Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

עבודה זו היא נתמכה חלקית על ידי המחקר מעניקה FIS (PS12/00866) מ אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי, מדריד, ספרד; Fondo Europeo פארא el Desarrollo אזוריים (פדר); אדום de Investigación en סידה (RIS), ISCIII-RETIC (RD16 0025 0002) ותוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה. המחברים תודה את Retrovirology ואת המעבדה Immunopathology ויראלי של d'Investigacions אינסטיטוט Biomèdiques אוגוסט Pi I Sunyer (IDIBAPS). אנו מודים Escribà ט Rovira ג, ג הורטדו סיוע, Cufí ס מ הידע ואת טכנולוגיית העברת המשרד להדרכה שלה בהגנה על ההמצאה.

במחקר זה, אישור ועדה אתית (Comitè Ètic d'Investigació קליניקה, חולים במרפאה, ברצלונה; מספר אישור HCB/2014/0756), הודיע בכתב הסכמת כל הנושאים התקבלו.
1. כולסטרול להארכה הכנה
<ol><li>להמיס את להארכה הכולסטרול (MW 494.63; ראה טבלה של חומרים) אתנול טהור כדי להשיג את המניה (2 מ מ). בשביל בקבוקון 10 מ ג...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

מתויג פלורסנט כולסטרול היא אסטרטגיה מבטיח לנתח ולחקור את המאפיינים ואת חילוף החומרים של הפריה טבעי כולסטרול. היתרונות העיקריים שלה הם כי זה שאפשר לקחת על ידי תאים, מאפשר תאיים ולימודים ממברנה הפצה, ולא ניתן להחיל על כולסטרול בזרימת מבחני כגון פרוטוקול זה (איור 7). בתחום ה סט...

לפי ארגון הבריאות העולמי, הגורמים העיקריים הנוכחי למוות ברחבי העולם הם מחלת לב איסכמית וקו (חשבונאות עבור סכום כולל של 15.2 מיליון מקרי מוות)1. שניהם נמצאים מחלות לב וכלי דם (CVD) זה יכול להיות קדמו טרשת עורקים, שבר atheroma הפלאק של כלי הדם2,3.
טרשת עורקים היא כלי קיר דלקתיות מחלה שבה מקרופאגים, תאי T, תאי פיטום, תאים דנדריטים לחדור את אנדותל ולצבור מהדם, בסופו של דבר ויוצרים הפלאק טרשת עורקים. שלטי טרשת עורקים מציגים ליפופרוטאין קריסטלים הליבה וכולסטרול, שמעידים ברזולוציה גבוהה B-מצב בדיקת אולטרה סאונד מדידות של4,5עובי מדיה התרדמה אינטימה. ב מקרופאגים, כולסטרול בזרימת לכיוון השומנים מקבל חלקיקים מתבצעת על ידי אמצעים של קולטני קלטת (ABC) מחייב ATP ABCA1, ATP איגוד קלטת תת G חבר 1 (ABCG1), הקולטן נבלות SR-BI. האיזון של זרם הכולסטרול ולא בזרימת ב מקרופאגים נחשב תהליך מפתח חניכה טרשת עורקים6. כולסטרול בזרימת נחשבת צעד המפתח כולסטרול חיסול של רקמות היקפיים כדי פלזמה והכבד בתהליך הנקרא תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT). כולסטרול יועברו מ מקרופאגים בעיקר כדי אפוליפופרוטאין A1 (ApoA1) על פני השטח של חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL). HDLs תחבורה ואז הכולסטרול בכבד הפרשה וסילוק מחדש7,8,9.
באופן מסורתי, נעשה שימוש טריטיום (3H) מתויג רדיו כולסטרול כולסטרול בזרימת10. האות פליטה של רדיואיזוטופים הוא מאוד רגיש10; עם זאת, כולסטרול מתויג הרדיו מציג מגבלות ברורים כגון פרוטוקולים ארוכים, סיכון של חשיפה לקרינה מייננת בצורך מיוחד רדיואקטיביות מתקנים וציוד על מנת להבטיח טיפול בטוח של פליטת רדיואקטיבי. להפך, זריחה יש בהצלחה שולבו טכניקות אבחון בשל פשטותו זיהוי אותות פלואורסצנט, מגוון רחב של fluorophores זמין, ו שלה בטיחות11. בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מספר השתמשו ללמוד מטבוליזם הכולסטרול כולל dehydroergosterol (עם פלורסצנטיות מהותי), כולסטרול dansyl, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - כולסטרול, ו 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (להארכה-כולסטרול). במיוחד, להארכה-כולסטרול מציג ספיגה יעילה תאים אנושיים12. שני שונים להארכה מתויג כולסטרול זמינים כעת: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-להארכה) ו 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-להארכה; איור 1). כולסטרול בלוחיות הסבר moiety 22-להארכה ייתכן ולביצועי כולסטרול בזרימת מחקרים, בעוד 25-להארכה-כולסטרול משמש בעיקר הממברנה התאית dynamics מחקר13,14.
שורות תאים המשמש בדרך כלל כולסטרול במבחנה בזרימת מבחני הם תאים דמויי מונוציט כגון לוקמיה-derived THP-1 התאים של האדם, 264.7 גלם מאתר תאים15או J774.1. כל התאים האלה יכול להיות מובחן מקרופאגים במבחנה באמצעות 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA), אך THP 1-נגזר מקרופאגים (dmTHP-1) הכי טוב לשקף לחקות את המקרופאגים האנושי16.
במחקר הנוכחי, אנו לייעל, לתקנן שיטה תפוקה גבוהה פלורסנט כדי לקבוע את הקיבולת בזרימת כולסטרול הדוגמאות סרום dmTHP-1, באמצעות 22-להארכה-כולסטרול כחלופה [3H]-כולסטרול. בנוסף, אנו משווים את הטכניקה פלורסנט ממוטבת עם אנלוגי רדיואקטיבי סטנדרטי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

טרשת עורקים מובילה למחלות קרדיווסקולריות (CVD). לא ברור עדיין אם ריכוז כולסטרול-HDL (cHDL) ממלא תפקיד סיבתי בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, גורם חשוב בשלבים המוקדמים של היווצרות הפלאק atheroma הוא היכולת בזרימת כולסטרול HDL (היכולת של חלקיקי ה-HDL כולסטרול מן מקרופאגים לקבל) על מנת למנוע היווצרות תאי קצף. זהו צעד המפתח הימנעות ההצטברות של כולסטרול של אנדותל, וחלק תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT) כדי למנוע כולסטרול דרך הכבד. קיבולת בזרימת הכולסטרול בסרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח זה יכול לשמש סמן עבור טרשת עורקים. באופן מסורתי, [3H]-כולסטרול כבר בשימוש מבחני בזרימת כולסטרול. במחקר זה, אנו שואפים לפתח אסטרטגיה מהירה ובטוחה באמצעות פלורסנט מתויג כולסטרול (הכולסטרול-להארכה) ב וזמינותו הסלולר לאתר את ספיגת הכולסטרול ותהליכי בזרימת ב מקרופאגים THP 1-נגזר. לבסוף, אנו לייעל, לתקנן את שיטת בזרימת להארכה-כולסטרול ולפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

המטרה של כולסטרול בזרימת וזמינותו היא לקבוע במבחנה את הקיבולת בזרימת כולסטרול סרום נתון, פלזמה, או תגובת שיקוע המכיל חלקיקי ה-HDL. השיטה מורכבת loading כולסטרול מתויג תרבות של קו תא מקרופאג סטנדרטי שייצור קשר עם הדגימה הבדיקה מדולל FBS ללא מדיה עם התאים. בסופו של דבר, רמות פלורסנט להארכה נמדדים ת?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

פרוטוקול זה הוא השיטה מבוססת התא שלנו להפסקת כולסטרול של רפלוקס כולסטרול בפלזמה ceramal. במיוחד בהקרנות. זה עשוי להיות מיושם כדי לאבחן סיכון קרדיווסקולרי, כדי לזהות או להעריך כולסטרול תחזוקה נמוכה יותר.טכניקה זו מונעת את הסיכון ואת הנטל כבטיחות עם טיפול בחומרים מוקרינים על ידי מתן תוצאות עם רמות איכות דומות, לאלה של כולסטרול reflux דווח לקשר עם כך, פלזמה או כולסטרול ceramal reflux של מקובל ניתן להשוות, לבקרת הייחוס שלנו עשוי לספק את הסיכון לסבול משיטה זו תחול גם על קווי התא כמו קווי תאים אנושיים אחרים או אפילו שלבי מאקרו ראשיים., שלבי מאקרו או ותאי גזע של לחצן ספריי הנגרמים על ידי אדם. כדי להתחיל בהליך זה, להמיס את הכולסטרול NPD באתנול טהור כדי לקבל פתרון מלאי עם ריכוז סופי של שני micromolar.לדלל 25 microliters של מלאי הכולסטרול NBD ב AR 10 בינוני כדי להגיע לריכוז הסופי של חמישה micromolar. תאים thp-1 תרבות שלנו 10 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כל שלושה ימים להתאים את צפיפות התא ל300000 תאים למיליליטר.לאחר מכן להשיג צלחת 96 היטב עם תחתית ברורה שטוחה. להומוגניזציה טובה יותר, הכינו 10 מיליליטר של תאי thp-1 בצינור של 15 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מלאי PMA. מערבבים בעדינות וזרעים 100 מיקרוליטרים של התערובת לתוך בארות הצלחת ב 200, 000 תאים לתוך באר.ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 48 עד 72 שעות כדי להבדיל את תאי thp-1 לתאי DM thp-1. תחילה לדלל גליצין ב 10% PBS עם מים סטריליים, לריכוז של 200 micromolar ב pH 7.4. מוסיפים 40 מיליליטר של גליצין מדולל ל-10 גרם יתד 8000 להכנת תוסף 20%, ומערבבים במרץ להומוגניזציה.הבא להחיל ארבעה חלקים של 20% לכל 10 חלקים של מדגם על כל סרום או דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל. השאירו את התערובת על הקרח למשך 25 דקות. צנטריפוגה אפוליפופרוטאין B יתד ב 13000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.השלך את המשקעים, והעבר את העל-טבעי לצינור חדש. אחזר את הלוח המכיל את תאי ה- thp-1 המובחנים. הסר והשליך את מדיום התרבות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS 1X.הוסף 100 microliters של 5 מיקרומולרים MVD כולסטרול AR-10 בינוני לכל באר. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת להשליך, להשליך את המדיום.לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 100 MICROLITERS ABDS, או מקבל שומנים מטוהרים מדולל rpmi 1630 בינוני לריכוז הרצוי לכל באר. כלול פקד שלילי אשר אינם מכילים מקבלי כולסטרול בשליטה חיובית, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שש שעות. בינתיים, להכין מלאי 200 מיליליטר של פתרון תות תא אחד כפי שמתואר בטקסט.מערבבים פתרון זה עם אתנול, ביחס נפחי של אחד לאחד כדי לקבל פתרון תזה מדי. לגילוי מדיה וכולסטרול BD, הסר את מדיום התא מהצלחות שנאספו בצלחת לבנה חדשה של 96 באר עם תחתית שטוחה אטומה. הוסף 100 מיקרוליטרים של אתנול טהור ל-100 מיקרוליטרים של כל דגימה בינונית כדי להשיג יחס של אחד לאחד בצלחת החדשה.באמצעות מד חום, למדוד את עוצמת הפלואורסצנט בגירוי של 463 ננומטר, ו פליטה של 536 ננומטר. לגילוי כולסטרול NBD תאי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תותבת תזה גם לכל באר, ו דגירה בטמפרטורת החדר, תוך טלטול במשך 25 דקות.לאחר מכן, למדוד את עוצמת הפלואורסצננט תוך התאמת פרמטר הרגישות ל 50 בתוכנה. לאחר מכן לקבוע את שיעור efflux כולסטרול במידה הסופית של כולסטרול efflux כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דילול כולסטרול NBD באתנול טהור מייצר את ערכי העוצמה הגבוהים ביותר של הפלואורסצנט בעוד תוכן גבוה בתספורת מיקווית, מוריד את העוצמה.הדבר מצביע על כך ש הפליטה הפלואורסצנטית של מולקולה זו תלויה מאוד במדיום, שבו היא כלולה. בעת שימוש בתערובת של מדיה ואתנול ביחס של אחד לאחד, נראה כי עוצמת הפלואורסצנטי גדלה באופן פרופורציונלי, עם ריכוז של אנלוגי כולסטרול, מה שמרמז כי החללית מתנהגת כראוי בתנאים אלה. כדי לקבוע את משך הזמן הנדרש כדי להדגר את התאים טעון עם מקבלי כולסטרול, התקשורת התא נקצר בנקודות זמן שונות.efflux כולסטרול התפתח באופן ליניארי מאפס עד שש שעות, עם האות המרבי שנתפס שש שעות לאחר ABDS מתווסף לתאים. סף הרוויה והטווח הדינמי נבדקים על ידי מדידת efflux הכולסטרול באחוזים שונים של HDL המכיל מדיה. בנכס תפוקה גבוהה, efflux מתפתח באופן ליניארי מאחד עד 7%ABDS, להגיע לשיא של קיבולת efflux כולסטרול ב 7%בריכוזים גבוהים מ 7%העוצמה של הפלווסנט פוחתת ביחסים הפוכים עם אחוז ה-ABDS.הביצועים של השיטה המבוססת על פלואורסצנטיות מוערכים לאחר מכן על ידי השוואתה לטכניקת הרדיו הסטנדרטית המסומת. שתי הטכניקות מתואמות מאוד בעת שימוש בריכוזים שונים של ABDS. השיטה המתוארת רגישה לעלייה של ריכוזי מקבל בתוך ערכי efflux כולסטרול בין חמישה ל 15%, חשוב לוודא כי celluarizer אינו מכיל אגרגטים.נקודה קריטית היא לדרג סביבה המכילה אתנול מצרפי, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות במשקל הומוגני ואופטימלי. בעקבות הליך זה, שם כולסטרול טכני ניתן למדוד, ואת ההשפעה של תרופות במסלול efflux כולסטרול ניתן לקבוע. גם בית הספר בסופו של דבר לשמש אבחון כדי התחת סיכון קרדיווסקולרי.אנו מאמינים כי שיטה זו היא הרבה יותר קלה ובטוחה מאשר השיטה הסטנדרטית הרדיואקטיבית. עם זאת הוא עדיין תלוי תא. אנא זכרו כי אתנול הוא פתי ויש לאחסן אותו ולטפל בו בהתאם.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

בזרימת כולסטרול Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס