Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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この作品は、部分的に支えられてきた研究は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、マドリード、スペインから FIS (PS12/00866) を付与フォンド Europeo パラ エル開発地域 (フェダー);レッド ・ デ ・危惧アン SIDA (RIS) ISCIII 主任 (RD16/0025/0002)、CERCA プログラム/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ。レトロ ウイルス免疫病理学講座研究所 d'Investigacions Biomèdiques 8 月 Pi 私スニェ (IDIBAPS) を著者に感謝します。発明を保護する上で彼女の指導のため彼らの支援と知識と技術移転オフィスから s. Cufí、t. Escribà、C. Rovira と C. フルタドに感謝します。

本研究では、倫理委員会の承認 (Comitè Ètic d'Investigació 早速、病院クリニック、バルセロナ; 承認番号 HCB/2014/0756) とすべての科目の通知書面による同意が得られました。
1. NBD コレステロール準備
<ol><li>NBD-コレス トロールを溶かし (MW 494.63; 参照テーブルの材料) で純粋なエタノール (2 mM) の株式を取得します。10 mg バイアル 10.1 mL 量の 2 mM の在庫を取得する...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

蛍光標識されたコレステロールは、分析してプロパティおよび自然なコレステロールの体外代謝を調べる有望な戦略です。その主な利点は、それは、細胞内では、細胞によってとることができる膜分布研究科このプロトコル (図 7) のようにこのようなコレステロール排出アッセイを適用ことができます。いくつかの蛍光標識ステロールは、BODIPY コレステロール、ダンシ...

世界保健機関によると、死の世界の現在の主な原因は虚血性心疾患と脳卒中 (1520 万の死の合計のための会計)1。どちらも、動脈硬化や血管の2,3アテローム斑の破裂によって付けることができます心血管疾患 (CVD)。
動脈硬化は、血管壁炎症性疾患、マクロファージ、T 細胞、肥満細胞、樹状細胞、血管内皮細胞に潜入し、最終的に動脈硬化性プラークを形成、血から蓄積です。動脈硬化性プラークは脂質に頸動脈内膜メディアの厚さ4、5の高解像度の B モード超音波測定によって立証される、コアとコレステロールの結晶を提示します。マクロファージ、脂質受容体粒子へのコレステロール排出 (ABCG1) ATP 結合カセット (ABC) 受容体 ABCA1、ATP 結合カセット亜科 G メンバー 1 の手段とスカベン ジャー受容体 SR 双方向で実行されます。コレステロールの流入と流出マクロファージの不均衡は、アテローム性動脈硬化開始6キー プロセスと見なされます。プラズマに末梢の組織からコレステロール除去の重要なステップ、逆のコレステロールの輸送 (RCT) と呼ばれるプロセスで肝臓コレステロール排出であります。コレステロールは、主にアポリポ蛋白 A1 (ApoA1) 見つけられる大食細胞高密度リポタンパク質 (HDL) 粒子の表面にから転送されます。Hdl は、排泄と再利用の7,8,9の肝臓へのコレステロールを輸送します。
伝統的に、トリチウム (3H) ラジオ ラベル コレステロールは、コレステロール排出10で使用されています。放射性同位元素の発光信号が高感度10;但し、無線標識のコレステロールは長いプロトコル、電離放射線への暴露のリスクと放射性排出物の安全な取り扱いを確保するため特別な放射能設備と機器の必要性など明らかな障害を示します。それどころか、蛍光は蛍光信号検出、さまざまな fluorophores が付いて、およびその安全性11の単純さのための診断技術で正常に組み込まれています。いくつか蛍光標識ステロールは、コレステロールの代謝 (蛍光) と dehydroergosterol, ダンシル コレステロール, 4, 4-フッ素-3 a、4adiaza s indacene を含む (団) を研究に使用されている - コレステロール、および 22-(n-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD コレステロール)。特に、NBD コレステロールは人間の細胞12の効率的な吸収を示します。2 つ異なる NBD ラベル-コレステロールは、現在利用可能な: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) と 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD;図 1)。コレステロール 22 NBD 部が付いた可能性がありますコレステロール排出研究合わせて最高 25 NBD コレステロールは細胞膜のダイナミクス研究13,14で主に使用します。
通常コレステロールの体外排出の試金で使用される細胞は、THP 1 ひと白血病細胞、マウスの未加工 264.7 のセルの15、J774.1 など単球のようなセルです。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を用いてマクロファージに分化可能これらのセルのすべてが、THP-1 由来マクロファージ (dmTHP-1) ベスト反映、ヒトマクロファージ16を模倣します。
本研究では、最適化し、代わりに [3H] 22 NBD コレステロールを使用して dmTHP - 1、血清のコレステロール排出容量を決定する蛍光高スループット方法を標準化-コレステロール。さらに、我々 は標準的な放射性アナログと最適化された蛍光法を比較します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

動脈硬化は、心血管疾患 (CVD) に します。コレステロール HDL (cHDL) 濃度が動脈硬化の進展に因果的役割を果たしているかどうかは不明です。しかし、アテローマ プラーク形成の初期段階に重要な要因は HDL (大食細胞からコレステロールを受け入れるように HDL 粒子の能力) はコレステロール排出容量泡沫細胞の形成を避けるために。これは、血管内皮細胞との逆のコレステロールの輸送 (RCT) 肝臓でコレステロールを排除するために一部のコレステロールの蓄積を回避する上で重要なステップです。血清またはマクロファージ細胞モデルにおける血漿コレステロール排出能力は、アテローム性動脈硬化のマーカーとして使用できる有望なツールです。伝統的に、[3H]-コレステロールは、コレステロール排出試金で使用されています。本研究では THP-1 由来マクロファージのコレステロール摂取量と流出プロセスをトレースするアッセイで蛍光標識コレステロール (NBD コレステロール) を使用してより安全でより高速な戦略を開発する目指しています。最後に、我々 は、最適化 NBD コレステロール排出方法を標準化、96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発します。

コレステロール排出分析の目的は、生体外で与えられた血清、血漿、または HDL 粒子を含む上清のコレステロール排出容量を決定します。メソッドは標準のマクロファージ細胞株の培養にラベル コレステロールを読み込んで、セルと FBS 自由な媒体に希釈した試験サンプルと接触を誘発するから成っています。最後に、メディアと細胞ライセート、NBD から蛍光レベルが測定されます。測定を?...

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High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

血清または血漿マクロファージ細胞モデルの in vitro におけるコレステロール排出能力の測定は、動脈硬化症のバイオ マーカーとして有望なツールです。本研究で我々 は、蛍光 NBD コレステロール排出法を標準化して 96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発を最適化します。

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

このプロトコルは、細胞血漿中のコレステロール逆流のコレステロール終了のための私達の細胞ベースの方法である。特にスクリーニングで。これは、心血管リスクを診断するために適用することができます, 識別またはコレステロール低いメンテナンスを評価します。.この技術は、同等の品質レベルで結果を提供することにより放射物質を取り扱う際の安全性としてのリスクと負担を回避し、コレステロール還流の結果が従って関連すると報告されているが、受け入れられた血漿またはセラマルコレステロール還流を比較することができ、我々の参照制御に対してこの方法も細胞株に適用されるリスクを提供する可能性がある他のヒト細胞株や一次マクロ相と同様に。マクロ相またはヒト誘導スプレーボタン幹細胞。この手順を開始するには、NPDコレステロールを純粋なエタノールに溶解し、2つのマイクロモルの最終濃度でストック溶液を得る。5マイクロモルの最終濃度に達するために、AR10培地でNBDコレステロールストックの25マイクロリットルを希釈する。37°Cで摂氏10培地中のthp-1細胞を5%の二酸化炭素で培養します。3日ごとに、1ミリリットル当たり300000個の細胞に細胞密度を調整します。その後、平らな透明な底を持つ96ウェルプレートを得る。より良い均質化のために、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルのthp-1細胞を調製し、PMAストックの200マイクロリットルを加えます。100,000個の細胞をウェルあたり200,000個のプレートウェルにそっと混ぜて100マイクロリットルのプレートウェルに混ぜます。そして、thp-1細胞をDM thp-1細胞に分化するために、5%の二酸化炭素を5%の二酸化炭素で37°Cでインキュベートします。まず、滅菌水で10%PBSでグリシンを希釈し、pH7.4で200マイクロモルの濃度にする。40ミリリットルの希釈グリシンをペグ8000グラムに加えて20%ペグ溶液を調製し、均質化するために激しく混ぜます。次に、1.5 mlチューブの各血清または血漿サンプルに、サンプルの10個あたり20%の4つの部分を適用します。混合物を氷の上に25分間放置します。ペグアポリポタンパク質Bを13000倍Gで沈殿させ、摂氏4度で15分間遠心分離する。沈殿物を捨て、上清を新しいチューブに移します。分化した thp-1 細胞を含むプレートを取得します。培地を取り出して捨て、次いで1X PBSで細胞を2回洗浄する。各ウェルにAR-10培地に5ミクロモルMVDコレステロールの100マイクロリットルを追加します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日は破棄し、培地を破棄します。細胞をPBSで2回洗浄し、ABDSを100マイクロリットル加え、または精製した脂質アクセクターを各ウェルに所望の濃度にrpmi 1630培地で希釈した。テキストプロトコルに概説されているように、コレステロールアクセクサを含まない陰性コントロールを正の対照に含め、摂氏37度で4〜6時間インキュベートする。一方、テキストに概説されているように、細胞溶解溶液1の200ミリリットルのストックを調製する。この溶液をエタノールと混合し、1対1の体積比で溶解溶液も得る。メディアおよびBDコレステロール検出の場合は、不透明な平らな底を持つ新しい白い96ウェルプレートに集められたプレートから細胞媒体を取り除きます。純エタノール100マイクロリットルを各培地サンプル100マイクロリットルに加え、新しいプレートで1対1の比率を得る。照度計を使用して、463ナノメートルの励起で蛍光強度を測定し、536ナノメートルの放出を測定します。細胞内NBDコレステロール検出のために、PBSで細胞を2回洗浄します。100マイクロリットルの溶解溶液を各ウェルに加え、室温でインキュベートし、25分間振ります。この後、ソフトウェアで感度パラメータを50に調整しながら蛍光度を測定します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、コレステロール流出の最終尺度でコレステロール流出率を決定する。純粋なエタノール中でNBDコレステロールを希釈すると蛍光強度値が最も高くなり、水溶液中の含有量が高く、強度が低下します。これは、この分子の蛍光発光が含まれる媒体に大きく依存していることを示唆している。1対1の比率で培地とエタノールを混合して使用する場合、蛍光強度は比例的に増加するようで、コレステロールアナログの濃度に伴い、プローブがこれらの条件下で適切に振る舞っていることを示唆している。コレステロールアクセクサでロードされた細胞をインキュベートするのに必要な時間を決定するために、細胞培地は異なる時点で収穫される。コレステロール流出はゼロから6時間に直線的に進化し、ABDSが細胞に加えられた6時間後に最大シグナルが捕捉された。飽和閾値およびダイナミックレンジは、HDL含有媒体の異なる割合でコレステロール流出を測定することによって試験される。高スループット資産では、流出は1から7%ABDSに直線的に進化し、7%でコレステロール流出容量のピークに達し、7%より高い濃度で、ABDSパーセントとの逆関係で蛍光症の強度が低下する。蛍光ベースの方法の性能は、標準のラジオ標識技術と比較することによって評価される。ABDSの異なる濃度を使用する場合、両方の技術は非常に相関しています。上記の方法は、コレステロール流出値内のアクセプター濃度の増加に対して感受性が5〜15%の間で、セルアリゼが凝集体を含みないようにすることが重要である。重要な点は、エタノール含有環境を凝集体し、均質で蛍光を測定し、最適な重量を採点する。この手順に従って、名前の技術的なコレステロールを測定することができ、コレステロール流出経路における薬物の効果を決定することができる。また、学校は最終的に心血管リスクを装う診断として使用されます。放射性標準法に比べ、よりずっと簡単で安全だと考えています。しかし、それはまだセルに依存しています。エタノールは可燃性であり、それに応じて保管・取り扱うべきであることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Medicine

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リモートハイスループット表現型解析のためのマウスの目の摘出

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

コレステロール流出アッセイ

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

急性移植片対宿主病のバイオマーカーの検証のためのハイスループットシーケンシャルELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベルコレステロール排出アッセイ