Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Эта работа частично поддерживается исследовательских грантов FIS (PS12/00866) из Instituto de Salud Карлоса III, Мадрид, Испания; Fondo Europeo Comisión para el Desarrollo региональных (ФЕДЕР); Красный де инвестигасьон en СИДА (рис), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) и CERCA программы / Женералитата Каталонии. Авторы благодарят Retrovirology и вирусная лаборатория иммунопатологии Institut d'Investigacions Pi Biomèdiques августа I Сунийе (IDIBAPS). Мы благодарим т. Escribà, C. Ровира и C. Уртадо за их помощь и S. Cufí от знания и технологии передачи управления за ее руководство в деле защиты изобретения.

Для этого исследования были получены утверждения этического Комитета (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, больницы, Барселона; номер утверждения ГХБ/2014/0756) и письменного информированного согласия от всех субъектов.
1. NBD-холестерин подготовка
<ol><li>Растворите NBD-холестерина (494.63 МВт; см...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

Флуоресцентные, меченного холестерин является перспективной стратегией для анализа и изучения свойств и метаболизма природных холестерина в пробирке. Его основными преимуществами являются, что он может быть take up клетки, позволяет для внутриклеточного и мембраны исследования распред...

По данным Всемирной организации здравоохранения текущий главных причин смерти во всем мире являются ишемическая болезнь сердца и инсульта (приходится в общей сложности 15,2 миллиона смертей)1. Оба являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые могут предшествовать атеросклероза и разрыв атеромы бляшки в сосудах2,3.
Атеросклероз является судно стены воспалительное заболевание в котором макрофагов, Т-клетки, тучные клетки и дендритных клеток проникнуть эндотелия и накапливаются в крови, в конечном итоге формирование атеросклеротических бляшек. Атеросклеротические бляшки представляют липидного ядра и холестерина кристаллы, подтверждается разрешением измерения B-режим УЗИ сонных интима медиа толщина4,5. В макрофагах холестерин измеряем сторону липидов акцептора частиц осуществляется средствами СПС привязки кассеты (ABC) рецепторов ABCA1, АТФ привязки кассеты член subfamily G 1 (ABCG1), и мусорщик рецептор SR-Би. Дисбаланс приток холестерина и измеряем в макрофагах считается ключевой процесс атеросклероза инициации6. Холестерин измеряем считается ключевым шагом в ликвидации холестерина от периферических тканей к плазме крови и печени в процессе, называемом обратный холестерина транспорта (РКИ). Холестерин переносится из макрофагов, главным образом для Аполипопротеин А1 (ApoA1) на поверхности частиц липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). HDL затем транспорт холестерина в печени для выведения и повторного использования7,8,9.
Традиционно тритий (3H) цианокобаламина, меченного холестерин используется в холестерин измеряем10. Сигнал выбросов радиоизотопов является весьма деликатным10; Однако цианокобаламина, меченного холестерин представляет очевидные недостатки как долго протоколы, риска воздействия ионизирующего излучения и потребность в специальных радиоактивности объектов и оборудования для обеспечения безопасной обработки радиоактивных выбросов. Напротив флуоресценции была успешно включена в методы диагностики благодаря своей простоте в флуоресцентного сигнала, широкий спектр доступных флуорофоров и ее безопасности11. Несколько флуоресцентные, меченного стерины были использованы для изучения метаболизма холестерина включая dehydroergosterol (с внутренней флуоресценции), Дансил холестерина, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - холестерин и 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-холестерин). В частности НБД холестерин представляет эффективное усвоение в клетки человека12. В настоящее время имеются два различных NBD помечены холестерин: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) и 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-НБД; Рисунок 1). Холестерин, помечены 22-NBD остаток может лучше всего подходят для исследования измеряем холестерина, в то время как 25-NBD-холестерин используется главным образом в клеточной мембраны динамика исследований13,14.
Линии клетки обычно используется в пробирке холестерина измеряем анализов являются Моноцит подобных клеток, таких как клетки человека лейкоз производные THP-1, мышиных Raw 264.7 клетки15или J774.1. Все эти клетки могут быть дифференцированы в макрофагов в пробирке с использованием phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA), но THP-1-производные макрофагов (dmTHP-1) лучший отражают и имитировать человека макрофаги16.
В настоящем исследовании, мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод высокой пропускной способностью для определения способности измеряем холестерина сыворотки образцов на dmTHP-1, используя 22-NBD-холестерина в качестве альтернативы [3H]-холестерина. Кроме того мы сравниваем оптимизированный флуоресцентные технику с стандартного аналогового радиоактивных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Атеросклероз приводит к сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). До сих пор неясно, является ли концентрации холестерина ЛПВП (cHDL) играет причинную роль в развитии атеросклероза. Однако, важным фактором в ранних стадиях формирования атеромы доска является способности измеряем холестерина ЛПВП (способность HDL частиц принять холестерина из макрофагов) для того, чтобы избежать образование клеток пены. Это ключевой шаг в избегая накопление холестерина в эндотелия и частью обратного холестерина транспорта (РКИ), чтобы устранить холестерина через печень. Холестерин измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является многообещающим инструментом, который может использоваться в качестве биомаркеров для атеросклероза. Традиционно [3H]-холестерина был использован в холестерин измеряем анализов. В этом исследовании мы стремимся разработать стратегию безопаснее и быстрее, с использованием флуоресцентных помечены холестерина (NBD-холестерин) в клеточном assay проследить процесс поглощения и измеряем холестерина в THP-1-производные макрофагов. Наконец мы оптимизации и стандартизировать метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.

Цель анализа измеряем холестерина необходимо определить в vitro измеряем потенциала данного сыворотка, плазма или супернатанта, содержащей частицы HDL холестерина. Этот метод состоит из загрузки обозначены холестерина в культуру клеточной линии стандартного макрофагов и вызывая контак?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Измерение холестерина в пробирке измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является перспективным средством как биомаркер для атеросклероза. В настоящем исследовании мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.

Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Этот протокол является нашим методом на основе клеток для прекращения холестерина холестерина рефлюкс в керамальной плазме. Особенно в показах. Это может быть применено для диагностики сердечно-сосудистого риска, а также для выявления или оценки снижения уровня холестерина.Этот метод позволяет избежать риска и бремени, как безопасность с обработкой излученных материалов, предоставляя результаты с сопоставимыми уровнями качества, к тем, холестерин рефлюкс, как сообщается, ассоциируется с Таким образом, плазмы или керамального холестерина рефлюкс принято можно сравнить, к нашей ссылки контроля и может обеспечить риск страдать от этого метода также будет применяться к клеточным линиям , как и другие линии клеток человека или даже первичные макро фазы. Макро фазы или индуцированных человеком стволовых клеток кнопки спрей. Чтобы начать эту процедуру, растворить холестерин NPD в чистом этаноле, чтобы получить фондовый раствор с окончательной концентрацией двух микромоляров.Разбавить 25 микролитров холестеринового запаса NBD в среде AR 10, чтобы достичь конечной концентрации пяти микромоляров. Культура thp-1 клеток в нашей среде 10 при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Каждые три дня настраивайте плотность клеток до 300 000 клеток на миллилитр.Затем получить 96-хорошо пластины с плоским ясным дном. Для лучшей гомогенизации приготовьте 10 миллилитров клеток thp-1 в 15 миллилитровой трубке и добавьте 200 микролитров запаса PMA. Смешайте осторожно и семян 100 микролитров смеси в пластины скважин на 200000 клеток на скважину.И инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 48 до 72 часов, чтобы дифференцировать клетки thp-1 в DM thp-1 клеток. Первый разбавить глицин в 10%PBS со стерильной водой, в концентрации 200 микромолей при рН 7,4. Добавить 40 миллилитров разбавленного глицина до 10 граммов колышек 8000, чтобы подготовить 20%peg раствор, и энергично перемешать, чтобы гомогенизировать.Затем нанесите четыре части по 20% на 10 частей образца на каждый образец сыворотки или плазмы в трубке 1,5 мл. Оставьте смесь на льду на 25 минут. Центрифуга колышек аполипопротеин B осаждается в 13000 раз G, и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут.Отбросьте осадок и перенесите супернатант в новую трубку. Извлеките пластину, содержащую дифференцированные клетки thp-1. Удалите и отбросьте культурную среду, а затем дважды промыть клетки с помощью 1X PBS.Добавьте 100 микролитров 5 микромоляных холестерина MVD в АР-10 среды к каждой хорошо. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. На следующий день отбросьте, отбросьте носитель.Вымойте клетки дважды с PBS, а затем добавить 100 микролитров ABDS, или очищенный липидный приемщик разбавленный в rpmi 1630 среды к желаемой концентрации к каждой хорошо. Включите отрицательный контроль, который не содержит холестерина принимает в положительном контроле, как указано в текстовом протоколе, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение четырех-шести часов. Между тем, подготовить 200 миллилитров запасов клеточного лиза решение 1, как указано в тексте.Смешайте это решение с этанолом, при соотношении один к одному объему, чтобы получить раствор лиза тоже. Для обнаружения холестерина в средствах массовой информации и BD удалите клеточную среду из пластин, собранных в новую белую пластину 96-колодец с непрозрачным плоским дном. Добавьте 100 микролитров чистого этанола в 100 микролитров каждого среднего образца, чтобы получить соотношение один к одному в новой пластине.Используя иллюминометр, измеряйте интенсивность флуоресцентных ламп при возбуждении 463 нанометров и выбросе 536 нанометров. Для внутриклеточного обнаружения холестерина NBD, мыть клетки дважды с PBS. Добавить 100 микролитров раствора лиза тоже к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре, в то время как тряска в течение 25 минут.После этого измерьте интенсивность флуоресцентных ламп при регулировке параметра чувствительности до 50 в программном обеспечении. Затем определить уровень холестерина эффлюкса в окончательной мере холестерина efflux, как указано в текстовом протоколе. Разбавление холестерина NBD в чистом этаноле производит самые высокие значения интенсивности флуоресцентных в то время как высокое содержание в aqueous растворе, снижает интенсивность.Это говорит о том, что излучение этой молекулы флуоресцентными лампами сильно зависит от среды, в которой она содержится. При использовании смеси средств массовой информации и этанола в соотношении один к одному, интенсивность флуоресцентных, кажется, увеличивается пропорционально, с концентрацией холестерина аналог, предполагая, что зонд ведет себя надлежащим в этих условиях. Чтобы определить количество времени, необходимое для инкубации загруженных клеток с холестерином приемов, клеточные средства массовой информации собирают в разных точках времени.Эффлюкс холестерина эволюционировал линейно от нуля до шести часов, при этом максимальный сигнал был захвачен через шесть часов после добавления ABDS в клетки. Порог насыщения и динамический диапазон проверяются путем измерения эффлюкса холестерина на разных процентах HDL, содержащих средства массовой информации. В высокой пропускной способности актива, эффлюкс развивается линейно от одного до 7%ABDS, достигнув пика холестерина efflux потенциала на 7%При концентрациях выше, чем 7%интенсивность флуоресцентных уменьшается в обратной связи с процентом ABDS.Производительность метода на основе флуоресценции затем оценивается путем сравнения его со стандартной радио помеченной техникой. Оба метода сильно коррелируют при использовании различных концентраций ABDS. Описанный метод чувствителен к увеличению концентрации приемора в значениях холестерина эффлюкса между 5 и 15%Важно обеспечить, чтобы целлааризер не содержит агрегатов.Критическим моментом является оценка совокупного этанола, содержащего окружающую среду, для измерения флуоресценции в однородном и оптимальном весе. После этой процедуры, название технического холестерина может быть измерена, и влияние препаратов в холестерин эффлюкс путь может быть определена. Кроме того, школа в конечном итоге будет использоваться в качестве диагностики ослов сердечно-сосудистого риска.Мы считаем, что этот метод гораздо проще и безопаснее, чем метод радиоактивного стандарта. Однако он по-прежнему зависит от клеток. Пожалуйста, помните, что этанол является воспламеняемым и он должен храниться и обрабатываться соответствующим образом.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Высокая пропускная способность автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для белка терапии

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Мышь глаз Энуклеация для удаленного высокой пропускной Фенотипирование

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

Холестерин Анализ истечения

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Высокая пропускная способность, Multiplexed и Targeted Протеомный CSF Анализ на Количественно нейродегенеративных биомаркеров и аполипопротеина Е изоформы Статус

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Оптимизированный метод LC-MS/MS для высокой пропускной способности анализа клинических образцов Ivacaftor, его основных метаболитов и Lumacaftor в биологических жидкостях больных муковисцидозом