Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise von unterstützt die Forschung gewährt FIS (PS12/00866) vom Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo Para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación En SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) und CERCA Programm / Generalitat de Catalunya. Die Autoren danken den Retrovirology und virale Immunpathologie Labor des Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wir danken T. Escribà, C. Rovira und C. Hurtado für ihre Unterstützung und S. Cufí vom Wissen und der Technologie-Transfer-Büro für ihre Führung in der Erfindung zu schützen.

Für diese Studie wurden Ethikkommission Genehmigung (Comitè Ètic d' Investigacio Clínica, Klinik, Barcelona, Zulassungsnummer HCB/2014/0756) und schriftliche, informierte Zustimmung aller Fachrichtungen erhalten.
(1) NBD-Cholesterin Vorbereitung
<ol><li>Auflösen der NBD-Cholesterin (MW 494.63; siehe Tabelle of Materials) in reinem Ethanol um das Lager (2 mM) zu erhalten. Lösen Sie für eine 10 mg Ampulle die gesamte Fläschchen Inhalte in einem 10,1 mL Volumen von Etha...

<ol>
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Leuchtstoff-gekennzeichnete Cholesterin ist eine vielversprechende Strategie analysieren und untersuchen die Eigenschaften und den Stoffwechsel von in-vitro-natürliche Cholesterin. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es von den Zellen aufgenommen werden kann, ermöglicht die intrazellulären und Membran Reichweitenstudien und können auch auf Cholesterin Efflux-Assays wie in diesem Protokoll (Abbildung 7). Einige Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole ermöglichen Cholesterin tracking in-...

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind die aktuellen wichtigsten Todesursachen weltweit ischämischen Herzkrankheiten und Schlaganfall (Buchhaltung für insgesamt 15,2 Millionen Todesfälle)1. Beide sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), die Arteriosklerose und der Bruch des Atheroms Plaques in Blutgefäßen2,3vorangestellt werden können.
Atherosklerose ist ein Schiff Wand entzündliche Erkrankung in der T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen infiltrieren das Endothel und sammeln aus dem Blut, schließlich bildet arteriosklerotische Plaques. Arteriosklerotische Plaques präsentieren ein Lipid Kern und Cholesterin-Kristalle, belegt durch hochauflösende B-Mode Sonographie Messungen der a. carotis Intima Media Dicke4,5. In Makrophagen wird Cholesterin Efflux zur Lipid-Akzeptor-Partikel mit Mitteln der ATP-bindende Kassette (ABC) Rezeptoren ABCA1, ATP verbindliche Kassette Unterfamilie G Mitglied 1 (ABCG1) und der Scavenger-Rezeptor SR-BI durchgeführt. Das Ungleichgewicht der Cholesterin Zustrom und Fluth in Makrophagen gilt ein Schlüsselprozess bei Arteriosklerose Einleitung6. Cholesterin-Efflux gilt als ein wichtiger Schritt in der Cholesterin-Beseitigung von peripheren Gewebe in das Plasma und Leber in einem Prozess namens reverse Cholesterin-Transport (RCT). Cholesterin wird von Makrophagen hauptsächlich an Apolipoprotein A1 (ApoA1) gefunden auf der Oberfläche des High-density-Lipoprotein (HDL) Teilchen übertragen. HDLs transportieren dann Cholesterin zur Leber für die Ausscheidung und Verwertung7,8,9.
Traditionell hat Tritium (3H) radioaktiv markierten Cholesterin Cholesterin Efflux10eingesetzt. Die Emission Signal von Radioisotopen ist hochempfindlichen10; Allerdings stellt die radioaktiv markierten Cholesterin offensichtliche Nachteilen wie lange Protokolle, Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und die Notwendigkeit für spezielle Radioaktivität Einrichtungen und Anlagen zum sicheren Umgang mit radioaktiven Emissionen zu gewährleisten. Fluoreszenz ist hingegen erfolgreich in diagnostischen Techniken aufgrund seiner Einfachheit in fluoreszierenden Signalerkennung, die unterschiedlichsten Fluorophore verfügbar und seine Sicherheit11aufgenommen worden. Mehrere Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole wurden verwendet, um Cholesterin-Stoffwechsel einschließlich Dehydroergosterol (mit intrinsische Fluoreszenz), Dansyl Cholesterin, 4,4-Difluoro-3a, 4adiaza-s-Indacene (BODIPY) studieren - Cholesterin und 22-(N) (7) Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-Cholesterin). Insbesondere stellt NBD-Cholesterin eine effiziente Aufnahme in menschlichen Zellen12. Derzeit gibt es zwei verschiedene NBD gekennzeichnet-Cholesterin: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) und 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; ( Abbildung 1). Cholesterin mit 22-NBD glyko-gekennzeichnet kann Cholesterin-Efflux-Studien, am besten passen, während 25-NBD-Cholesterin hauptsächlich in Zellmembran Dynamik Forschung13,14verwendet wird.
Zell-Linien in der Regel verwendet in in-vitro-Cholesterin-Efflux-Assays sind Monocyte-wie Zellen wie menschliche Leukämie abgeleitet THP-1-Zellen, murine Raw 264,7 Zellen15oder J774.1. Alle diese Zellen differenzieren sich in Makrophagen in Vitro mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), aber THP-1-derived Makrophagen (DmTHP-1) am besten widerspiegeln und imitieren die menschliche Makrophagen16.
In der vorliegenden Studie, wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende Hochdurchsatz-Methode auf, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität der Serumproben auf DmTHP-1, ermitteln mit 22-NBD-Cholesterin als Alternative zu [3H]-Cholesterin. Darüber hinaus vergleichen wir die optimierte fluoreszierende Technik mit dem standard radioaktiven analogen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Arteriosklerose führt zu Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD). Es ist noch unklar, ob Cholesterin HDL (cHDL) Konzentration spielt eine ursächliche Rolle in der Entwicklung von Atherosklerose. Allerdings ist ein wichtiger Faktor in frühen Stadien der Atherom Plaquebildung Cholesterin Efflux Fähigkeit, HDL (die Fähigkeit der HDL-Partikel, Cholesterin aus Makrophagen anzunehmen) um Zelle Schaumbildung zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Schritt bei der Vermeidung der Anhäufung von Cholesterin in das Endothel und ein Teil des umgekehrten Cholesterin-Transport (RCT), Cholesterin durch die Leber zu beseitigen. Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument, das als Biomarker für Atherosklerose verwendet werden kann. Traditionell, [3H]-Cholesterin in Cholesterin-Efflux-Assays verwendet worden. In dieser Studie wollen wir ein sicherer und schneller mit fluoreszierenden gekennzeichnet-Cholesterin (NBD-Cholesterin)-Strategie in einem zellulären Assay, den Cholesterin Aufnahme und Fluth Prozess in THP-1-derived Makrophagen zu verfolgen. Endlich, wir optimieren und standardisieren die NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Der Cholesterin-Efflux-Test soll in Vitro die Cholesterin Efflux Kapazität eines bestimmten Serum, Plasma oder überstand mit HDL-Partikeln zu ermitteln. Die Methode besteht darin, be-gekennzeichnet Cholesterin in eine Kultur einer standard Makrophagen-Zelllinie und Kontakt mit der Teststichprobe verdünnt in FBS-freie Medien mit den Zellen induzieren. Schließlich sind die fluoreszierenden Werte aus der NBD in den Medien und Zelle lysate gemessen. Um die Messungen zu optimieren, wird das Effluxed Cholesterin aus den Ze...

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High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Dieses Protokoll ist unsere zellbasierte Methode zur Cholesterinbeendigung des Cholesterinrefluxes im ceramalen Plasma. Vor allem bei Screenings. Dies kann angewendet werden, um kardiovaskuläre samtolare Risiken zu diagnostizieren, und cholesterinsenkende Erhaltung zu identifizieren oder zu bewerten.Diese Technik vermeidet das Risiko und die Belastungen, da die Sicherheit mit dem Umgang mit abgestrahlten Materialien durch die Bereitstellung von Ergebnissen mit vergleichbaren Qualitätsniveaus, zu denen von Cholesterin-Reflux wurde berichtet, um mit So, das Plasma oder ceramal Cholesterin Reflux der akzeptierten verglichen werden kann, um unsere Referenzkontrolle und kann das Risiko, von dieser Methode leiden wird auch auf die Zelllinien angewendet werden , wie andere menschliche Zelllinien oder sogar primäre Makrophasen. Makrophasen oder und vom Menschen induzierte Sprühknopfstammzellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie das NPD-Cholesterin in reinem Ethanol auf, um eine Stofflösung mit einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu erhalten.Verdünnen Sie 25 Mikroliter des NBD-Cholesterinbestands in AR 10 medium, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Kultur thp-1 Zellen in unserem 10 Medium bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Passen Sie alle drei Tage die Zelldichte auf 300000 Zellen pro Milliliter an.Dann erhalten Sie eine 96-Well-Platte mit einem flachen klaren Boden. Für eine bessere Homogenisierung 10 Milliliter thp-1-Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr vorbereiten und 200 Mikroliter PMA-Bestand hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig und säen Sie 100 Mikroliter der Mischung in die Plattenbrunnen bei 200. 000 Zellen pro Brunnen.Und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren, um die thp-1-Zellen in DM-Thp-1-Zellen zu differenzieren. Zunächst Glycin in 10%PBS mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 200 Mikromolaren bei pH 7,4 verdünnen. Fügen Sie 40 Milliliter verdünntes Glycin zu 10 Gramm Peg 8000 hinzu, um eine 20%peg Lösung vorzubereiten, und mischen Sie kräftig, um zu homogenisieren.Als nächstes wenden Sie vier Teile von 20% pro 10 Teile der Probe auf jedes Serum oder Plasmaprobe in einem 1,5 ml Tube. Lassen Sie die Mischung für 25 Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie den Peg apolipoprotein B bei 13000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.Entsorgen Sie den Niederschlag und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Holen Sie sich die Platte, die die differenzierten thp-1-Zellen enthält. Entfernen und verwerfen Sie das Kulturmedium, und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1X PBS.Fügen Sie 100 Mikroliter von 5 Mikromolaren MVD-Cholesterin in AR-10 Medium zu jedem Brunnen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Verwerfen Sie am nächsten Tag das Medium.Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, und fügen Sie dann 100 Mikroliter ABDS, oder gereinigten Lipid-Akzeptor in rpmi 1630 Medium verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu jedem Brunnen. Fügen Sie eine negative Kontrolle, die keine Cholesterin-Akzeptoren enthalten, in eine positive Kontrolle ein, wie im Textprotokoll beschrieben, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden. In der Zwischenzeit bereiten Sie einen 200 Milliliter Vorrat an Zelllyselösung eins, wie im Text beschrieben.Mischen Sie diese Lösung mit Ethanol, in einem 1:1-Volumenverhältnis, um auch eine Lyselösung zu erhalten. Für die Medien- und BD-Cholesterindetektion entfernen Sie das Zellmedium von den Platten, die in einer neuen weißen 96-Well-Platte mit einem undurchsichtigen flachen Boden gesammelt wurden. Fügen Sie 100 Mikroliter reines Ethanol zu 100 Mikrolitern jeder medium Probe hinzu, um ein Eins-zu-Eins-Verhältnis in der neuen Platte zu erhalten.Messen Sie mit Hilfe eines Beleuchtungsometers die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregung von 463 Nanometern und einer Emission von 536 Nanometern. Für den intrazellulären NBD-Cholesterinnachweis, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter Lyse-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei Raumtemperatur, während sie 25 Minuten schütteln.Danach messen Sie die Intensität des Fluoreszenzes, während Sie den Empfindlichkeitsparameter in der Software auf 50 einstellen. Bestimmen Sie dann die Cholesterin-Effizienz im letzten Maß des Cholesterin-Efflux, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Verdünnung des NBD-Cholesterins in reinem Ethanol erzeugt die höchsten Fluoreszenzintensitätswerte, während ein hoher Gehalt an wässriger Lösung die Intensität senkt.Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzemission dieses Moleküls in hohem Maße vom Medium abhängt, in dem es enthalten ist. Bei verwendung einer Mischung aus Medien und Ethanol im Verhältnis eins zu eins scheint die Intensität des Fluoreszenzes proportional zu zunehmen, mit einer Konzentration des Cholesterinanalogs, was darauf hindeutet, dass sich die Sonde unter diesen Bedingungen angemessen verhält. Um die Zeit zu bestimmen, die benötigt wird, um die geladenen Zellen mit Cholesterin-Akzeptoren zu bebrüten, werden Zellmedien zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet.Der Cholesterin-Efflux entwickelte sich linear von null auf sechs Stunden, wobei das maximale Signal sechs Stunden nach der Zulage von ABDS zu den Zellen erfasst wurde. Die Sättigungsschwelle und der Dynamikbereich werden durch Messung des Cholesterinausflusses an unterschiedlichen Prozentsätzen von HDL-haltigen Medien getestet. Im Hochdurchsatz-Asset entwickelt sich der Efflux linear von einem bis 7%ABDS und erreicht den Höhepunkt der Cholesterin-Efflux-Kapazität bei 7%Bei Konzentrationen von mehr als 7% nimmt die Intensität des Fluroeszenzinals in einer umgekehrten Beziehung mit dem ABDS-Prozentsatz ab.Die Leistung der fluoreszenzbasierten Methode wird dann durch Einen Vergleich mit der standardmäßigen radiomarkierten Technik bewertet. Beide Techniken sind stark korreliert, wenn unterschiedliche Konzentrationen von ABDS verwendet werden. Die beschriebene Methode ist empfindlich auf eine Erhöhung der Akzeptanzkonzentrationen innerhalb der Cholesterin-Efflux-Werte zwischen fünf und 15%Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Celluarizer keine Aggregate enthält.Kritischer Punkt ist die Einfeinerung einer ethanolhaltigen Gesamtumgebung, um die Fluoreszenz in einem homogenen und optimalen Gewicht zu messen. Nach diesem Verfahren kann der Name technisches Cholesterin gemessen werden, und die Wirkung von Medikamenten im Cholesterin-Efflux-Signalweg kann bestimmt werden. Auch die Schule schließlich als Diagnose verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Risiko zu asses.Wir glauben, dass diese Methode viel einfacher und sicherer ist als die radioaktive Standardmethode. Es ist jedoch immer noch zellabhängig. Bitte denken Sie daran, dass Ethanol entzündlich ist und entsprechend gelagert und behandelt werden sollte.

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Medicine

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Forschung

Medizin

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