Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall'Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l'Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall'ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l'invenzione.

Per questo studio, approvazione del comitato etico (Comitato Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcellona; numero di omologazione di HCB/2014/0756) e consenso informato scritto da tutti i soggetti sono stati ottenuti.
1. preparazione NBD-colesterolo
<ol><li>Sciogliere il NBD-colesterolo (MW 494.63; Vedi Tabella materiali) in etanolo puro per ottenere il brodo (2 mM). Per un flaconcino da 10 mg, sciogliere il contenuto di intero flaconcino in un volume di 10,1 ...

<ol>
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Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo,...

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l'endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le placche aterosclerotiche presentano un lipide cristalli core e colesterolo, evidenziati da misure di ecografia B-mode ad alta risoluzione della carotide intima media spessore4,5. Nei macrofagi, efflusso di colesterolo verso particelle lipidiche accettore è effettuato con mezzi dei recettori ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro sottofamiglia G trifosfato di adenosina 1 (ABCG1) e il recettore scavenger SR-BI. Lo squilibrio del colesterolo afflusso e deflusso nei macrofagi è considerato un processo chiave nella aterosclerosi iniziazione6. Efflusso di colesterolo è considerata un passo fondamentale nell'eliminazione del colesterolo dal tessuto periferico al plasma e nel fegato in un processo chiamato trasporto inverso del colesterolo (RCT). Colesterolo viene trasferito dai macrofagi principalmente ad apolipoproteina A1 (ApoA1) presenti sulla superficie delle particelle della lipoproteina ad alta densità (HDL). HDL trasportano quindi il colesterolo al fegato per escrezione e reimpiego7,8,9.
Tradizionalmente, colesterolo radiomarcato trizio (3H) è stato utilizzato in efflusso di colesterolo10. Il segnale di emissione dei radioisotopi è altamente sensibile10; Tuttavia, il colesterolo radiomarcato presenta evidenti svantaggi quali protocolli lunghi, rischio di esposizione a radiazioni ionizzanti e la necessità speciali radioattività strutture e attrezzature garantire l'uso sicuro dell'emissione radioattiva. Al contrario, fluorescenza è stato integrato con successo nelle tecniche diagnostiche grazie alla sua semplicità nella rilevazione del segnale fluorescente, l'ampia varietà di fluorofori disponibili e relativi di sicurezza11. Diversi steroli fluorescenti-etichettati sono stati usati per studiare il metabolismo del colesterolo compreso dehydroergosterol (con fluorescenza intrinseca), colesterolo di dansile, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterolo e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-OL (NBD-colesterolo). In particolare, NBD-colesterolo presenta un assorbimento efficiente in cellule umane12. Due differenti NBD etichettati-colesterolo sono attualmente disponibili: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterolo etichettato con parte 22-NBD soddisfino al meglio gli studi di efflusso di colesterolo, mentre 25-NBD-colesterolo pricipalmente è utilizzato nella membrana cellulare dinamica ricerca13,14.
Le linee cellulari in genere utilizzate nelle analisi di efflusso di colesterolo in vitro sono cellule monocito-come ad esempio cellule THP-1 leucemia-derivate essere umano, murino 264,7 cellule15o J774.1. Tutte queste cellule possono essere differenziate in macrofagi in vitro facendo uso di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), ma THP-1-macrofagi derivati (dmTHP-1) migliori riflettono e imitano i macrofagi umani16.
Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di alto-rendimento fluorescente per determinare la capacità di efflusso di colesterolo di campioni di siero su dmTHP-1, utilizzando 22-NBD-colesterolo come alternativa a [3H]-colesterolo. Inoltre, mettiamo a confronto la tecnica fluorescente ottimizzata con l'analogico standard radioattivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l'accumulo di colesterolo nell'endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un'analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Il dosaggio di efflusso di colesterolo mira a determinare in vitro la capacità di efflusso di colesterolo di un dato del siero, il plasma o il supernatante contenente particelle di HDL. Il metodo consiste di caricamento etichettati-colesterolo in una cultura di una linea cellulare del macrofago standard e inducendo il contatto con il campione di prova diluito in media FBS-liberi con le cellule. Infine, i livelli fluorescenti dal NBD sono misurati nei media e lysate delle cellule. Per ottimizzare le misure, il effluxed d...

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High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Questo protocollo è il nostro metodo a base cellulare per la terminazione del colesterolo del reflusso di colesterolo nel plasma ceramico. Soprattutto nelle proiezioni. Questo può essere applicato per diagnosticare il rischio cardiovascolare e per identificare o valutare il mantenimento del colesterolo più basso.Questa tecnica evita il rischio e gli oneri in quanto la sicurezza con la manipolazione di materiali irradiati fornendo risultati con livelli di qualità comparabili, a quelli del reflusso di colesterolo è stato segnalato per associarsi a Così, il reflusso plasmatico o colesterolo ceramico di accettato può essere confrontato, al nostro controllo di riferimento e può fornire il rischio di soffrire di Questo metodo sarà applicato anche alle linee cellulari , come altre linee cellulari umane o anche fasi macro primarie. Macro fasi o e cellule staminali a pulsante spray indotte dall'uomo. Per iniziare questa procedura, sciogliere il colesterolo NPD in etanolo puro per ottenere una soluzione stock con una concentrazione finale di due micromolari.Diluire 25 microlitri dello stock di colesterolo NBD nel mezzo AR 10 per raggiungere una concentrazione finale di cinque micromolari. Coltura thp-1 cellule nel nostro mezzo 10 a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni regolare la densità cellulare a 300000 cellule per millilitro.Quindi ottenere una piastra da 96 po 'con un fondo piatto e chiaro. Per una migliore omogeneizzazione, preparare 10 millilitri di cellule thp-1 in un tubo da 15 millilitri e aggiungere 200 microlitri di materiale PMA. Mescolare delicatamente e seminare 100 microlitri della miscela nei pozzi piastra a 200.000 cellule per pozzo.E incubare a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica per 48-72 ore per differenziare le cellule thp-1 in cellule DM thp-1. Prima diluire la glicina nel 10%PBS con acqua sterile, ad una concentrazione di 200 micromolari a pH 7,4. Aggiungere 40 millilitri di glicina diluita a 10 grammi di piolo 8000 per preparare una soluzione di peg del 20% e mescolare vigorosamente per omogeneizzare.Successivamente applicare quattro parti del 20% per 10 parti del campione su ciascun siero o campione di plasma in un tubo da 1,5 ml. Lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 minuti. Centrifugare il piolo apolipoproteina B precipitato a 13000 volte G, e a quattro gradi celsius per 15 minuti.Scartare il precipitato e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Recuperate la piastra contenente le celle thp-1 differenziate. Rimuovere e scartare il supporto di coltura, quindi lavare le celle due volte con 1X PBS.Aggiungere 100 microlitri di colesterolo MVD micromolare in ar-10 medio ad ogni pozzo. Incubare durante la notte a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo scartare, scartare il mezzo.Lavare le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere 100 microlitri ABDS, o accettore lipidico purificato diluito in rpmi 1630 medio alla concentrazione desiderata ad ogni pozzo. Includere un controllo negativo che non contenga accettori di colesterolo in un controllo positivo, come delineato nel protocollo di testo, e incubare a 37 gradi celsius per quattro o sei ore. Nel frattempo, preparare uno stock di 200 millilitri di soluzione di lysis cellulare uno come delineato nel testo.Mescolare questa soluzione con l'etanolo, ad un rapporto volumetrico uno a uno per ottenere anche la soluzione di lisi. Per il rilevamento del colesterolo media e BD, rimuovere il mezzo cellulare dalle piastre raccolte in una nuova piastra bianca da 96 po 'con un fondo piatto opaco. Aggiungere 100 microlitri di etanolo puro a 100 microlitri di ogni campione medio per ottenere un rapporto uno a uno nella nuova piastra.Usando un illuminometro, misurare l'intensità del fluorescente ad un'eccitazione di 463 nanometri e un'emissione di 536 nanometri. Per il rilevamento del colesterolo NBD intracellulare, lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungere anche 100 microlitri di soluzione di lisi ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente, tremando per 25 minuti.Successivamente, misurare l'intensità del fluorescente regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software. Quindi determinare il tasso di efflusso del colesterolo nella misura finale dell'efflusso di colesterolo come delineato nel protocollo di testo. Diluire il colesterolo NBD in etanolo puro produce i più alti valori di intensità fluorescente mentre un alto contenuto in soluzione acquosa, abbassa l'intensità.Ciò suggerisce che l'emissione fluorescente di questa molecola è altamente dipendente dal mezzo, in cui è contenuta. Quando si utilizza una miscela di media ed etanolo ad un rapporto uno a uno, l'intensità del fluorescente sembra aumentare proporzionalmente, con una concentrazione dell'analogo del colesterolo, suggerendo che la sonda si sta comportando in modo appropriato in queste condizioni. Per determinare la quantità di tempo necessaria per incubare le cellule caricate con accettori di colesterolo, il supporto cellulare viene raccolto in diversi punti di tempo.L'efflusso del colesterolo si è evoluto linearmente da zero a sei ore, con il segnale massimo catturato sei ore dopo l'aggiunta di ABDS alle cellule. La soglia di saturazione e l'intervallo dinamico vengono testati misurando l'efflusso di colesterolo a diverse percentuali di supporti contenenti HDL. Nell'asset ad alta produttività, l'efflux si evolve linearmente da uno al 7%ABDS, raggiungendo il picco della capacità di efflusso del colesterolo al 7%A concentrazioni superiori al 7% l'intensità del fluroescente diminuisce in una relazione inversa con la percentuale ABDS.Le prestazioni del metodo basato sulla fluorescenza vengono quindi valutate confrontandolo con la tecnica standard con etichetta radio. Entrambe le tecniche sono altamente correlate quando si utilizzano diverse concentrazioni di ABDS. Il metodo descritto è sensibile ad un aumento delle concentrazioni di accettori all'interno dei valori di efflusso del colesterolo tra il cinque e il 15%È importante assicurarsi che il celluarizer non contenga aggregati.Il punto critico è quello di classificare un etanolo aggregato contenente ambiente, per misurare la fluorescenza in un peso omogeneo e ottimale. Seguendo questa procedura, è possibile misurare il colesterolo tecnico del nome e determinare l'effetto dei farmaci nella via dell'efflusso del colesterolo. Anche la scuola alla fine viene utilizzata come diagnostica per valutare il rischio cardiovascolare.Riteniamo che questo metodo sia molto più facile e sicuro del metodo dello standard radioattivo. Tuttavia è ancora dipendente dalla cella. Si prega di ricordare che l'etanolo è infiammabile e deve essere conservato e maneggiato di conseguenza.

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