774.1. كل من هذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في الضامة في المختبر باستخدام phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، ولكن تعكس THP-1-المستمدة الضامة (دمثب-1) أفضل وتقليد الضامة البشرية16.
في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب الفائق فلورسنت لتحديد قدرة efflux الكولسترول عينات المصل في دمثب-1، باستخدام الكولسترول-22-بنك دبي الوطني كبديل ل [ح]3[-نسبة الكولسترول في الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، قارنا تقنية نيون الأمثل مع التناظرية المشعة القياسية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

تصلب الشرايين يؤدي إلى أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية). لا يزال غير واضح ما إذا كان تركيز الكوليسترول في الدم-الحميد (تشدل) يلعب دوراً سببية في تطور تصلب الشرايين. ومع ذلك، عاملاً هاما في المراحل الأولى من تشكيل اللوحة عصيدة هو الكوليسترول افلوكس القدرة على الحميد (قدرة جسيمات HDL على قبول نسبة الكولسترول في الدم من الضامة) تفاديا لتشكيل خلية الرغاوي. هذا خطوة أساسية في تجنب تراكم الكولسترول في البطانة وجزء من الكوليسترول عكس النقل (RCT) للقضاء على نسبة الكولسترول في الدم عن طريق الكبد. نسبة الكولسترول في الدم افلوكس القدرات للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية هو أداة واعدة التي يمكن استخدامها كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. وتقليدياً، [ح]3[-الكوليسترول وقد استخدمت في فحوصات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى وضع استراتيجية أكثر أماناً وأسرع استخدام الفلورية المسمى-الكوليسترول (دبي-الكوليسترول) في مقايسة خلوية لتتبع عملية امتصاص و efflux الكولسترول في الضامة THP-1-مشتقة. أخيرا، نحن تحسين وتوحيد الأسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.

هدف التحليل افلوكس نسبة الكولسترول في الدم تحديد في المختبر قدرة efflux الكولسترول مصل معين أو البلازما، أو المادة طافية تحتوي على جزيئات الكوليسترول الجيد. الأسلوب الذي يتكون من تحميل الكوليسترول المسمى إلى ثقافة خط خلية سنخية القياسية وحمل الاتصال مع عينة الاختبار المخفف في وسائل الإعلا?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

قياس القدرة افلوكس نسبة الكولسترول في الدم في المختبر للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية أداة واعدة كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول فلورسنت ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.

والرزن Efflux الفائق المسمى نيتروبينزوكساديازولي نسبة الكولسترول في الدم

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

هذا البروتوكول هو أسلوبنا القائم على الخلايا لإنهاء الكوليسترول في ارتجاع الكوليسترول في البلازما ceramal. خاصة في العروض. ويمكن تطبيق هذا لتشخيص مخاطر القلب والأوعية الدموية، وتحديد أو تقييم نسبة الكولسترول في الدم انخفاض الصيانة.هذه التقنية يتجنب المخاطر والأعباء والسلامة مع التعامل مع المواد المشعة من خلال توفير النتائج مع مستويات جودة مماثلة، لتلك التي ارتجاع الكوليسترول وقد أفيد أن المنتسبين مع وهكذا، يمكن مقارنة البلازما أو ارتجاع الكوليسترول ceramal من المقبولة، إلى التحكم المرجعي لدينا، وربما توفر خطر أن تعاني من هذه الطريقة سيتم تطبيقها أيضا على خطوط الخلية ، مثل خطوط الخلايا البشرية الأخرى أو حتى مراحل الماكرو الأولية. مراحل الماكرو أو الإنسان الناجم رذاذ زر الخلايا الجذعية. لبدء هذا الإجراء، حل الكولسترول NPD في الإيثانول النقي للحصول على حل الأسهم مع تركيز نهائي من اثنين من المايكرومولار.تخفيف 25 ميكرولترات من مخزون الكوليسترول في بنك دبي الوطني في AR 10 المتوسطة للوصول إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. الخلايا 1-1 في الثقافة 10 المتوسطة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل ثلاثة أيام ضبط كثافة الخلية إلى 300000 خلية لكل ملليلتر.ثم الحصول على لوحة 96-جيدا مع أسفل مسطحة واضحة. لتحسين التجانس، وإعداد 10 ملليلتر من الخلايا thp-1 في أنبوب 15 ملليلتر، وإضافة 200 ميكرولترات من المخزون PMA. مزيج بلطف والبذور 100 ميكرولترات من الخليط في آبار لوحة في 200، 000 خلية في البئر.واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة للتمييز بين الخلايا thp-1 في خلايا DM thp-1. أول تخفيف الجليسين في 10٪ برنامج تلفزيوني مع الماء المعقم، إلى تركيز 200 ميكرومولار في درجة الH 7.4. إضافة 40 ملليلتر من الجليسين المخفف إلى 10 غراما من ربط 8000 لإعداد حل ربط 20٪، ومزيج بقوة لتجانس.التالي تطبيق أربعة أجزاء من 20٪ لكل 10 أجزاء من العينة إلى كل عينة مصل أو البلازما في أنبوب 1.5 مل. يترك الخليط على الجليد لمدة 25 دقيقة. عجّلت الطرد المركزي ربط apolipoprotein B في 13000 مرات G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.تجاهل العجل، ونقل المابير إلى أنبوب جديد. استرداد لوحة تحتوي على الخلايا 1-1 hp متمايزة. إزالة وتجاهل الثقافة المتوسطة، ومن ثم غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS.إضافة 100 ميكرولترات من 5 micromolar MVD الكوليسترول في AR-10 المتوسطة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي تجاهل، تجاهل الوسيطة.غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 100 ميكرولترات عبدز، أو متقبل الدهون النقية المخفف في دورة في الدقيقة 1630 متوسطة إلى التركيز المطلوب إلى كل بئر. وتشمل السيطرة السلبية التي لا تحتوي على المقبولين الكوليسترول في السيطرة الإيجابية، كما هو مبين في بروتوكول النص، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات. وفي الوقت نفسه، إعداد مخزون 200 ملليلتر من حل تحلل الخلية واحد كما هو مبين في النص.اخلط هذا الحل مع الإيثانول، بنسبة حجمية واحدة إلى واحدة للحصول على حل التحلل أيضًا. لوسائل الإعلام والكشف عن الكوليسترول BD، وإزالة المتوسطة الخلية من لوحات في جمعها في لوحة بيضاء جديدة 96-well مع قاع مسطحة معتمة. إضافة 100 ميكرولترات من الإيثانول النقي إلى 100 ميكرولترات من كل عينة متوسطة للحصول على نسبة واحد إلى واحد في لوحة جديدة.باستخدام مقياس الإضاءة، وقياس شدة الفلورسنت في استثارة من 463 نانومتر، وانبعاثات من 536 نانومتر. للكشف عن الكوليسترول في بنك دبي الوطني داخل الخلايا، قم بغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. إضافة 100 ميكرولترات من محلول التحلل أيضا إلى كل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، في حين تهتز لمدة 25 دقيقة.بعد ذلك، قم بقياس شدة الفلورسنت مع ضبط معلمة الحساسية إلى 50 في البرنامج. ثم تحديد معدل الكولسترول efflux في التدبير النهائي للكوليسترول efflux كما هو مبين في بروتوكول النص. يخفف الكولسترول في الايثانول النقي ينتج أعلى قيم كثافة الفلورسنت بينما محتوى عال في محلول مائي، يقلل من الكثافة.وهذا يشير إلى أن انبعاث الفلورسنت من هذا الجزيء يعتمد اعتمادا كبيرا على الوسط، الذي يتم احتواؤه. عند استخدام مزيج من وسائل الإعلام والإيثانول بنسبة واحد إلى واحد، كثافة الفلورسنت ويبدو أن زيادة تناسبيا، مع تركيز التناظرية الكوليسترول، مما يشير إلى أن التحقيق يتصرف المناسبة في ظل هذه الظروف. لتحديد مقدار الوقت اللازم لاحتضان الخلايا المحملة مع المقبولين الكوليسترول، يتم حصاد وسائط الخلية في نقاط زمنية مختلفة.تطور الكولسترول efflux خطيا من صفر إلى ست ساعات، مع التقاط الإشارة القصوى بعد ست ساعات من إضافة عبدز إلى الخلايا. يتم اختبار عتبة التشبع والنطاق الديناميكي من خلال قياس efflux الكوليسترول في نسب مختلفة من HDL التي تحتوي على وسائل الإعلام. في الأصول الإنتاجية العالية ، تتطور efflux خطيا من واحد إلى 7 ٪ ABDS ، لتصل إلى ذروة قدرة efflux الكوليسترول بنسبة 7 ٪ عند تركيزات أعلى من 7 ٪ كثافة fluroescent يقلل في علاقة عكسية مع نسبة ABDS.ثم يتم تقييم أداء الأسلوب القائم على الفلوريسنس بمقارنته بالتقنية الراديوية القياسية التي تحمل علامة. وكلتا التقنيتين مترابطتان ترابطاً شديداً عند استخدام تركيزات مختلفة من الـ ABDS. الطريقة الموصوفة حساسة لزيادة تركيزات المقبول داخل قيم الكولسترول efflux بين خمسة و 15٪ من المهم التأكد من أن celluarizer يحتوي على أي مجاميع.النقطة الحرجة هي لتصنيف الإيثانول الكلي الذي يحتوي على بيئة، لقياس الفلوريسنس في الوزن المتجانس، والأمثل. بعد هذا الإجراء، يمكن قياس اسم الكوليسترول التقني، ويمكن تحديد تأثير الأدوية في مسار الكولسترول efflux. أيضا المدرسة في نهاية المطاف أن تستخدم كتشخيص لمخاطر القلب والأوعية الدموية.ونحن نعتقد أن هذه الطريقة أسهل بكثير وأكثر أمانا من الطريقة القياسية المشعة. ومع ذلك لا يزال تابعاً للخلية. يرجى تذكر أن الإيثانول قابل للاشتعال ويجب تخزينه والتعامل معه وفقا لذلك.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

الكولسترول الدفق الفحص

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

عالية الإنتاجية ELISA متسلسل للتأكد من صحة العلامات الحيوية من الأمراض الطعم ضد المضيف الحاد

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients