Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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इस कार्य को Instituto डी Salud कार्लोस III, मैड्रिड, स्पेन से अनुसंधान अनुदान वित्तीय संस्थाओं (PS12/00866) द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया है; Fondo Europeo पैरा एल Desarrollo रिजनल (FEDER); Red de Investigación en सीडा (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) और CERCA कार्यक्रम/Generalitat डे Catalunya । लेखकों ने Institut d'Investigacions Biomèdiques अगस्त पीआई आइ Sunyer (IDIBAPS) की Retrovirology और वायरल Immunopathology प्रयोगशाला का धन्यवाद किया । हम Escribà, सी. Rovira, और सी. Hurtado उनकी सहायता के लिए धंयवाद और ज्ञान और प्रौद्योगिकी के स्थानांतरण कार्यालय से Cufí आविष्कार की रक्षा में उसके मार्गदर्शन के लिए ।

इस अध्ययन के लिए, नैतिक समिति अनुमोदन (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना; अनुमोदन संख्या HCB/2014/0756) और लिखित, सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई ।
1. NBD-कोलेस्ट्रॉल तैयारी
<ol><li>NBD-कोलेस्?...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल एक आशाजनक रणनीति का विश्लेषण और गुणों और प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल के चयापचय की जांच इन विट्रो में है । इसका मुख्य लाभ यह है कि यह कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है, intracellular और झिल्?...

विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में मौत के वर्तमान प्रमुख कारणों कोरोनरी हृदय रोग और स्ट्रोक (१५,२००,००० मौतों की कुल के लिए लेखांकन)1हैं । दोनों हृदय रोग (सीवीडी) है कि atherosclerosis और रक्त वाहिकाओं2,3में मेदार्बुद सजीले टुकड़े का टूटना से पहले किया जा सकता है ।
Atherosclerosis एक पोत दीवार भड़काऊ रोग है जिसमें मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, और वृक्ष कोशिकाओं endothelium घुसपैठ और खून से संचित, अंततः atherosclerotic सजीले टुकड़े बनाने । Atherosclerotic सजीले टुकड़े एक लिपिड कोर और कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल प्रस्तुत, मन्या intima मीडिया मोटाई4,5के उच्च संकल्प बी मोड ट्रा माप के द्वारा सबूत. मैक्रोफेज में, लिपिड स्वीकारकर्ता कणों की ओर कोलेस्ट्रॉल समाप्ति एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) रिसेप्टर्स ABCA1 के माध्यम से किया जाता है, एटीपी बाइंडिंग कैसेट उपपरिवार जी सदस्य 1 (ABCG1), और मेहतर रिसेप्टर SR-द्वि. मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल की आमद और समाप्ति के असंतुलन को atherosclerosis दीक्षा6में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परिधीय ऊतक से प्लाज्मा और जिगर को रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) नामक प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल मैक्रोफेज से मुख्य रूप से apolipoprotein A1 (ApoA1) उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) कणों की सतह पर पाया स्थानांतरित किया जाता है । डेंसिटी तो उत्सर्जन के लिए जिगर को कोलेस्ट्रॉल परिवहन और पुन: उपयोग7,8,9।
परंपरागत रूप से tritium (3एच) रेडियो-बला कोलेस्ट्रॉल का इस्तेमाल कोलेस्ट्रॉल समाप्ति10में किया गया है । radioisotopes का उत्सर्जन संकेत अति संवेदनशील10है; हालांकि, रेडियो-लेबल कोलेस्ट्रॉल इस तरह के लंबे प्रोटोकॉल के रूप में स्पष्ट बाधाओं प्रस्तुत करता है, विकिरण के लिए जोखिम के जोखिम, और विशेष रेडियोधर्मिता सुविधाओं और रेडियोधर्मी उत्सर्जन की सुरक्षित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए उपकरणों के लिए की जरूरत है । इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति सफलतापूर्वक फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने में अपनी सादगी के कारण नैदानिक तकनीक में शामिल किया गया है, उपलब्ध fluorophores की व्यापक विविधता है, और अपनी सुरक्षा11. कई फ्लोरोसेंट-बला sterols dehydroergosterol सहित कोलेस्ट्रॉल चयापचय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (आंतरिक प्रतिदीप्ति के साथ), dansyl कोलेस्ट्रॉल, 4, 4-difluoro-3 ए, 4adiaza-s-indacene (BODIPY)-कोलेस्ट्रॉल, और 22-(एन-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1, 3-Diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-Bisnor-5-Cholen-3β-राजभाषा (NBD-cholesterol) । विशेष रूप से, NBD-कोलेस्ट्रॉल मानव कोशिकाओं12में एक कुशल सुलाने के लिए प्रस्तुत करता है । दो अलग NBD बला-कोलेस्ट्रॉल वर्तमान में उपलब्ध हैं: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-bisnor-5-cholen-3 बी-राजभाषा (22-NBD) और 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)-मिथाइल] अमीनों) -27-norcholesterol (25-NBD; चित्रा 1) । कोलेस्ट्रॉल 22-NBD moiety के साथ लेबल सबसे अच्छा कोलेस्ट्रॉल समाप्ति अध्ययन के अनुरूप हो सकता है, जबकि 25-NBD-कोलेस्ट्रॉल मुख्य रूप से सेलुलर झिल्ली गतिशीलता अनुसंधान13,14में प्रयोग किया जाता है ।
सेल आमतौर पर इन विट्रो में प्रयुक्त लाइनों कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख monocyte जैसे मानव ल्यूकेमिया-व्युत्पंन THP-1 कोशिकाओं, murine कच्चे २६४.७ कोशिकाओं15, या जंमू 774.1 जैसे कोशिकाओं रहे हैं । इन कोशिकाओं के सभी phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) का उपयोग कर इन विट्रो में मैक्रोफेज में विभेद किया जा सकता है, लेकिन THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज (dmTHP-1) सबसे अच्छा प्रतिबिंबित और मानव मैक्रोफेज16नकल ।
वर्तमान अध्ययन में, हम ऑप्टिमाइज़ करें और dmTHP-1 पर सीरम नमूनों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट उच्च-प्रवाह विधि मानकीकरण, 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग करना [3H]-कोलेस्ट्रॉल. इसके अलावा, हम मानक रेडियोधर्मी एनालॉग के साथ अनुकूलित फ्लोरोसेंट तकनीक की तुलना करें ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Atherosclerosis हृदय रोग (सीवीडी) की ओर जाता है । यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कोलेस्ट्रॉल एचडीएल (cHDL) एकाग्रता atherosclerosis विकास में एक कारण भूमिका निभाता है । हालांकि, मेदार्बुद पट्टिका गठन के प्रारंभिक दौर में एक महत्वपूर्ण कारक कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एचडीएल (एचडीएल कणों मैक्रोफेज से कोलेस्ट्रॉल को स्वीकार करने की क्षमता) के क्रम में फोम सेल गठन से बचने के लिए है । इस endothelium में कोलेस्ट्रॉल के संचय और जिगर के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल को खत्म करने के लिए रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) का एक हिस्सा से बचने में एक महत्वपूर्ण कदम है । मैक्रोफेज सेल मॉडल में सीरम या प्लाज्मा को कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एक होनहार उपकरण है जिसे atherosclerosis के लिए रिमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । परंपरागत रूप से, [3एच]-कोलेस्ट्रॉल में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति की परख का प्रयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक सेलुलर परख में फ्लोरोसेंट बला-कोलेस्ट्रॉल (NBD-कोलेस्ट्रॉल) का उपयोग कर एक सुरक्षित और तेजी से रणनीति विकसित करने के लिए THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल तेज और समाप्ति प्रक्रिया का पता लगाने के उद्देश्य । अंत में, हम अनुकूलन और NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि का मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग विश्लेषण का विकास ।

कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख का उद्देश्य इन विट्रो में एक दिया सीरम, प्लाज्मा, या supernatant युक्त एचडीएल कणों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता निर्धारित करने के लिए है । विधि एक मानक मैक्रोफेज सेल लाइन की एक संस्क?...

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High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

मापन इन विट्रो में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता सीरम या प्लाज्मा मैक्रोफेज सेल मॉडल में atherosclerosis के लिए एक के रूप में एक होनहार उपकरण है । वर्तमान अध्ययन में, हम अनुकूलन और एक फ्लोरोसेंट NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर विश्लेषण का विकास ।

उच्च प्रवाह Nitrobenzoxadiazole-समाप्ति कोलेस्ट्रॉल परख लेबल

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

यह प्रोटोकॉल सेरामल प्लाज्मा में कोलेस्ट्रॉल भाटा के कोलेस्ट्रॉल समाप्ति के लिए हमारे सेल आधारित विधि है। विशेष रूप से स्क्रीनिंग में । यह हृदय जोखिम का निदान करने के लिए लागू किया जा सकता है, और कोलेस्ट्रॉल कम रखरखाव की पहचान या मूल्यांकन करने के लिए।यह तकनीक तुलनात्मक गुणवत्ता के स्तर के साथ परिणाम प्रदान करके विकिरणित सामग्रियों को संभालने के लिए सुरक्षा के रूप में जोखिम और बोझ से बचती है, कोलेस्ट्रॉल भाटा के लोगों को इस प्रकार के साथ संबद्ध करने के लिए सूचित किया गया है, प्लाज्मा या सेरामल कोलेस्ट्रॉल भाटा स्वीकार किए जाते हैं की तुलना की जा सकती है, हमारे संदर्भ नियंत्रण के लिए और इस विधि से पीड़ित करने के लिए जोखिम प्रदान कर सकते है भी सेल लाइनों के लिए लागू किया जाएगा , अन्य मानव कोशिका रेखाओं या यहां तक कि प्राथमिक मैक्रो चरणों की तरह। मैक्रो चरणों या और मानव प्रेरित स्प्रे बटन स्टेम सेल। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, दो माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता के साथ स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए शुद्ध इथेनॉल में एनपीडी कोलेस्ट्रॉल को भंग करें।एआर 10 माध्यम में एनबीडी कोलेस्ट्रॉल स्टॉक के 25 माइक्रोलीटर को पतला करने के लिए पांच माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । संस्कृति thp-1 हमारे 10 माध्यम में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं । हर तीन दिन में सेल डेंसिटी को 300000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर में समायोजित करें।फिर एक फ्लैट स्पष्ट नीचे के साथ एक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्राप्त करें। बेहतर समरूपता के लिए, 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर टीएचपी-1 कोशिकाओं को तैयार करें, और पीएमए स्टॉक के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं और मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर को प्लेट कुओं में 200, 000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाएं।और डीएम टीएचपी-1 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए 48 से 72 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। पहला पतला ग्लाइसिन 10% पीबीएस में बाँझ पानी के साथ, पीएच 7.4 पर 200 माइक्रोमोलर की एकाग्रता के लिए। 20% खूंटी समाधान तैयार करने के लिए 10 ग्राम खूंटी 8000 में पतला ग्लाइसिन के 40 मिलीलीटर जोड़ें, और समरूप बनाने के लिए सख्ती से मिलाएं।इसके बाद 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक सीरम या प्लाज्मा नमूने के लिए नमूने के 10 भागों में 20% के चार भागों को लागू करें। मिश्रण को बर्फ पर 25 मिनट के लिए छोड़ दें। सेंट्रलाइज खूंटी एपोलीपोप्रोटीन बी 13000 बार जी पर और 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर उपजी।वर्षा को त्यागें, और सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। विभेदित टीएचपी-1 कोशिकाओं वाली प्लेट को पुनः प्राप्त करें। संस्कृति माध्यम को हटा दें और त्यागें, और फिर कोशिकाओं को 1X पीबीएस के साथ दो बार धोएं।प्रत्येक कुएं में एआर-10 माध्यम में 5 माइक्रोमोलर एमवीडी कोलेस्ट्रॉल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। रात भर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । अगले दिन त्यागें, माध्यम को त्यागें।कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और फिर प्रत्येक अच्छी तरह से वांछित एकाग्रता के लिए आरपीएमआई 1630 माध्यम में पतला 100 माइक्रोलीटर एबीडीएस, या शुद्ध लिपिड स्वीकारकर्ता जोड़ें। एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें जिसमें सकारात्मक नियंत्रण में कोलेस्ट्रॉल स्वीकार करने वाले नहीं होते हैं, जैसा कि पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित है, और चार से छह घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस बीच, पाठ में उल्लिखित सेल लाइसिस समाधान एक का 200 मिलीलीटर स्टॉक तैयार करें।इस समाधान को इथेनॉल के साथ मिलाएं, लाइसिस समाधान प्राप्त करने के लिए एक-से-एक वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में। मीडिया और बीडी कोलेस्ट्रॉल का पता लगाने के लिए, एक अपारदर्शी फ्लैट नीचे के साथ एक नई सफेद ९६-अच्छी तरह से प्लेट में एकत्र में प्लेटों से सेल माध्यम को हटा दें । नई प्लेट में एक-से-एक अनुपात प्राप्त करने के लिए प्रत्येक मध्यम नमूने के 100 माइक्रोलीटर के लिए शुद्ध इथेनॉल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक इलुमिनोमीटर का उपयोग करके, 463 नैनोमीटर के उत्तेजन पर फ्लोरोसेंट की तीव्रता को मापें, और 536 नैनोमीटर का उत्सर्जन करें। इंट्रासेलुलर एनबीडी कोलेस्ट्रॉल डिटेक्शन के लिए, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। 25 मिनट तक मिलाते हुए, प्रत्येक कुएं में लाइसिस समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।इसके बाद, सॉफ्टवेयर में संवेदनशीलता पैरामीटर को 50 तक समायोजित करते हुए फ्लोरोसेंट की तीव्रता को मापें। फिर पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित कोलेस्ट्रॉल efflux के अंतिम उपाय में कोलेस्ट्रॉल efflux दर निर्धारित करें। शुद्ध इथेनॉल में एनबीडी कोलेस्ट्रॉल को पतला करने से उच्चतम फ्लोरोसेंट की तीव्रता मूल्य पैदा होती है जबकि जलीय समाधान में उच्च सामग्री, तीव्रता को कम करती है।इससे पता चलता है कि इस अणु का फ्लोरोसेंट का उत्सर्जन उस माध्यम पर अत्यधिक निर्भर करता है, जिसमें यह समाहित है । एक-से-एक अनुपात में मीडिया और इथेनॉल के मिश्रण का उपयोग करते समय, फ्लोरोसेंट की तीव्रता आनुपातिक रूप से बढ़ने लगती है, कोलेस्ट्रॉल एनालॉग की एकाग्रता के साथ, यह सुझाव देते हुए कि जांच इन स्थितियों के तहत उचित व्यवहार कर रही है। कोलेस्ट्रॉल स्वीकारकर्ताओं के साथ भरी हुई कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सेल मीडिया को विभिन्न समय बिंदुओं पर काटा जाता है।कोलेस्ट्रॉल efflux शून्य से छह घंटे के लिए रैखिक विकसित, अधिकतम संकेत के साथ छह घंटे के बाद ABDS कोशिकाओं में जोड़ा जाता है पर कब्जा कर लिया जा रहा है । संतृप्ति सीमा और गतिशील रेंज का परीक्षण एचडीएल के विभिन्न प्रतिशतों पर कोलेस्ट्रॉल efflux को मापकर किया जाता है जिसमें मीडिया होता है। उच्च थ्रूपुट परिसंपत्ति में, efflux एक से 7% ABDS के लिए रैखिक रूप से विकसित, 7% से अधिक सांद्रता पर कोलेस्ट्रॉल efflux क्षमता के शिखर तक पहुंचने 7% से अधिक है fluroescent तीव्रता ABDS प्रतिशत के साथ एक व्युत्क्रम संबंध में कम हो जाती है ।फ्लोरेसेंस आधारित विधि के प्रदर्शन को मानक रेडियो लेबल तकनीक से तुलना करके मूल्यांकन किया जाता है। एबीडीएस की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करते समय दोनों तकनीकें अत्यधिक सहसंबद्ध होती हैं। वर्णित विधि पांच और 15% के बीच कोलेस्ट्रॉल efflux मूल्यों के भीतर स्वीकार्यता की वृद्धि के प्रति संवेदनशील है यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सेल्यूअराइजर में कोई समुच्चय नहीं है।महत्वपूर्ण बिंदु एक समरूप, और इष्टतम वजन में फ्लोरेसेंस को मापने के लिए, पर्यावरण युक्त एक समग्र इथेनॉल को ग्रेड करना है। इस प्रक्रिया के बाद, नाम तकनीकी कोलेस्ट्रॉल मापा जा सकता है, और कोलेस्ट्रॉल efflux मार्ग में दवाओं के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। इसके अलावा स्कूल अंततः गधे हृदय जोखिम के लिए एक नैदानिक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।हमारा मानना है कि यह विधि रेडियोधर्मी मानक विधि की तुलना में बहुत आसान और सुरक्षित है। हालांकि यह अभी भी सेल निर्भर है। कृपया याद रखें कि इथेनॉल ज्वलनशील है और इसे संग्रहीत किया जाना चाहिए और तदनुसार संभाला जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Medicine

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

रिमोट phenotyping उच्च throughput के लिए माउस आँख का स्पष्टीकरण

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

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कोलेस्ट्रॉल तपका परख

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियाँ के लिए चिकित्सीय कारक की डिलिवरी के लिए इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं की उच्च throughput लक्षण वर्णन

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An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

प्राथमिक मल्टीपल मायलोमा प्रकोष्ठों की दवा संवेदनशीलता की विशेषता के लिए एक Organotypic उच्च Throughput सिस्टम

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

एक उच्च Throughput, मल्टिप्लेक्स और लक्षित प्रोटिओमिक सीएसएफ परख Neurodegenerative Biomarkers और apolipoprotein ई isoforms स्थिति यों

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Ivacaftor, इसके प्रमुख चयापचयों, और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के जैविक तरल पदार्थ में Lumacaftor के नैदानिक नमूनों के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूलित LC-ms/