Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Dette arbejde er blevet delvist understøttet af forskningen tilskud FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og CERCA program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium af Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres bistand og S. Cufí fra viden og Technology Transfer Office for hendes vejledning i beskyttelse af opfindelsen.

For denne undersøgelse, blev etiske udvalg godkendelse (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona, godkendelsesnummer 2014-HCB-0756) og skriftligt, informeret samtykke fra alle fag indhentet.
1. NBD-kolesterol forberedelse
<ol><li>Opløse NBD-kolesterol (MW 494.63; Se Tabel af materialer) i ren ethanol for at hente stock (2 mM). En 10 mg hætteglas, opløse hele hætteglas indholdet i en 10.1 mL volumen af ethanol til at opnå en 2 mM bestand.</li>
...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

Lysstofrør-mærket kolesterol er en lovende strategi for at analysere og undersøge de egenskaber og metabolisme af naturlige kolesterol in vitro. Dens vigtigste fordele er at det kan tages op af celler, giver mulighed for intracellulære og membran distribution undersøgelser, og kan anvendes på cholesterol efflux assays som i denne protokol (figur 7). Nogle fluorescerende-mærket steroler tillade kolesterol sporing af in vitro-herunder BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegroste...

Ifølge World Health Organization er de nuværende hovedårsagerne til dødsfald på verdensplan iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde (regnskab for i alt 15,2 millioner dødsfald)1. Begge er hjerte-kar-sygdomme (CVD), der kan indledes med åreforkalkning og ruptur af atheroma plaques i blodkar2,3.
Åreforkalkning er en fartøj væg inflammatorisk sygdom, hvor makrofager, T-celler, mastceller og dendritiske celler infiltrere endotelet og akkumulere fra blodet, til sidst danner aterosklerotiske plaques. Aterosklerotiske plaques præsentere et lipid kerne og kolesterol krystaller, fremgår af høj opløsning B-mode ultralyd målinger af carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager udføres cholesterol efflux mod lipid acceptor partikler af middel til ATP-binding kassetten (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindende kassette underfamilie G medlem 1 (ABCG1) og scavenger-receptor SR-BI. Ubalance i kolesterol tilstrømning og efflux i makrofager betragtes som en vigtig proces i åreforkalkning indledning6. Cholesterol efflux betragtes som et afgørende skridt i kolesterol eliminering fra perifere væv til plasma og lever i en proces kaldet reverse kolesterol transport (RCT). Kolesterol er overført fra makrofager hovedsagelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) fundet på overfladen af high-density lipoprotein (HDL) partikler. HDLs derefter transportere cholesterol til leveren for udskillelse og genanvendelse7,8,9.
Traditionelt, har tritium (3H) radioaktivt mærket kolesterol været brugt i cholesterol efflux10. Emission signal af radioisotoper er meget følsomme10; dog præsenterer radioaktivt mærket kolesterol indlysende ulemper såsom lang protokoller, risiko for udsættelse for ioniserende stråling, og behovet for særlige radioaktivitet faciliteter og udstyr for at sikre sikker håndtering af radioaktivt udslip. Tværtimod er fluorescens blevet med held indarbejdet i diagnostiske teknikker på grund af sin enkelhed i fluorescerende signal detection, en lang række fluorophores tilgængelige, og dets sikkerhed11. Flere lysstofrør-mærket steroler har været brugt til at studere kolesterol metabolisme herunder dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol, og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Især præsenterer NBD-kolesterol en effektiv optagelse i humane celler12. To forskellige NBD mærket-kolesterol findes i øjeblikket: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol mærket med 22-NBD gruppe kan bedst passer til cholesterol efflux undersøgelser, mens 25-NBD-kolesterol bruges primært i cellulære membran dynamics forskning13,14.
Cellelinjer, der typisk anvendes i in vitro-cholesterol efflux assays er monocyt-lignende celler såsom leukæmi-afledte THP-1 celler, murine Raw 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse celler kan være differentieret til makrofager i vitro ved hjælp af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), men THP-1-afledt makrofager (dmTHP-1) bedste afspejler og efterligne det menneskelige makrofager16.
I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en Fluorescerende høj overførselshastighed metode til at bestemme cholesterol efflux kapaciteten af serumprøver på dmTHP-1, ved hjælp af 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. Desuden, sammenligner vi den optimerede fluorescerende teknik med den standard radioaktive analog.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Åreforkalkning fører til hjerte-kar-sygdom (CVD). Det er stadig uklart, om kolesterol-HDL (cHDL) koncentration spiller en kausal rolle for udvikling af åreforkalkning. Men en vigtig faktor i tidlige stadier af atheroma plaque dannelse er cholesterol efflux kapacitet til HDL (HDL partikler evne til at acceptere kolesterol fra makrofager) for at undgå skum celle dannelse. Dette er et vigtigt skridt for at undgå ophobning af kolesterol i endotelet og en del af reverse kolesterol transport (RCT) at fjerne kolesterol gennem leveren. Cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab, der kan bruges som biomarkør for åreforkalkning. Traditionelt [3H]-kolesterol er blevet brugt i cholesterol efflux assays. I denne undersøgelse, vi sigter mod at udvikle en sikrere og hurtigere strategi ved hjælp af fluorescerende mærket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulær assay at spore kolesterol optagelse og efflux proces i THP-1-afledt makrofager. Endelig, vi optimere og standardisere NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.

Cholesterol efflux assayet sigter mod at bestemme i vitro cholesterol efflux kapacitet på en given serum, plasma eller supernatanten indeholdende HDL partikler. Metoden består af Ilægning af mærket cholesterol i en kultur af en standard makrofag cellelinie og overtalelse kontakt med test prøven fortyndes i FBS-gratis medier med celler. Endelig, de fluorescerende niveauer fra NBD måles i medier og celle lysate. For at optimere målinger, blandes effluxed kolesterol fra cellerne til medierne med et volumen af et opl?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Måling af in vitro-cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab som en biomarkør for åreforkalkning. I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en fluorescerende NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.

Høj overførselshastighed Nitrobenzoxadiazole-mærket Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Denne protokol er vores celle baseret metode til kolesterol opsigelse af kolesterol refluks i ceramal plasma. Især i screeninger. Dette kan anvendes til at diagnosticere hjerte-kar-risiko, og til at identificere eller evaluere kolesterol lavere vedligeholdelse.Denne teknik undgår risiko og byrder som sikkerhed for med håndtering udstrålede materialer ved at give resultater med sammenlignelige kvalitetsniveauer, at dem af kolesterol refluks er blevet rapporteret til at associere med Således plasma eller ceramal kolesterol refluks af accepterede kan sammenlignes, at vores referencekontrol og kan give risiko for at lide af Denne metode vil også blive anvendt på cellelinjer , ligesom andre menneskelige cellelinjer eller endda primære makrofaser. Makrofaser eller og menneskeskabte sprayknap stamceller. For at begynde denne procedure opløses NPD-kolesterol i ren ethanol for at opnå en stockopløsning med en endelig koncentration af to mikromolar.Fortyndet 25 mikroliter af NBD-kolesterollageret i AR 10-mediet for at nå en endelig koncentration på fem mikromolar. Kultur thp-1 celler i vores 10 medium ved 37 grader celsius med 5% kuldioxid. Hver tredje dag justeres celletætheden til 300000 celler pr. milliliter.Derefter fås en 96-brønd plade med en flad klar bund. For bedre homogenisering, forberede en 10 milliliter thp-1 celler i en 15 milliliter rør, og tilsæt 200 mikroliters PMA lager. Bland forsigtigt og frø 100 mikroliter af blandingen i pladebængserne ved 200, 000 celler pr brønd.Og inkubere ved 37 grader celsius med 5% kuldioxid i 48 til 72 timer for at differentiere thp-1 celler i DM thp-1 celler. Første fortyndet glycin i 10% PBS med sterilt vand, til en koncentration på 200 mikromolar ved pH 7,4. Tilsæt 40 milliliter fortyndet glycin til 10 gram pind 8000 for at forberede en 20%peg opløsning, og bland kraftigt for at homogenisere.Dernæst påføres fire dele af 20 % pr. 10 prøvedele på hver serum- eller plasmaprøve i et 1,5 ml rør. Lad blandingen blive på is i 25 minutter. Centrifuge pinden apolipoprotein B udfældet ved 13000 gange G, og ved fire grader celsius i 15 minutter.Kassér bundfaldet, og overfør supernatanten til et nyt rør. Hent pladen, der indeholder de differentierede thp-1 celler. Fjern og kassér kulturmediet, og vask derefter cellerne to gange med 1X PBS.Tilføj 100 mikroliter af 5 micromolar MVD kolesterol i AR-10 medium til hver brønd. Inkubere natten over ved 37 grader celsius med 5% kuldioxid. Den næste dag kasseres, kasseres mediet.Vask cellerne to gange med PBS, og tilsæt derefter 100 mikroliter ABDS, eller renset lipid acceptor fortyndet i rpmi 1630 medium til den ønskede koncentration til hver brønd. Medtag en negativ kontrol, som ikke indeholder kolesterol acceptorer i en positiv kontrol, som skitseret i tekstprotokollen, og inkubere ved 37 grader celsius i fire til seks timer. I mellemtiden forberede en 200 milliliter lager af celle lysis løsning en som skitseret i teksten.Bland denne opløsning med ethanol, i en en-til-en volumetrisk forhold for at opnå lysis opløsning også. For medier og BD kolesterol afsløring, fjerne cellemediet fra pladerne i opsamlet i en ny hvid 96-brønd plade med en uigennemsigtig flad bund. Der tilsættes 100 mikroliter ren ethanol til 100 mikroliter af hver mellemprøve for at opnå et en-til-en-forhold i den nye plade.Ved hjælp af et illuminometer måles fluorescerende intensitet ved en excitation på 463 nanometer og en emission på 536 nanometer. For intracellulær NBD kolesterol detektion, vaske cellerne to gange med PBS. Tilsæt også 100 mikroliter lysisopløsning til hver brønd, og inkuber ved stuetemperatur, mens der omrystes i 25 minutter.Derefter måles fluorescerende intensitet, mens følsomhedsparameteren justeres til 50 i softwaren. Derefter bestemme kolesterol efflux sats i det endelige mål for kolesterol efflux som skitseret i tekstprotokollen. Fortynding NBD kolesterol i ren ethanol producerer den højeste fluorescerende intensitet værdier, mens et højt indhold i vandig opløsning, sænker intensiteten.Dette tyder på, at fluorescerende emission af dette molekyle er meget afhængig af mediet, hvor det er indeholdt. Når du bruger en blanding af medier og ethanol i et en-til-en-forhold, synes fluorescerende intensitet at stige proportionalt med en koncentration af kolesterolanalogien, hvilket tyder på, at sonden opfører sig passende under disse forhold. For at bestemme den tid, der kræves for at inkubere de indlæste celler med kolesterol acceptorer, cellemedier er høstet på forskellige tidspunkter.Kolesterol efflux udviklet lineært fra nul til seks timer, med det maksimale signal, der fanges seks timer efter ABDS er føjet til cellerne. Mætningstærsklen og dynamikområdet testes ved at måle kolesterolstrømmen i forskellige procentdele af HDL, der indeholder medier. I det høje gennemløb aktiv, efflux udvikler sig lineært fra en til 7%ABDS, nå toppen af kolesterol efflux kapacitet på 7%Ved koncentrationer højere end 7% fluroescent intensitet falder i et omvendt forhold til ABDS procent.Fluorescensbaseret metodes ydeevne evalueres derefter ved at sammenligne den med den standardradiomærkede teknik. Begge teknikker er stærkt korreleret, når du bruger forskellige koncentrationer af ABDS. Den beskrevne metode er følsom over for en stigning i acceptor koncentrationer inden kolesterol efflux værdier mellem fem og 15%Det er vigtigt at sikre, at celluarizer indeholder ingen aggregater.Kritisk punkt er at grade en samlet ethanol indeholdende miljø, at måle fluorescens i en homogen, og optimal vægt. Efter denne procedure, navn teknisk kolesterol kan måles, og effekten af narkotika i kolesterol efflux vej kan bestemmes. Også skolen i sidste ende bruges som en diagnostisk at eses hjerte-kar-risiko.Vi mener, at denne metode er meget lettere og sikrere end den radioaktive standardmetode. Men det er stadig celleafhængig. Husk, at ethanol er brandfarlig, og det skal opbevares og håndteres i overensstemmelse hermed.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

High Throughput Sekventiel ELISA for Validering af biomarkører for akut graft-versus-host-sygdom

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Højt gennemløb Karakterisering af voksne stamceller udviklet til levering af terapeutiske faktorer for Neurobeskyttende Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En højt gennemløb, Multipleksede og målrettet proteomiske CSF Assay at kvantificere neurodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E Isoformer status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimeret LC-MS/MS metoden til høj overførselshastighed analyse af kliniske prøver af Ivacaftor, dets vigtigste metabolitter, og Lumacaftor i biologiske væsker af cystisk fibrose patienter