Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Dette arbeidet har vært delvis støttet av forskning gir FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spania. Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og søk etter program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium av Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres hjelp og S. Cufí fra kunnskap og teknologi overføre Office for sin veiledning i å beskytte oppfinnelsen.

For denne studien, ble etisk komité godkjenning (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, sykehus klinikk, Barcelona, godkjenningsnummer HCB/2014/0756) og skriftlig informert samtykke fra alle fag innhentet.
1. neste arbeidsdag-kolesterol forberedelse
<ol><li>Oppløse NBD-kolesterol (MW 494.63, se Tabellen for materiale) i ren etanol for å få aksjer (2 mM). For en 10 mg hetteglass, løses hele medisinglass innholdet i en 10,1 mL volum av etanol å få en 2 mM lager.</li>
	...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

Merket med fluorescerende kolesterol er en lovende strategi for å analysere og undersøke egenskapene og metabolisme av naturlige kolesterol i vitro. De viktigste fordelene er at det kan tas av celler, tillater intracellulær og membran distribusjon studier, og kan brukes på kolesterol middelklasseinnbyggere analyser som denne protokollen (figur 7). Noen fluorescerende-merket steroler tillate kolesterol sporing i vitro inkludert BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol og 22...

Ifølge Verdens helseorganisasjon er de gjeldende viktigste årsakene til dødsfall verdensomspennende iskemisk hjertesykdom og hjerneslag (Regnskapsførsel for totalt 15,2 millioner dødsfall)1. Begge er karsykdommer (CVD) som kan innledes med åreforkalkning og brudd på plaketter av atheroma i blodårene2,3.
Atherosclerosis er et fartøyet veggen inflammatorisk sykdom som makrofager, T-celler, mastceller og dendrittiske celler infiltrere endotelet og akkumuleres fra blod, til slutt danne aterosklerotisk plaketter. Aterosklerotisk plaketter presentere en lipid kjernen og kolesterol krystaller, dokumentert av høyoppløselige B-modus ultrasonography målinger av carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager utføres kolesterol middelklasseinnbyggere mot lipid acceptor partikler av ATP-bindende kassett (ABC) receptors ABCA1, ATP bindende kassett gruppe G medlem 1 (ABCG1), og scavenger receptor SR-BI. Ubalansen av kolesterol tilstrømningen og middelklasseinnbyggere i makrofager er ansett som en viktig prosess i aterosklerose innvielsen6. Kolesterol middelklasseinnbyggere er ansett som et viktig skritt i kolesterol eliminering fra perifere vev plasma og lever i en prosess som kalles omvendt kolesterol transport (RCT). Kolesterol overføres fra makrofager hovedsakelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) på overflaten av high-density lipoprotein (HDL) partikler. Deretter transportere HDL kolesterol til leveren for utskillelse og re utnyttelse7,8,9.
Tritium (3H) radio-merket kolesterol er tradisjonelt brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere10. Utslipp signalet fra radioisotopes er svært følsom10; imidlertid presenterer radio-merket kolesterol åpenbare handikap som lang protokoller, risiko for eksponering for ioniserende stråling og behovet for spesiell radioaktivitet lokaler og utstyr å sikre trygg håndtering av radioaktivt utslipp. Tvert imot, vært fluorescens vellykket innarbeidet i diagnostiske teknikker på grunn av sin enkelhet i fluorescerende signalgjenkjenning, rekke fluorophores tilgjengelige og dens sikkerhet11. Flere fluorescerende-merket steroler har blitt brukt til å studere kolesterol metabolisme inkludert dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Spesielt, presenterer NBD-kolesterol en effektiv opptak i menneskelige celler12. To forskjellige NBD merket-kolesterol er tilgjengelige: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol merket med 22-NBD moiety kan best passer kolesterol middelklasseinnbyggere studier, mens 25-NBD-kolesterol brukes hovedsakelig i mobilnettet membran dynamics research13,14.
Cellelinjer vanligvis brukes i i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere analyser er monocytt-lignende celler som menneskelige leukemi-avledet THP-1 celler, murine rå 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse cellene kan differensieres i makrofager i vitro bruker phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), men THP-1-derivert makrofager (dmTHP-1) beste reflektere og etterligne menneskelige makrofager16.
Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende høy gjennomstrømming metode for å fastslå kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet serumprøver på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. I tillegg sammenligne vi optimalisert fluorescerende teknikken med standard radioaktivt analog.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Aterosklerose fører til hjerte-og karsykdommer (CVD). Det er fortsatt uklart om kolesterol-HDL (cHDL) konsentrasjon spiller en årsakssammenheng rolle i aterosklerose utvikling. En viktig faktor i tidlige stadier av atheroma plakk formasjon er imidlertid kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til HDL (muligheten til HDL partikler godta kolesterol fra makrofager) for å unngå skum celle formasjon. Dette er et viktig skritt unngå akkumulering av kolesterol i endotelet og en del av omvendt kolesterol transport (RCT) for å eliminere kolesterol gjennom leveren. Kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som kan brukes som biomarkør for aterosklerose. Tradisjonelt [3H]-kolesterol er brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere analyser. I denne studien ønsker vi å utvikle en tryggere og raskere strategi med fluorescerende merket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en mobilnettet analysen å spore kolesterol opptak og middelklasseinnbyggere prosessen THP-1-derivert makrofager. Til slutt, vi optimalisere og standardisere NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metoden og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.

Formålet med kolesterol middelklasseinnbyggere analysen er å bestemme i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere kapasiteten til en gitt serum, plasma eller nedbryting inneholder HDL partikler. Metoden består av laste merket-kolesterol i en kultur av en standard macrophage cellen linje og inducing kontakt med testing prøven fortynnet i FBS-frie medier med celler. Til slutt, fluorescerende nivåer fra NBD måles i media og celle lysate. For å optimalisere målinger, er effluxed kolesterol fra cellene til media blandet...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Måling av i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som en biomarkør for aterosklerose. Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metode og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Denne protokollen er vår cellebaserte metode for kolesterolavslutning av kolesterol refluks i ceramal plasma. Spesielt i screeninger. Dette kan brukes til å diagnostisere kardiovaskulær risiko, og for å identifisere eller evaluere kolesterol lavere vedlikehold.Denne teknikken unngår risiko og byrder som sikkerhet til med håndtering av utstrålte materialer ved å gi resultater med sammenlignbare kvalitetsnivåer, til de av Kolesterol refluks har blitt rapportert å assosiere med Dermed, plasma eller ceramal kolesterol refluks av akseptert kan sammenlignes, til vår referansekontroll og kan gi risiko for å lide av Denne metoden vil også bli brukt på cellelinjene , som andre menneskelige cellelinjer eller til og med primære makrofaser. Makrofaser eller og menneskelige induserte sprayknappstamceller. For å begynne denne prosedyren, oppløs NPD-kolesterolet i rent etanol for å oppnå en lagerløsning med en endelig konsentrasjon av to mikromos.Fortynn 25 mikroliter av NBD kolesterol lager i AR 10 medium for å nå en endelig konsentrasjon på fem mikromos. Kultur thp-1 celler i våre 10 medium på 37 grader celsius med 5% karbondioksid. Hver tredje dag justerer celletettheten til 300000 celler per milliliter.Deretter får du en 96-brønns plate med en flat klar bunn. For bedre homogenisering, forberede en 10 milliliter av thp-1 celler i en 15 milliliter rør, og legge til 200 mikroliter pma lager. Bland forsiktig og frø 100 mikroliter av blandingen i platebrønnene ved 200 000 celler per brønn.Og inkuber ved 37 grader celsius med 5% karbondioksid i 48 til 72 timer for å skille thp-1 cellene i DM thp-1 celler. Fortynn glycin først i 10 % PBS med sterilt vann, til en konsentrasjon på 200 mikromos ved pH 7,4. Tilsett 40 milliliter fortynnet glycin til 10 gram peg 8000 for å forberede en 20% peg løsning, og bland kraftig for å homogenisere.Deretter påfør fire deler av 20% per 10 deler av prøven til hvert serum eller plasmaprøve i et 1,5 ml rør. La blandingen stå på is i 25 minutter. Sentrifuge pinnen apolipoprotein B utfelt på 13000 ganger G, og ved fire grader celsius i 15 minutter.Kast bunnstinen, og overfør det overnaturlige til et nytt rør. Hent platen som inneholder de differensierte thp-1-cellene. Fjern og kast kulturmediet, og vask deretter cellene to ganger med 1X PBS.Tilsett 100 mikroliter med 5 mikromolar MVD-kolesterol i AR-10-medium til hver brønn. Inkuber over natten ved 37 grader celsius med 5%karbondioksid. Neste dag kastes, kast mediet.Vask cellene to ganger med PBS, og tilsett deretter 100 mikroliter ABDS, eller renset lipid acceptor fortynnet i rpmi 1630 medium til ønsket konsentrasjon til hver brønn. Inkluder en negativ kontroll som ikke inneholder kolesterol akseptorer i en positiv kontroll, som beskrevet i tekstprotokollen, og inkubere ved 37 grader celsius i fire til seks timer. I mellomtiden, forberede en 200 milliliter lager av cellelys løsning en som beskrevet i teksten.Bland denne løsningen med etanol, med en en-til-en volumetrisk forhold for å oppnå lysis løsning også. For media og BD kolesterol deteksjon, fjern cellemediet fra platene i samlet i en ny hvit 96-brønnsplate med en ugjennomsiktig flat bunn. Tilsett 100 mikroliter ren etanol til 100 mikroliter av hver medium prøve for å oppnå et en-til-en-forhold i den nye platen.Bruk et illuminometer, mål fluorescerende intensitet ved en eksitasjon på 463 nanometer, og et utslipp på 536 nanometer. For intracellulær NBD kolesterol deteksjon, vask cellene to ganger med PBS. Tilsett 100 mikroliter lysisløsning også til hver brønn, og inkuber ved romtemperatur, mens du rister i 25 minutter.Etter dette måler du fluorescerende intensitet mens du justerer følsomhetsparameteren til 50 i programvaren. Deretter bestemmer kolesterol efflux rate i det endelige målet av kolesterol efflux som beskrevet i tekstprotokollen. Fortynning av NBD-kolesterol i ren etanol produserer de høyeste fluorescerende intensitetsverdiene, mens et høyt innhold i vandig løsning senker intensiteten.Dette tyder på at fluorescerende utslipp av dette molekylet er svært avhengig av mediet, der det er inneholdt. Ved bruk av en blanding av media og etanol i et en-til-en-forhold, ser fluorescerende intensitet ut til å øke proporsjonalt, med en konsentrasjon av kolesterolanalogen, noe som tyder på at sonden oppfører seg passende under disse forholdene. For å bestemme hvor lang tid som kreves for å inkubere de lastede cellene med kolesterol acceptorer, høstes cellemedier på forskjellige tidspunkter.Kolesterol efflux utviklet seg lineært fra null til seks timer, med det maksimale signalet blir fanget seks timer etter ABDS er lagt til cellene. Metningsterskelen og det dynamiske området testes ved å måle kolesterolspluksen ved ulike prosentandeler av HDL som inneholder medier. I den høye gjennomstrømningsressursen utvikler efflux seg lineært fra en til 7% ABDS, og når toppen av kolesterol efflukskapasiteten ved 7%Ved konsentrasjoner høyere enn 7% reduseres fluroescentens intensitet i et omvendt forhold til ABDS-prosentandelen.Ytelsen til fluorescensbasert metode evalueres deretter ved å sammenligne den med standard radiomerket teknikk. Begge teknikkene er svært korrelert ved bruk av ulike konsentrasjoner av ABDS. Den beskrevne metoden er følsom for en økning av akseptorkonsentrasjoner innenfor kolesterol effluksverdier mellom fem og 15%Det er viktig å sikre at celluarizeren ikke inneholder aggregater.Kritisk punkt er å vurdere et samlet etanolholdig miljø, for å måle fluorescensen i en homogen og optimal vekt. Etter denne prosedyren kan navn teknisk kolesterol måles, og effekten av legemidler i kolesterol effluksbanen kan bestemmes. Også skolen til slutt bli brukt som en diagnostisk å easer kardiovaskulær risiko.Vi mener at denne metoden er mye enklere og sikrere enn den radioaktive standardmetoden. Men det er fortsatt celleavhengig. Husk at etanol er brennbart, og det skal lagres og håndteres tilsvarende.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

Kolesterol effluks Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Høy gjennomstrømning Sekvensiell ELISA for validering av biomarkører for akutt transplantat-mot-vert-sykdom

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Høy gjennomstrømning Karakterisering av voksne stamceller Konstruert for levering av terapeutiske faktorer for nervecellene strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En høy gjennomstrømning, multiplekset og målrettet proteomikk CSF-analyse for å kvantifisere nevrodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E-isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimalisert LC--MS-/ MS metoden for høy gjennomstrømming analyse av klinisk prøver av Ivacaftor, store metabolitter og Lumacaftor i biologiske væsker Cystic Fibrosis pasienter