Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
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本手稿中提出的中东呼吸综合征项目的研究资金由国家卫生研究院赠款 r21 aa111085 提供。这项猫科动物冠状病毒研究得到了莫里斯动物基金会、温恩·菲琳基金会和康奈尔队猫健康中心的研究资助。我们还要感谢马利克·皮里斯在向我们公开访问之前向我们提供了 mor213 序列。

1. 多肽的设计和制备
<ol><li>从公共数据库 (如 ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 或病毒病原体数据库 (https://www.viprbrc.org) 获取感兴趣的融合蛋白序列。选择融合肽之前的蛋白酶识别位置, 并包括该序列上游和下游的2-3 种氨基酸。</li>
	<li>订购多肽时, 用 n-末端的 fret 对 7-甲氧基香豆素-4-基乙酰 (mca) 和 c 端的 n-2-4-二硝基苯 (dnp) 对其进行修改。 注: 多个供应商提供这些修改。价格和交货时间取决于选择的供应商。但是, 存在着灵敏度不同的替代修改, 需要根据波长对板式读取器进行调整。</li>
	<li>根据厂家的建议, 通过轻轻的上下移液来重新释放肽。例如, 将70% 乙醇中的多肽重新悬浮到 1 mm 的最终浓度。</li>
	<li>或者, 将含有该肽和溶剂的管添加到超声浴中, 直到它完全重新悬浮, 如果该肽不能通过移液很好地重新悬浮。</li>
	<li>将肽注入光抑制或耐药管中, 以保护肽不漂白。保持小尺寸, 以避免多次冻水/解冻周期 (例如, 100μl)。在-20°c 下储存脂肪。</li>
</ol>2. 准备荧光板读取器
<ol><li>打开板读取器, 等待自检完成。</li>
	<li>打开连接的计算机上的操作软件, 并确保它与板式读取器连接。</li>
	<li>打开温度设置, 并设置为 30°c (或所需的温度, 以获得最佳的蛋白酶性能)。</li>
	<li>点击控制仪器设置设置实验。</li>
	<li>选择 "动能"。</li>
	<li>选择 "荧光"。</li>
	<li>输入激发和发射波长: 分别为330纳米和 390 nm。</li>
	<li>取消选择 "自动截断"。</li>
	<li>选择中等、正常灵敏度。</li>
	<li>为检测选择1小时的运行时, 每60秒选择一次测量。</li>
	<li>在第一次测量前设置5秒的混合, 在每次测量前设置3秒的混合</li>
	<li>选择要读取的井, 然后开始检测。</li>
</ol>3. 准备检测
<ol><li>通过计算每个成分的适当数量并将其添加, 准备检测缓冲液。对于呋喃, 使缓冲液由 100 mm hepes、1 mm ccl2、1 mm 2-硫醇、5% triton x-100 组成。对于胰蛋白酶, 请使用标准的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 溶液。 注:10 毫升或以下的数量就足够了。根据检测中使用的蛋白酶, 缓冲液会有所不同。</li>
	<li>将缓冲区冷却在冰上。</li>
	<li>将检测板放在冰上, 下面有一个薄薄的金属板, 以支持冷却和稳定性。使用实心黑色聚苯乙烯96孔板与平底和未经处理。 注: 必须使用黑色板, 以防止荧光 "泄漏" 从相邻的水井。</li>
	<li>根据以前的出版物或实验数据, 计算每个反应要添加的适当蛋白酶量。对于呋喃, 每个反应使用1个单位, 对应于0.5μl。对于胰蛋白酶, 使用0.5μl 的 160 nm tpck 胰蛋白酶。</li>
	<li>每个样品在每个样品100μl 的总体积内, 每个测定准备3个技术复制。 注: 实验评估表明, 移液是在正常光线条件下进行还是在变暗的光线下进行, 并无区别。然而, 多肽不应该长时间暴露在光线下。</li>
	<li>将适当数量的检测缓冲液 (如步骤3.1 所述为 94.5μl) 输送到每口井中。</li>
	<li>在每口井中加入蛋白酶。对于这两种情况, 呋喃和 tpck 胰蛋白酶, 每个样品使用0.5μl。到6口 (3 口井为空白控制, 3 口井为肽控制), 加入0.5μl 缓冲液, 而不是相应的蛋白酶。</li>
	<li>将肽添加到每口井的最终浓度 50μm, 但空白对照除外。在这种情况下, 移液器5μl 肽按步骤1.3 下的描述制备。在空白对照中加入5μl 的缓冲液, 而不是肽。 注: 最初用所述的酶浓度测试了几种肽的浓度, 以确保酶饱和。</li>
	<li>将印版插入荧光板读取器, 然后单击 "开始"。</li>
</ol>4. 数据分析
<ol><li>保存实验文件。</li>
	<li>单击"导出" 并将文件导出为. txt。</li>
	<li>将. txt 文件导入到电子表格中。</li>
	<li>对于每个样本的每个技术复制, 创建一个图形, 根据 x 轴上的时间绘制 y 轴上的相对荧光单位 (rfu) (补充图 1)。</li>
	<li>选择图形处于线性范围内的数据范围, 以及最接近荧光开始的数据范围。</li>
	<li>在第二个图形上绘制选定的数据, 并添加线性趋势线。</li>
	<li>在趋势线选项中选择在图表上显示公式。该方程将显示 vmax。</li>
	<li>从3个技术复制中计算每个样本的平均 vmax。</li>
	<li>再重复两次实验, 获得3个生物复制。</li>
	<li>根据3个独立生物复制的数据计算标准偏差。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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作者没有什么可透露的。

我们在这里提出了一个荧光肽检测, 允许快速筛选蛋白质序列的蛋白质溶解裂解的蛋白酶。在我们的第一个例子中, 我们选择了中东呼吸综合征冠状病毒尖峰 (s) 蛋白的不同裂解部位图案来说明这种检测的一个应用。几种包覆的病毒具有 i 类融合蛋白, 如中东呼吸综合征冠状病毒、sars-cov (严重急性呼吸系统综合症) 和流感, 是公众健康的主要关切, 新的亚型不断发展, 有可能发生跨物种从他们的自然宿主到人类的障碍 1,15,16。隔离病毒并在实验室培养病毒可能并不总是可行的, 也需要没有在每个研究设施中都有的特殊实验室。因此, 有必要采取各种方法, 评估可在常规实验室条件下进行的新出现的病毒对公共卫生的潜在威胁。除了针对人类的病毒外, 一些动物病毒, 如 fcov 也拥有相同的一类 i 融合蛋白, 因此, 具有与人类相似的特征。隔离这些病毒也可能是一个挑战, 因此有必要使用创新工具来研究它们。
上述病毒生命周期中的一个关键步骤是宿主细胞进入和融合介导的蛋白质溶解处理各自的融合蛋白由宿主蛋白酶1,2。研究病毒生命周期这一部分的标准方法是将融合蛋白基因克隆成哺乳动物的表达载体, 转染哺乳动物细胞, 允许蛋白质表达, 孵育或与感兴趣的蛋白酶共同转染, 分离出蛋白质, 并进行西方印迹分析。这种方法有几个局限性: 病毒 dna/rna 的克隆可用性, 如果没有 dna 或 rna, 合成基因的成本, 检测融合蛋白及其裂解产物的抗体的存在, 它可能需要几个直到整个研究完成前的几周。它甚至变得更加耗时, 金钱和劳动密集型, 如果这项研究的兴趣是调查几个突变在裂解部位, 因为它需要现场定向突变。我们在这里描述的荧光肽检测方法没有这些限制。感兴趣的肽可以根据公开的序列进行设计, 有几个供应商提供广泛的重组蛋白酶, 这些都与这类研究相关, 包括分析在内的分析可以在单日。
在我们的例子中, 我们研究了来自埃及和摩洛哥的人类和骆驼的中东呼吸综合征冠状病毒 s 蛋白的 s2 蛋白酶识别位点的呋喃介导的裂解。人类 emc2 2012 和骆驼 hku205 s2 ' 网站都包含一个典型的 rxxxr 呋喃裂解图案。然而, 根据 pitou 2.0 裂解评分算法, hku205 s2 ' 站点不会被呋喃切割, 我们通过实验证实了19。hku5 s2 ' 未通过呋喃处理的原因可能是 p1 位置上的异亮氨酸。当我们测试两个肽, 携带个别突变在 emc/2012 s2 序列中, 我们能够证实, 在 p1 ' 基本上是滥用裂解, 而丙氨酸的丝氨酸替代导致减少裂解。mor213 s2 网站不包含呋喃裂解图案, 几乎没有发现裂痕也就不足为奇了。我们还研究了呋喃是如何裂解 fcvs s 蛋白的 s划破和 s2 蛋白酶识别位点的。我们能够观察到两个寄在于 fecv 肽 (fecv i 和 4 sgens2 和 fecv ii 1683 s2 ') 的呋喃裂解, 而 fipv 病毒的突变序列不是通过呋喃裂解的。
当将 emc/2 s2 ' 肽 (图 1a) 的毛皮介导的裂解与 fecv i and-4 s半肽 (图 2a) 进行比较时, 我们发现 vmax 大约相差26倍。这可以用两个序列中的呋喃裂解母题来解释 (表 1)。虽然呋喃裂解的最低要求是 rxxxr 主题, 但 rxrr 序列要有利得多 2.因此, 具有 rsar 主题的 emc/2 2012 s2 ' 肽与包含 rsrr 呋喃裂解部位的 fecv i and-4 sgen2 肽相比, 其特异性较低 (表 1)。
然而, 检测的一个主要限制是, 肽不能反映它们通常嵌入的蛋白质的三级结构。全长融合蛋白的裂解暴露融合肽并触发宿主细胞进入 1。蛋白酶和融合蛋白之间的相互作用也可能受到融合蛋白三级结构的影响, 而我们认为多肽或多或少是线性的。因此, 在肽检测中检测到的裂解可能是人为的, 可能不能反映体内的情况。这是报告的流感 h3n2 ha 亚型的基质的基质酶。虽然有几个小组在肽检测中描述了 h3n2 ha 的裂解, 但也表明, 在细胞培养中培养全长 h3n2 ha 蛋白和基质酶并没有导致热原 ha 蛋白 4,20, 21岁还有其他例子表明, 蛋白质溶解裂解的生物学重要调节是在蛋白质构象水平上。据介绍, 融合蛋白有时需要一系列的融合前事件, 以便能够在融合时暴露裂解部位。例如, semliki 森林病毒融合蛋白需要在一些预灌注事件中进行结构重组, 以暴露其融合蛋白, 并使其可用于蛋白溶解性活化22。因此, 在荧光肽检测中获得的结果需要通过细胞融合检测或类似实验加以验证。然而, 肽检测仍然允许快速筛选几种蛋白质/肽组合, 并减少分娩和后续实验的时间, 因为不显示裂解的组合很可能在体内表现出相同的结果。
检测的第二个主要限制是蛋白酶。到目前为止, 只能测试可溶性蛋白酶, 而不能检测跨膜蛋白酶。根据实验的意图, 这可能是一个问题。例如, has 是由许多位于细胞膜8的跨膜蛋白酶激活的。在一定程度上, 这个问题可以通过使用可溶性蛋白溶解活性域来规避, 但结果必须谨慎解释, 并应使用常规方法进行验证。我们要参考前面提到的例子与基质酶及其对 h3n2 ha 的活性。体内基质酶位于细胞膜中, 但市售的酶是可溶性催化域。正如所讨论的关于融合蛋白, 它可能也需要全长蛋白酶与全长蛋白质底物相互作用, 获得裂解, 只检测单个域可能会导致假阳性。
该方法已被证明是有效的研究特定氨基酸序列的富林。然而, 该技术的应用扩展到任何可用的蛋白酶 (例如, 蛋白酶, 丙蛋白转化酶), 使其成为筛选蛋白酶裂解肽候选物的有用方法。此外, 它已经表明, 该方法也可以用来测试蛋白酶抑制剂的疗效, 从而提供了一个快速和容易工具筛选蛋白质抑制剂23。
此处描述的荧光肽裂解法是对生物信息裂解评分算法的补充, 该算法根据氨基酸的性质和序列, 通过确定的蛋白酶预测肽裂解。这两种技术, 结合传统的西方印迹技术, 可以作为一种有效的方法, 研究蛋白酶裂解体外。

病毒与宿主细胞膜的融合是包膜病毒生命周期中的一个关键步骤, 有助于病毒进入细胞和复制。通常情况下, 病毒拥有一种特殊的蛋白质 (或蛋白质), 与宿主细胞膜上的受体结合, 并触发病毒细胞膜融合1。病毒融合蛋白被分为三个主要类别 (i-iii)1。目前主要关注公共卫生的一些病毒, 如流感病毒 (代表鸟类长期出现的人畜共患) 和中东呼吸道综合征冠状病毒 (中东呼吸综合征冠状病毒) (代表最近的人畜共患)从骆驼中出现), 利用所谓的 i 类融合蛋白, 这需要由宿主蛋白酶进行蛋白溶解处理, 发挥其致热活性2。同样, 猫冠状病毒 (fcov), 它是野生和家庭猫的主要疾病威胁, 也拥有一级融合蛋白。i 类病毒融合蛋白通常是作为一个未分离的前体合成的, 通常由两个域组成, 分别负责受体结合和触发融合事件。到目前为止, 流感血凝素 (ha) 是最容易理解的融合蛋白, 许多研究已经描述了它在宿主细胞进入和融合中的机械作用3。在这种情况下, 融合蛋白的裂解发生在 ha 内的特定序列或裂解部位, 并结合 ph 相关构象变化, 导致病毒融合肽1,2的暴露。
融合肽及其先前的蛋白酶识别序列对病毒的致病性和宿主适应性至关重要。蛋白酶识别序列的变化会显著改变裂解, 对病毒和宿主4可能造成剧烈的后果。一方面 , 它可以废除 , 从而消除病毒的生命周期。但另一方面, 突变可以增加给定蛋白酶的底物特异性和/或允许一个 "新的" 蛋白酶来分裂融合蛋白。随后, 这也可以扩大观察到的细胞和组织的取向,例如,与流感病毒亚型 5,6。通常低致病性禽流感 (lpai) 病毒和大多数人类流感病毒被限制在胃肠道或呼吸道, 因为激活它们的蛋白酶的定位有限。通常情况下, 这种 ha 蛋白的融合肽之前有一个四氨基酸序列, 其中包括1-2 个非连续的基本氨基酸, 这是由胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶, 如胰蛋白酶, 基质酶或 tmprss27 识别,8. 当病毒获得插入或突变, 改变裂解部位到一个多基部位, 它允许呋喃激活 ha, 并有可能导致更严重的系统性感染6,9。这些病毒被称为高致病性禽流感病毒 (hpai), 以 h5n1 株为典型。
与 ha 流感不同的是, 许多冠状病毒, 如中东呼吸综合征冠状病毒, 在其穗蛋白中有两个不同的裂解位点。s2012年5s2 站点将 n-终端受体结合域 (s1) 与 c-终端融合域 (s2) 分离, 并在 s恋爱2站点的下游使用第二个裂解位点, 称为 s2 ', 靠近融合肽10。有人建议, 这些地点是按顺序在 squem2, 然后是 s2 '。与大多数流感病毒株的 ha 相比, 中东呼吸综合征冠状蛋白 snys2 和 s2 ' 位点可以通过前列腺蛋白逆转录酶 (pc) 家族的蛋白酶 (如呋喃) 来识别。这个家族的成员在与母题 rp-(x)0, 2, 4,6-rqk (x, 任何氨基酸)2配对的基本残留物上裂开。通常, 裂解部位上游的氨基酸称为 p1、p2、p3等。从裂解部位和氨基酸下游计数被指定为 p1 ', p2 ', p3 ' 等. 11. fcov 菌株可以有一个单一的或双裂解部位。与中东呼吸综合征冠状病毒一样, 一些 fcov 菌株在其 s 蛋白中也具有两个裂解位点 (s恋爱2和 s2 ')。然而, 这一特性是排除了血清型 i fcov (clade a)。相反, 血清型 ii (clade b) 分组的成员只有一个裂解点 (s2 ')2,12。一些蛋白酶已被建议裂开 fcov 裂解位点, 包括呋喃, 胰蛋白酶样蛋白酶和蛋白酶。有人提出, 肠内 fcov (也称为猫肠道冠状病毒或 fecv) 的 s 蛋白很可能在 s小路2站点被呋喃切割, 而在这个部位 (以及 s2 ') 的突变会导致蛋白酶要求的变化。这些突变与这些病毒的取向和致病性的变化有关, 使病毒成为系统性和巨噬细胞热带 (也称为猫科动物传染性腹膜炎病毒或 fipv)13。
病毒在每个复制周期自然地将突变引入其基因组, 并经常描述新的亚型和流感亚型和株, 中东呼吸综合征冠状病毒和 fcov 描述为14,15,16。作为评估新出现病毒对公众健康威胁的快速评估的一部分, 调查裂解部位的变化及其如何影响激活这些病毒的蛋白酶的范围至关重要。在这里, 我们描述了一种基于消化的检测方法, 该方法可以非常快速地评估中东呼吸综合征冠状蛋白的裂解位点如何影响给定蛋白酶的底物特异性, 并快速筛选各种蛋白酶, 以确保其能够裂解给定的或多个序列4。在第二组实验中, 我们使用该技术确定不同 fcov 血清型和菌株的呋喃裂解活性。
本试验中使用的多肽通过荧光共振能量转移 (fret) 对、n 端的 7-甲氧基香豆素-4-基乙酰 (mca) 和 c 端的 n-2, 4-二硝基苯 (dnp) 进行改性。在检测过程中, 只要两人彼此靠近, mca 就会兴奋并发出被 dnp 淬火的光能。然而, 如果发生裂解, dnp 不能再排出, 它可以被荧光板读取器读取。在实验过程中测量荧光的变化, 以确定肽裂解率, 并计算蛋白酶裂解特定肽 (也称为 vmax)17的速度。
为了设计多肽, 必须对相应融合蛋白的基因进行测序, 或在数据库中提供。然而, 这种方法的劳动强度和成本都比传统方法要小, 而传统方法通常需要将融合蛋白基因克隆到表达载体中, 以便在哺乳动物细胞中表达, 从而分析裂解。从开始到结束, 这可能需要几天到几个星期, 而在这里介绍的肽检测可以在一天内完成, 只要肽和蛋白酶是可用的。根据样本数量和荧光版读取器中的运行时间, 检测的设置需要 5到30分钟, 时间为 1小时. 根据样本大小的不同, 对数据的分析可能需要长达2小时的时间。
在这里, 我们选择了两个不同的例子来介绍该分析。在第一个例子中, 我们提供的数据比较了人和骆驼衍生的中东呼吸综合征冠状病毒的呋喃介导的裂解, 以评估骆驼衍生的菌株在人类中被激活的潜力, 如果他们越过物种屏障。在第二个例子中, 我们使用荧光肽检测来确定两个血清型 i 和两个血清型 ii fcv 菌株的 s供需2和 s2 ' 位点或 s2 ' 位点的皮膜介导的裂解。在这些实验中, 我们使用胰蛋白酶裂解作为阳性对照。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

包膜病毒, 如冠状病毒或流感病毒, 需要他们的融合蛋白的蛋白溶解裂解, 才能感染宿主细胞。病毒通常表现出细胞和组织的取向, 并适应特定的细胞或组织蛋白酶。此外, 这些病毒可以在复制过程中引入突变或插入到他们的基因组中, 这可能会影响裂解, 从而有助于适应新的宿主。在这里, 我们提出了一个氟原肽裂解检测, 允许快速筛选肽模仿病毒融合蛋白的裂解位点。该技术非常灵活, 可用于研究单个蛋白酶在许多不同底物上的蛋白水解活性, 此外, 它还允许探索在一个或多个肽底物上的多个蛋白酶的活性。在这项研究中, 我们使用的肽模仿裂隙位点的冠状病毒穗蛋白的图案。我们测试了人类和骆驼衍生的中东呼吸综合征冠状病毒 (mers-cov), 以证明在裂解部位的单次和双取代可以改变腹股沟的活性, 并极大地改变裂解效率。我们还使用该方法结合生物信息学来测试不同血清型和菌株的猫科动物冠状病毒尖峰蛋白的呋喃裂解活性。与用于分析病毒蛋白溶解活性的常规方法相比, 这种基于肽的方法的劳动和时间强度较低, 可以在一天内获得结果。

在本研究的第一部分, 我们使用了代表三种不同中东呼吸综合征冠状病毒 s 蛋白的 s2 ' 裂解位点的肽: 来自典型 emc/2 2012 人类毒株 (genbank afs88936.1) 和两个选定的骆驼衍生中东呼吸综合征-cov, nrce-hku205 (genbankahl18090.1) 和 mor215 菌株 (genbank avn89324.1), 分别在埃及和摩洛哥分离 (表 1)16,18。
与 emc/2 2012 菌株相比, hku205 s2 ' 裂解位在 p2 和 p1 ' 位置有两个突变, 可能会影响其识别, 并改变裂解效率 (表 1)。此外, 我们有兴趣研究在 hku205 菌株中发现的每一个个体突变是否以及如何影响呋喃裂解。因此, 我们包括两个多肽, 其中在 emc/2012 肽序列中引入了单独的替代 (emc/2 2012 muta-s s2 ' 和 emc/2 muts-i s2 ') (表 1)。furin 能够以 6.3±1.2 rfu:min 的 vmax 高效地分离 emc/2 2012 肽, 而我们在使用 hku205 菌株的 s2 肽 (vmax 0.5±0.1 rfu min) 时几乎没有裂解 (图 1a)。在研究 emc/2 2012 muta-s s2 ' 肽时, 我们发现与野生类型序列 (vmax 3.6±1 rfu min) 相比, 裂解率明显降低。在测试 emc 2012 mutS-I s2 ' 肽 (vmax 1.1±0.9 rfu min) 时, 几乎没有裂解 (图 1a)。
最近, 据报告, 来自西非的中东呼吸综合征冠状病毒分离株在系统发育上与阿拉伯半岛16号发现的中东呼吸综合征冠状病毒不同。最近描述的分离株之一是 mor213 菌株, 它在 s2 ' 站点的 p4 位置 (表 1) 中携带亮氨酸而不是精氨酸, 并可能通过呋喃和改变裂解效率来影响其识别。我们的肽检测表明, 与 emc/2 2012 站点相比, mor213 s2 ' 位点的裂解率仅为最小值 (图 1b)。mor213 肽的 vmax 为1.0±0.1。
在本研究的第二部分, 我们使用相同的肽检测来评估 fcvs 蛋白裂解位点的毛皮介导裂解。我们使用的肽模仿 snys2 裂解位点的两个 fcov 血清型 i 病毒: fecv i and-4 (来自惠特克实验室) 和 fipv i 黑色 (genbank AB088223.1)。我们还使用了模仿这些病毒 s2 的肽, 以及两个 fcov 血清型 ii: fecv ii 1683 (genbank afh58021.1) 和 fipv ii 1146 (genbank ay2596.1) 菌株 (表 1)。通常情况下, 当基本残留物 (精氨酸和赖氨酸) 存在于裂解部位的 p1 和 p4 位置时, 就会发生呋喃裂解。p1、p4 和 p1 位置的突变被认为会干扰呋喃的裂解能力, 从而改变蛋白质的蛋白酶要求。(表 1)。观察到原型 sems2 肽 fecv i and-4 sums2 (vmax 1000.36±7.61 rfu第二分钟) 的氟血清乳. 但不在突变的 sucs2 肽 fipv i 黑 sums2 (vmax-1.37±1.29 rfumin) (图 2a)。同样, furin 能够将原型 s2 ' 肽 fecv ii 1683 s2 ' (vmax 5.46±0.97 rfu/min) 裂开, 但不是突变的 s2 ' 肽 fecv i and-4 s2 ' (vmax 0.97 ±0.11 rfu min)、fipv i 黑 s2 ' (vmax 0.30±0.14 rfumin) 和 fipv ii 1146 s2 ' (vmax-0.36±0.11 rfu(图 2 b)。我们使用胰蛋白酶作为肽裂解的阳性对照, 我们观察到胰蛋白酶裂解在所有使用的肽 (补充图 2)。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
表1。使用的多肽和相应的氨基酸序列.检测中使用的多肽含有 (7-甲氧基香豆素-4-基) 乙酰基/2, 4-dinitrob (mca/dnp) fret 对。p4 和 p1 裂解位定位精氨酸 (r) 残留物, 这是由呋喃识别, 是在粗体。红色的残留物与参考序列相比的突变相对应。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> 图 1.人和骆驼衍生的 mers-cov s2 位点荧光肽的皮林介导的蛋白溶解裂解。a.人中东呼吸综合征冠状病毒 emc2 ' 现场和骆驼衍生菌株 hku205 (双突变体) 的 furin 裂解试验, 以及 emc 2012 (muta-s 和 muts-i) 的单一突变变种。b.人中东呼吸综合征冠状病毒 emc 2012 s2 ' 场址和骆驼衍生菌株 mor213 的 furin 裂解试验。对于a和b 面板,用重组呋喃孵育肽, 用荧光计测量了蛋白溶解处理引起的荧光增加。该测试是以三文数列进行的, 结果代表了三个独立实验 (n通风 3) 的 vmax 平均值。错误栏指示 sd. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">点击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> 图 2.fcov s场馆和 s2 位点荧光肽的皮蛋白介导的蛋白溶解裂解. a. f发 in 裂解试验 fecv i--4 和 fipv i 黑色 sns2 位点。用重组呋喃孵育多肽。b. f发 in 裂解试验, 测定 finv i and-4、fipv i black、fecv ii 1683 和 fipv ii 1146 s2 ' 位点。用荧光计测量了蛋白溶解处理引起的荧光增加。该测试是以三文数列进行的, 结果代表了三个独立实验 (n通风 3) 的 vmax 平均值。错误栏指示 sd. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看此图的较大版本.</a>
补充表 1:用于图 1和图 2的 vmax 值.vmax 值是根据图计算的, 如补充图 1所示, 如《协议》第4节所述。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格.</a>
补充图 1: 从读卡器软件派生的原始数据的说明.随着时间的推移增加荧光图, 用于确定 vmax。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">请点击此处下载此图.</a>
补充图 2: 胰蛋白酶介导的 fcov snys2 和 s2 位点荧光肽的蛋白溶解裂解.对 finv i and-4 和 fipv i 黑 sgens2 位点和 fecv i and-4、fipv i 黑色、fecv ii 1683 和 fipv ii 1146 s2 位点进行胰蛋白酶裂解试验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">请点击此处下载此图.</a>

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

我们提出了一个氟原肽裂解检测, 允许快速筛选蛋白酶的蛋白溶解活性肽代表病毒融合肽的裂解部位。这种方法也可以用于蛋白质序列中的任何其他氨基酸母题, 以测试蛋白酶活性。

一种用于蛋白质溶解活性的荧光肽裂解检测: 冠状病毒穗蛋白活化的应用

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

这种方法可以帮助回答生物化学领域的关键问题，如蛋白质的蛋白质解法修饰，以及抑制剂和蛋白酶和肽的表征。这项技术的主要优点是，它允许快速筛选肽上的蛋白酶蛋白酶活性，代表给定蛋白质的裂解侧。这里的用途是研究激活病毒融合的蛋白酶。肽设计的第一步是从公共数据库（如NCBI或病毒病原体数据库）获取感兴趣的融合蛋白序列。选择蛋白酶识别站点进行聚变肽，包括该序列的上游和下游两到三个氨基酸。订购肽时，使用荧光共振能量转移或 FRET 对、末终点的 Mca 和 c 终点的 Dnp 修改它。在测定过程中，Mca 非常兴奋，并发出光能，只要两者彼此靠近，就会被 Dnp 淬火。但是，如果发生裂解，Dnp 将无法淬火，荧光板读取器可以读取这些排放。根据厂家的建议，通过轻轻上下移液，重新暂停肽。例如，在70%乙醇中重新被重新暂停，最终浓度为1毫摩尔。如果肽不通过移液很好地重新暂停，将含有肽和溶剂的管放在声波浴中，直到完全重新暂停。将肽的100微升等分分分配到光阻尼或耐药管中，以保护肽免受漂白。将等分储存在零下 20 摄氏度。首先打开板读卡器并等待自检完成。接下来，打开所连接计算机上的操作软件，并确保它与板读卡器连接。打开温度设置，将其设置为所需的温度，以获得最佳性能的蛋白酶，这是 30 摄氏度，在这种情况下。要设置实验，请单击控制仪器设置，选择动力学，然后选择荧光。输入 330 纳米的激发波长和 390 纳米的发射波长。取消选择自动截止并选择中等/正常灵敏度。为检测选择一小时的运行时间，每 60 秒选择一次测量。在第一次测量前设置五秒钟的混合时间，在每次测量前设置 3 秒的混合时间。最后，选择要读取的井。如文本协议所述，为蛋白酶准备适当的测定缓冲液，并在冰上冷却缓冲液。将一个纯黑色聚苯乙烯未处理的平底96孔板放在冰上，下面有一个薄金属板，以支持冷却和稳定性。必须使用黑板作为检测板，以防止邻近油井的荧光泄漏。每肽，每个检测准备三个技术复制，每个样本的总体积为100微升。将适当数量的测定缓冲液放入检测板的每个井中。在每个井中加入0.5微升蛋白酶。到六孔，添加0.5微升缓冲液，而不是各自的蛋白酶。其中三个将是盲目的对控制，另外三个将是肽对等控制。除了盲控外，将五微升肽加入到每井50微摩尔的最终浓度中。在三个盲控井中，每口都加入五微升缓冲液，而不是肽。将板插入荧光板读卡器，然后单击"启动"。在开始数据分析之前，请保存实验文件。单击导出，然后将文件导出为 txt。将 txt 文件导入电子表格。首先创建一个图形，根据每个样本每个技术复制的 x 轴上的时间绘制 y 轴上的相对荧光单位。选择图形在线性范围内的数据范围，以及最接近荧光开始增加的数据范围。在第二个图形上绘制所选数据并添加线性趋势线。在趋势线选项中，选择图表上的显示方程。方程将显示 V 最大值，对应于趋势线的斜率。从三个技术复制中计算每个样本的平均 V 最大值。再重复两次实验后，为了获得三个生物复制，根据三个独立的生物复制的数据计算标准偏差。人类MERS冠状病毒、EMC/2012 S2原位，以及骆驼衍生的双突变菌株HKU205，以及EMC/2012的单突变变种，显示EMC/2012肽被有效切割，而HU205的S2原肽几乎没有分裂发生。EMC/2012 A-S 变异 S2 原肽的裂解被强烈减少，并且几乎没有 EMC/2012 S 到 I 变异 S2 原肽的裂解。另一项毛茸茸裂解测定显示，与人类 MERS 冠状病毒 EMC/2012 S2 主要位点相比，骆驼衍生的摩洛哥 213 S2 主要基点仅出现最小的裂解。在原型S1/S2肽、FECV I和4 S1/S2中观察到富林裂解，但在变异的S1/S2肽FIPV I黑色S1/S2中未观察到。同样，毛皮能够切割原型S2原肽，FECV II 1683 S2素，但不是变异的S2原肽，FECV I和4S2素，FIPV I黑色S2素，和FIPV II 1146 S2素。按照这个程序，西方的印迹分析或氨基荧光测定，使用感兴趣的全长蛋白质进行验证蛋白裂解，或者在这种情况下，如果裂解导致病毒融合蛋白的致生版本。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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生物化学

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