Name: high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

Detta arbete har varit delvis stöds av forskningen ger FIS (PS12/00866) från Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien. Fondo Europeo para el Desarrollo regionala (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) och CERCA programmet / Generalitat de Catalunya. Författarna tackar Retrovirology och Viral Immunopathology laboratorium av den Institut d'Investigacions Biomèdiques augusti Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi tackar T. Escriba, C. Rovira och C. Hurtado för deras stöd och S. Cufí kunskap och teknologi Transfer Office för henne vägledning i skydd av uppfinningen.

För denna studie erhölls godkännande från etiska kommittén (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona, godkännandenummer HCB/2014/0756) och skriftlig, informerade samtycke från alla ämnen.
1. NBD-kolesterol förberedelse
<ol><li>Lös upp NBD-kolesterol (MW 494.63, se Tabell för material) i ren etanol för att få beståndet (2 mM). För en 10 mg injektionsflaska, lös hela flaskans innehåll i en 10,1 mL volym etanol att erhålla en 2 mM lag...

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+atherosclerosis.">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li><li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis.">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li><li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells.">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).</li><li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease.">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li><li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis.">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li><li>Escol&#224;-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements:+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection.">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li><li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-cholesterol:+Is+it+really+good?+Differences+between+apoA-I+and+HDL.">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li><li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method.">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li><li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples:+Systematic+Review+of+the+Literature.">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li><li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells.">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li><li>Osta&#353;ov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells:+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion.">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages.">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li><li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages.">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li><li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+Assay.">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li><li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+reporter+molecules.">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li><li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanden+Development+of+a+Cell-Based,+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol.">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li><li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function:+implications+for+novel+therapies.">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li><li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function.">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sage+weed+(Salvia+plebeia)+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages.">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li><li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport:+Experimental+Approaches.">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li><li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+efflux+capacity,+high-density+lipoprotein+function,+and+atherosclerosis.">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li><li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events.">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li></ol>

Lysrör-märkt kolesterol är en lovande strategi för att analysera och undersöka egenskaper och metabolismen av naturliga kolesterol in vitro. Dess främsta fördelar är att det kan tas upp av celler, möjliggör intracellulära och membran distributionsstudier, och kan tillämpas på kolesterol efflux analyser såsom i detta protokoll (figur 7). Vissa lysrör-märkt steroler tillåta kolesterol spårning in vitro-inklusive BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol och 22 -...

Enligt Världshälsoorganisationen är nuvarande huvudsakliga dödsorsakerna över hela världen ischemisk hjärtsjukdom och stroke (redovisning för totalt 15,2 miljoner dödsfall)1. Båda är hjärt-kärlsjukdom (CVD) som kan föregås av åderförkalkning och bristning av aterom plack i blodkärlen2,3.
Åderförkalkning är en fartyget vägg inflammatorisk sjukdom där makrofager, T-celler, mastceller och dendritiska celler infiltrera endotelet och ackumuleras från blodet, så småningom bilda aterosklerotiska plack. Aterosklerotiska plack presenterar en lipid core och kolesterol kristaller, framgår av högupplösta B-mode ultraljud mätningar av den carotid intima-media tjocklek4,5. I makrofager utförs kolesterol efflux mot lipid acceptor partiklar med medel av ATP-bindande kassett (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindande kassett underfamilj G medlem 1 (ABCG1), och gatsopare receptorn SR-BI. Obalansen av kolesterol inflödet och utflödet i makrofager anses vara en viktig process i åderförkalkning inledande6. Kolesterol efflux anses vara ett viktigt steg i kolesterol elimination från perifer vävnad till plasma och lever i en process som kallas omvänd kolesterol transport (RCT). Kolesterol är överförs från makrofager främst till apolipoprotein A1 (ApoA1) finns på ytan av high-density lipoprotein (HDL) partiklar. HDLs sedan transporterar kolesterol till levern för utsöndring och återanvändning7,8,9.
Tritium (3H) isotopmärkt kolesterol har traditionellt använts i kolesterol efflux10. Utsläpp signalen av radioisotoper är mycket känsliga10; isotopmärkt kolesterol presenterar emellertid uppenbara nackdelar såsom lång protokoll, risk för exponering för joniserande strålning och behovet av särskilda radioaktivitet faciliteter och utrustning för att garantera säker hantering av radioaktivt utsläpp. Tvärtom, har fluorescens integrerats framgångsrikt i diagnosmetoder tack vare sin enkelhet i fluorescerande signaldetektion, en stor mängd fluorophores tillgänglig och dess säkerhet11. Flera lysrör-märkt växtsteroler har använts för att studera kolesterol metabolism inklusive dehydroergosterol (med inneboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol och 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Särskilt, presenterar NBD-kolesterol ett effektivt upptag i mänskliga celler12. Två olika NBD märkt-kolesterol är för närvarande tillgängliga: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) och 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; (Se figur 1). Kolesterol märkt med 22-NBD biexponentiellt kan bäst passa kolesterol efflux studier, medan 25-NBD-kolesterol används främst i cellulära membran dynamics forskning13,14.
Cellinjer som normalt används i in vitro-kolesterol efflux analyser är monocyt-liknande celler såsom mänskliga leukemi-derived THP-1 celler, murina Raw 264,7 celler15eller J774.1. Alla dessa celler kan differentieras till makrofager i vitro använder phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA), men THP-1-härledda makrofager (dmTHP-1) bästa reflektera och efterlikna det mänskliga makrofager16.
I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande hög genomströmning metod för att bestämma kolesterol efflux kapacitet serumprover på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som ett alternativ till [3H]-kolesterol. Dessutom jämför vi optimerade fluorescerande tekniken med standard radioaktiva analog.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well collecting plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3912</td>
			<td>white 96-well plate with opaque clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>Costar 3610</td>
			<td>white 96-well plate with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196985</td>
			<td>commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorless RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7509</td>
			<td>RPMI 1640 with no pehnol-red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8790-100G</td>
			<td>Glycine, non-animal use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>SYNERGY HT</td>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 1</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Solution 2</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-cholesterol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N1148</td>
			<td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&#946;-Ol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Phosphate-buffered&#160;saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202452-250G</td>
			<td>polyethylene glycol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td>Phorbol 12-merystate B-acetate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R10</td>
			<td>in-house</td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ATCC, #TIB-202</td>
			<td>monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled cholesterol efflux assay

Åderförkalkning leder till hjärt-kärlsjukdom (CVD). Det är fortfarande oklart om kolesterolet-HDL (cHDL) koncentration spelar en kausal roll i utveckling av åderförkalkning. Men en viktig faktor i tidigt skede av aterom plack är kolesterol efflux kapacitet att HDL (HDL partiklar förmåga att acceptera kolesterol från makrofager) för att undvika skum cellnybildningen. Detta är ett viktigt steg i att undvika ansamling av kolesterol i endotelet och en del av omvänd kolesterol transport (RCT) för att eliminera kolesterol genom levern. Kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som kan användas som biomarkör för åderförkalkning. Traditionellt, [3H]-kolesterol har använts i kolesterol efflux analyser. I denna studie, vi strävar efter att utveckla en strategi för säkrare och snabbare som använder fluorescerande märkt-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulär analysen att spåra kolesterol upptag och efflux processen i THP-1-härledda makrofager. Slutligen, vi optimera och standardisera metoden NBD-kolesterol efflux och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.

Syftet med kolesterol efflux analysen är att bestämma in vitro-kolesterol efflux kapaciteten hos ett givet serum, plasma eller supernatanten innehållande HDL partiklar. Metoden består av lastning märkt-kolesterol till en kultur av en standard makrofag cellinje och förmå kontakt med testning provet spädas i FBS-fria medier med celler. Slutligen mäts de fluorescerande nivåerna från NBD i media och cell lysate. För att optimera mätningar, blandas effluxed kolesterol från cellerna till media med en volym av en ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Mätning av in vitro-kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som en biomarkör för åderförkalkning. I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande NBD-kolesterol efflux metod och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-märkt kolesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Detta protokoll är vår cell baserad metod för kolesterol uppsägning av kolesterol reflux i ceramal plasma. Särskilt vid visningar. Detta kan tillämpas för att diagnostisera kardiovaskulär risk, och att identifiera eller utvärdera kolesterol lägre underhåll.Denna teknik undviker risken och belastar som säkerheten till med hantering av utstrålade material genom att ge resultat med jämförbara kvalitetsnivåer, till de av Kolesterol reflux har rapporterats att associera med Således, plasma eller ceramal kolesterol reflux av vedertagna kan jämföras, till vår referenskontroll och kan ge risken att drabbas av Denna metod kommer också att tillämpas på cellinjerna , som andra mänskliga cellinjer eller till och med primära makrofaser. Makro faser eller och mänskliga inducerad sprayknapp stamceller. För att påbörja detta förfarande, lös NPD-kolesterolet i ren etanol för att få en stamlösning med en slutlig koncentration av två mikromolar.Späd 25 mikroliter av NBD-kolesterolbeståndet i AR 10 medium för att nå en slutlig koncentration av fem mikromolar. Kultur thp-1 celler i vår 10 medium vid 37 grader celsius med 5%koldioxid. Var tredje dag justerar celltätheten till 300000 celler per milliliter.Erhåll sedan en 96-brunnsplatta med en platt klar botten. För bättre homogenisering, förbereda en 10 milliliter av thp-1 celler i en 15 milliliter rör, och tillsätt 200 mikroliter PMA lager. Blanda försiktigt och frö 100 mikroliter av blandningen i plattan brunnar på 200, 000 celler per brunn.Och inkubera vid 37 grader celsius med 5%koldioxid i 48 till 72 timmar för att differentiera thp-1 cellerna i DM thp-1 celler. Späd först glycin i 10%PBS med sterilt vatten, till en koncentration av 200 mikromolar vid pH 7,4. Tillsätt 40 milliliter utspädd glycin till 10 gram peg 8000 för att förbereda en 20%peg lösning, och blanda kraftigt för att homogenisera.Därefter applicera fyra delar på 20%per 10 delar av provet på varje serum eller plasmaprov i ett 1,5 ml-rör. Låt blandningen stå på is i 25 minuter. Centrifug pinnen apolipoprotein B fälls vid 13000 gånger G, och vid fyra grader celsius i 15 minuter.Kasta fällningen och överför supernatanten till ett nytt rör. Hämta plattan som innehåller de differentierade thp-1 cellerna. Ta bort och kasta odlingsmediet och tvätta sedan cellerna två gånger med 1X PBS.Tillsätt 100 mikroliter av 5 mikromolar MVD-kolesterol i AR-10 medium till varje brunn. Inkubera över natten vid 37 grader varmt med 5%koldioxid. Nästa dag kasta, kasta mediet.Tvätta cellerna två gånger med PBS, och tillsätt sedan 100 mikroliter ABDS, eller renad lipid acceptor utspädd i RPMI 1630 medium till önskad koncentration till varje brunn. Inkludera en negativ kontroll som inte innehåller kolesterol acceptorer i en positiv kontroll, som beskrivs i textprotokollet, och inkubera vid 37 grader celsius i fyra till sex timmar. Under tiden, förbereda en 200 milliliter lager av cell lys lösning en som beskrivs i texten.Blanda denna lösning med etanol, vid ett en-till-ett volymetriskt förhållande för att erhålla lyslösning också. För media och BD-kolesteroldetektering, ta bort cellmediet från plattorna i samlas i en ny vit 96-brunnsplatta med en ogenomskinlig platt botten. Tillsätt 100 mikroliter av ren etanol till 100 mikroliter av varje medelprov för att få ett förhållande mellan ett till ett i den nya plattan.Med hjälp av en illuminometer, mäta fluorescerande intensitet vid en excitation av 463 nanometer, och ett utsläpp av 536 nanometer. För intracellulär NBD-kolesteroldetektion, tvätta cellerna två gånger med PBS. Tillsätt 100 mikroliter av lyslösning för till varje brunn, och inkubera vid rumstemperatur, medan skakar i 25 minuter.Efter detta mäter du lysrörets intensitet samtidigt som känslighetsparametern justeras till 50 i programvaran. Sedan bestämma kolesterol efflux kurs i det slutliga måttet på kolesterol efflux som beskrivs i texten protokollet. Spädning NBD-kolesterol i ren etanol producerar de högsta fluorescerande intensitetsvärdena medan en hög halt i vattenlösning, sänker intensiteten.Detta tyder på att fluorescerande utsläpp av denna molekyl är mycket beroende av mediet, där det finns. Vid användning av en blandning av media och etanol vid ett förhållande mellan en till en, fluorescerande intensitet verkar öka proportionellt, med en koncentration av kolesterol analoga, vilket tyder på att sonden beter sig lämpligt under dessa förhållanden. För att bestämma hur lång tid som krävs för att inkubera de laddade cellerna med kolesterolreceptorer, skördas cellmedia vid olika tidpunkter.Kolesterolet efflux utvecklats linjärt från noll till sex timmar, med den maximala signalen fångas sex timmar efter ABDS läggs till cellerna. Mättnadströskeln och det dynamiska omfånget testas genom att kolesterolet efflux mäts vid olika procenttal av HDL som innehåller media. I den höga genomströmningstillgången utvecklas effluxen linjärt från en till 7%ABDS och når toppen av kolesterol effluxkapacitet vid 7%Vid koncentrationer högre än 7%minskar fluroescerande intensitet i ett omvänt förhållande till ABDS-procenten.Prestandan för fluorescens baserad metod utvärderas sedan genom att jämföra den med standardradion märkt teknik. Båda teknikerna är starkt korrelerade vid användning av olika koncentrationer av ABDS. Den beskrivna metoden är känslig för en ökning av acceptorkoncentrationer inom kolesterol effluxvärden mellan fem och 15%Det är viktigt att säkerställa att celluarizern inte innehåller några aggregat.Kritisk punkt är att betygsätta en samlad etanol som innehåller miljö, för att mäta fluorescensen i en homogen, och optimal vikt. Efter detta förfarande, namn tekniskt kolesterol kan mätas, och effekten av läkemedel i kolesterol efflux väg kan fastställas. Även skolan så småningom användas som en diagnostisk för att asses kardiovaskulär risk.Vi anser att denna metod är mycket enklare och säkrare än den radioaktiva standardmetoden. Emellertid är det stilla cellberoende. Kom ihåg att etanol är brandfarligt och det bör förvaras och hanteras därefter.

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

En hög kapacitet automatiserad plattform för utveckling av tillverkning cellinjer för proteinläkemedel

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Mus Eye enucleation för Remote hög kapacitet Fenotypning

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Cholesterol Efflux Assay

Kolesterol Utflöde Analys

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hög genomströmning Sekventiell ELISA för validering av biomarkörer för akut graft-versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hög genomströmning karakterisering av vuxna stamceller Engineered för leverans av terapeutiska faktorer för Nervskyddande Strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En hög genomströmning, Multiplex och riktade proteomik CSF analys för att kvantifiera neurodegenerativa Biomarkers och apolipoprotein E isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimerad LC-MS/MS metod för High-throughput analys av kliniska prover av ivakaftor, dess huvudmetaboliter och lumakaftor i biologiska vätskor av cystisk fibros patienter