Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation at JoVE.com

Financement de la recherche du projet MERS présenté dans ce manuscrit a été assuré par les NIH grant R21 AI111085. L’étude de coronavirus félin était soutenue par des subventions de recherche de Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation et le centre de santé de Cornell félin. Nous tenons également à remercier Malik Peiris pour nous fournir des Mor213 séquence avant c’était accessible au public.

1. concevoir et préparer les Peptides
<ol><li>Acquérir la séquence de la protéine de fusion d’intérêt d’une base de données publique tels que NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou la base de l’agent pathogène des virus (https://www.viprbrc.org). Choisissez le site de reconnaissance de protéase qui précède le peptide de fusion et incluent 2-3 en amont et en aval de cette séquence d’acides aminés.</li>
	<li>Lorsque vous commandez les peptides, les modifier avec l’acétyl frette de 7-méthoxycoumarine-4-yl paire (MCA) à l’extrémité N-terminale et N-2, 4-dinitrophényl (DNP) à l’extrémité C-terminale. Remarque : Plusieurs fournisseurs fournissent ces modifications. Prix et livraison temps dépendent le fournisseur de choix. Toutefois, modifications alternatives existent qui varient en sensibilité et exiger des ajustements du lecteur de plaque en termes de longueurs d’onde.</li>
	<li>Resuspendre le peptide selon les recommandations du fabricant de pipetage doucement verticalement. Par exemple, remettre en suspension les peptides dans l’éthanol à 70 % à la concentration finale de 1 mM.</li>
	<li>Ajouter éventuellement le tube contenant le peptide et le solvant dans un bain de sonication jusqu'à ce qu’il est complètement remis en suspension si le peptide ne pas très bien resuspendre en pipettant également.</li>
	<li>Aliquoter le peptide en mouillage léger ou résistant aux tubes pour protéger le peptide de blanchiment. Gardez aliquote de tailles petites pour éviter les cycles de gel/dégel multiples (p. ex., 100 µL). Stocker les aliquotes à-20 ° C.</li>
</ol>2. préparer le lecteur de Fluorescence
<ol><li>Allumez le lecteur et attendez que le test automatique est terminé.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’exploitation sur l’ordinateur relié et assurez-vous qu’il est connecté avec le lecteur.</li>
	<li>Ouvrez le réglage de la température et attribuez à 30 ° C (ou la température requise pour une performance optimale pour la protéase).</li>
	<li>Cliquez sur le contrôle | Instrument d’installation de mettre en place l’expérience.</li>
	<li>Choisissez cinétique.</li>
	<li>Sélectionnez la Fluorescence.</li>
	<li>Entrez les longueurs d’onde d’Excitation et d’émission : 330 nm et 390 nm respectivement.</li>
	<li>Désélectionner la coupure automatique.</li>
	<li>Sélectionnez une sensibilité moyenne, normale.</li>
	<li>Choisir une durée de 1 h pour le test, puis sélectionnez une mesure toutes les 60 s.</li>
	<li>Set de 5 s mélange avant la première mesure et 3 s avant chaque mesure</li>
	<li>Sélectionnez lire et commencer à l’essai des puits.</li>
</ol>3. préparation de l’essai
<ol><li>Préparer le tampon en calculant les quantités appropriées pour chaque ingrédient et en l’ajoutant. Pour furine, faire tampon composé de 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoéthanol, 5 % X-100 Triton. Pour la trypsine, utiliser le standard tamponnée au phosphate (PBS) physiologique. Remarque : Les Volumes de 10 mL ou moins sont suffisants. Selon la dexaméthasone utilisé dans l’essai de la mémoire tampon varie.</li>
	<li>Faites refroidir le tampon sur la glace.</li>
	<li>Placer la plaque de test sur la glace avec une plaque de métal mince sous refroidissement de soutien et de la stabilité. Utiliser un solide noir en polystyrène plaque 96 puits à fond plat et non traitées. Remarque : Il est essentiel d’utiliser des plaques noires pour prévenir fluorescent « fuite » des puits adjacents.</li>
	<li>Calculer la quantité appropriée de protéase à ajouter pour chaque réaction issue des publications antérieures ou des données expérimentales. Pour furine, utilisez 1 unité par réaction, ce qui correspond à 0,5 µL. Pour la trypsine, utiliser 0,5 µL de trypsine TPCK 160 nM.</li>
	<li>Par exemple, préparer 3 répétitions techniques par dosage dans un volume total de 100 µL par échantillon. NOTE : Il a été évalué expérimentalement qu’il ne fait pas une différence si le pipetage est effectué dans des conditions de lumière normales ou grisé de lumière. Toutefois, les peptides ne doivent pas être exposés à la lumière pendant une période prolongée de temps.</li>
	<li>Pipetter la quantité appropriée de tampon (94,5 µL tel que décrit à l’étape 3.1) dans chaque puits.</li>
	<li>Ajouter la protéase dans chaque puits. Pour les deux, la furine et trypsine TPCK, utiliser 0,5 µL par exemple. 6 puits (3 puits pour un contrôle à blanc) et 3 puits pour un contrôle de peptide, ajouter 0,5 µL de tampon au lieu de la protéase respectif.</li>
	<li>Ajouter le peptide à une concentration finale de 50 µM à chaque puits sauf le contrôle à blanc. Dans ce cas, pipetter 5 peptide µL préparé comme indiqué dans l’étape 1.3. Ajouter 5 µL de tampon dans le contrôle vide au lieu de peptide. Remarque : Plusieurs concentrations du peptide ont été initialement testées avec les concentrations de l’enzyme décrite pour s’assurer que les enzymes étaient saturés.</li>
	<li>Insérer la plaque dans le lecteur de fluorescence et cliquez sur démarrer.</li>
</ol>4. analyse des données
<ol><li>Enregistrez le fichier de l’expérience.</li>
	<li>Cliquez sur exporter et exporter le fichier en .txt.</li>
	<li>Importez le fichier .txt dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Pour chaque répétition technique par exemple, créer un graphe traçant les unités relatives fluorescentes (RFU) sur l’axe des ordonnées contre le temps sur l’axe x (la Figure 1).</li>
	<li>Sélectionnez la plage de données lorsque la courbe est dans un domaine de linéarité et la plus proche au début de l’augmentation de la fluorescence.</li>
	<li>Tracer les données sélectionnées sur un deuxième graphique et ajouter une courbe de tendance linéaire.</li>
	<li>Sélectionner dans les options de trendline équation d’affichage graphique. L’équation montrera la Vmax.</li>
	<li>Calculer que la moyenne Vmax pour chaque échantillon de 3 techniques réplique.</li>
	<li>Répétez l’expérience deux fois plus pour obtenir 3 réplicats biologiques.</li>
	<li>Calculer l’écart-type basé sur les données biologiques indépendants 3 réplique.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un essai de peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide des séquences de protéines pour leur clivage protéolytique par des protéases. Dans notre premier exemple, nous avons choisi un clivage différent motifs du site de la protéine de spike (S) des MERS-CoV pour illustrer une application avec ce test. Plusieurs enveloppé virus qui possèdent la classe j’ai fusion des protéines telles que les MERS-CoV, le SRAS (Syndrome respiratoire aigu sévère) et la grippe sont des préoccupations majeures pour la santé publique et de nouveaux sous-types sont en constante évolution qui ont un potentiel de traverser des espèces barrières de leurs hôtes naturels à l’homme1,15,16. Isoler les virus et les cultiver en laboratoire ne peuvent pas toujours être réalisables ou nécessite des laboratoires spéciaux qui ne sont pas disponibles dans chaque centre de recherche. Par conséquent, il est nécessaire pour les méthodes d’évaluation de la menace potentielle de la santé publique des virus émergents qui peuvent être effectués en laboratoire régulières. Outre les virus ciblant les humains, certains virus animaux comme FCoV possèdent également les mêmes protéines de fusion, par conséquent, partage les mêmes caractéristiques que leurs homologues humains de classe I. Isoler ces virus peut également être un défi, rendre l’utilisation d’outils innovants pour étudier leur nécessaire.
Une étape cruciale dans le cycle de vie des virus susmentionnés est entrée de cellule hôte et fusion médiée par traitement protéolytique de la protéine de fusion respectifs par le hôte protéases1,2. Un standard pour enquêter sur cette partie du cycle de vie viral consiste à cloner le gène de la protéine de fusion dans un vecteur d’expression chez les mammifères, des cellules de mammifères qui permettant l’expression de la protéine, incuber ou transfecter conjointement avec la protéase d’intérêt, l’isolat de transfecter les protéines et effectuer une analyse par western blot. Cette méthode est livré avec plusieurs limitations : disponibilité d’ADN/ARN viral pour le clonage, les coûts pour la synthèse du gène si aucun ADN ou ARN n’est disponible, la disponibilité d’un anticorps pour détecter la protéine de fusion et de ses produits de clivage et il peut prendre jusqu'à plusieurs semaines jusqu'à ce que l’ensemble de l’étude est effectuée. Il devient encore plus d’argent, de temps et main-d'oeuvre si l’intérêt de l’étude est d’étudier plusieurs mutations dans le site de clivage, car elle nécessite de mutagenèse dirigée. Le dosage du peptide fluorogène que nous décrivons ici n’a pas ces limites. Les peptides d’intérêt peuvent être conçus selon des séquences accessibles au public, il y a plusieurs fournisseurs qui offrent un large éventail de protéases recombinants qui sont pertinentes pour ces types d’études et l’essai, y compris l’analyse peut être effectuée dans un seule journée.
Dans notre exemple, nous avons examiné la furine médiée par clivage de la S2' site de reconnaissance de protéase de la protéine S MERS-CoV provenant des humains et des dromadaires d’Égypte et du Maroc. Fois l’humain EMC/2012 et le chameau HKU205 S2' sites contiennent un motif de clivage de la furine RXXR typique. Toutefois, selon le clivage PiTou 2.0 notation algorithme le S2 HKU205' site n’est pas prévu pour être clivée par furine, que nous avons confirmé expérimentalement19. La raison pourquoi HKU5 S2' n’est pas traité par furine pourrait être due à l’isoleucine dans le P1' position. Lorsque nous avons testé deux peptides qui a effectué les mutations individuelles dans la S2 EMC/2012 ' séquence, nous avons pu confirmer que l’isoleucine dans le P1' abroge largement décolleté alors que l’alanine à la substitution de sérine conduit à une coupure réduite. Le S2 Mor213' site ne contient pas un motif de clivage de furine et il n’est pas surprenant de ne détecter presque aucun clivage. Nous avons également examiné comment furine fend le S1/S2 et S2' sites de reconnaissance de protéase de la protéine FCoV S. Nous avons pu observer la furine clivage des deux peptides FECV (FECV I et 4 S1/S2 et S2 FECV II 1683 »), tandis que mutés séquences du virus de la FIPV n’étaient pas clivés par furine.
Lorsque l'on compare la furine médiée par clivage de l’EMC/2012 S2 "peptide (Figure 1 a) avec les peptides FECV I et 4 S1/2 (Figure 2 a), nous avons constaté qu’il existait une 26-fold différence approximative la Vmax. Cela peut s’expliquer par le motif de clivage furine dans les deux séquences (tableau 1). Alors que le minimum requis pour le clivage furin est un motif RXXR, une séquence RXRR est beaucoup plus favorable2. Par conséquent, le S2 EMC/2012 "peptide qui présente un motif RSAR, est clivé avec moins de précision par rapport au peptide FECV I et 4 S1/2 qui contient un site de clivage de la furine RSRR (tableau 1).
Toutefois, une limitation majeure de l’analyse est que les peptides ne reflètent pas la structure tertiaire de la protéine, dans qu'ils sont généralement intégrés. Clivage de la protéine de fusion pleine longueur expose le peptide de fusion et déclencheurs d’accueil cellule entrée1. L’interaction entre la protéine protéase et de la fusion pourrait également être affectée par la structure tertiaire de la protéine de fusion même si nous supposons que les peptides sont plus ou moins linéaires. Par conséquent, clivage détecté dans le dosage du peptide peut être artificiel et peut-être ne pas refléter la situation in vivo . Cela a été rapporté pour le clivage de l’influenza de sous-type H3N2 HA par matriptase. Alors que plusieurs groupes décrivent un clivage du H3N2 HA matriptase lors d’essais de peptide, il a également été montré que l’incubation de H3N2 HA protéine pleine longueur et matriptase en culture cellulaire n’a pas entraîné une fusogène HA protéine4,20, 21. Il y a d’autres exemples qui montrent que le règlement biologiquement important du clivage protéolytique est au niveau de la conformation des protéines. Il a été décrit que des protéines de fusion ont parfois besoin d’une série d’événements pré fusion pour pouvoir exposer les sites de clivage à la fusion. La protéine de fusion virus Semliki Forest, par exemple, exige des réarrangements structuraux pendant un certain nombre d’événements prefusion pour exposer sa protéine de fusion et la rendre disponible pour une activation protéolytique22. Par conséquent, les résultats obtenus lors d’un essai de peptide fluorogène doivent être validés par des essais de fusion des cellules ou des expériences similaires. Toutefois, le dosage du peptide permet toujours un dépistage rapide de plusieurs combinaisons de protéase/peptide et de réduire la main-d'œuvre et le temps des expériences de suivi puisque les combinaisons qui ne présentent pas de clivage sont très susceptibles de présenter le même résultat en vivo.
La deuxième limitation majeure du dosage concerne les protéases. Jusqu'à présent, il n’est possible à tester des protéases solubles mais pas transmembranaires protéases. Selon l’intention de l’expérience, cela peut être un problème. Par exemple, la grippe a est activés par un certain nombre de protéases transmembranaires située à membranes cellulaires8. Dans une certaine mesure, ce problème peut être contourné en utilisant les domaines actifs protéolytiques solubles, mais les résultats doivent être interprétés avec prudence et doivent être validés par les méthodes conventionnelles. Nous voulons reportez-vous à l’exemple de decoule avec matriptase et son activité vers H3N2 HA. In vivo matriptase est situé dans la membrane cellulaire, mais l’enzyme disponible dans le commerce est le domaine catalytique soluble. Tel que discuté en ce qui concerne les protéines de fusion, il peut être possible qu’il exige aussi la protéase pleine longueur pour interagir avec le substrat de la protéine pleine longueur pour obtenir un clivage et que test uniquement aux domaines unique peut entraîner de faux positifs.
Cette méthodologie s’est avéré efficace pour étudier le clivage des séquences d’acides aminés spécifiques par furine. Toutefois, les applications de l’étendue de la technique à une protéase disponible (p. ex., cathepsines, proprotéine convertase), ce qui en fait une méthode utile pour sélectionner les candidats de peptide pour le clivage de la protéase. En outre, il a été démontré que ce test peut également être utilisé pour tester l’efficacité des inhibiteurs de la protéase et par conséquent fournit un rapide et facile à outil pour écran protéine inhibiteurs23.
Le dosage de clivage de peptide fluorogène décrit ici représente un ajout au clivage de bioinformatic marquant des algorithmes, qui prédit le clivage du peptide par une protéase déterminée, basée sur les propriétés des acides aminés et la séquence. Ces deux techniques, en combinaison avec la tradition western blotting techniques utilisable comme une méthode efficace pour étudier la protéase clivage in vitro.

Fusion virale avec la membrane cellulaire de l’hôte est une étape cruciale dans le cycle de vie des virus enveloppés et facilite l’entrée dans la cellule et la réplication du virus. En règle générale, les virus possèdent une protéine spécialisée (ou protéines) qui se lie aux récepteurs sur la membrane cellulaire de l’hôte et déclenche le virus-cellule membrane fusion1. Protéines de fusion virale ont été regroupées en trois grandes classes (I-III)1. Un certain nombre de virus qui sont actuellement une préoccupation majeure pour la santé publique, tels que les virus de la grippe (représentant une émergence zoonotique depuis longue des oiseaux) et Moyen-Orient respiratoire Syndrome-coronavirus (MERS-CoV) (ce qui représente une récente zoonotiques émergence de chameaux), utilisent ce qu’on appelle des protéines de fusion, qui nécessitent un traitement protéolytique par des protéases de l’hôte, d’exercer leur activité fusogène2de classe I. De même, les coronavirus félin (FCoV), qui représente une menace grave pour les chats sauvages et domestiques, possèdent également une classe j’ai protéine de fusion. Classe I fusion virale protéines sont synthétisées en général comme un précurseur clivé et sont généralement consistant de deux domaines qui sont responsables de récepteurs contraignant et le déclenchement de l’événement de fusion respectivement. A ce jour, l’hémagglutinine de grippe (HA) est le meilleur compris protéine de fusion et de nombreuses études ont décrit son rôle mécaniste dans d’entrée et la fusion cellulaire hôte3. Dans ce cas, le clivage de la protéine de fusion se produit à une séquence spécifique ou un site de clivage au sein de l’AP et en combinaison avec des changements conformationnels dépendante du pH, des résultats de l’exposition du peptide fusion virale1,2.
Le peptide de fusion et sa séquence de reconnaissance précédente protéase sont critiques pour la pathogénicité et l’adaptation de l’hôte du virus. Changements dans la séquence de reconnaissance protéase peuvent altérer clivage significative avec des conséquences potentiellement dramatiques pour le virus et l' hôte4. D’une part, il peut abroger un clivage et éliminer ainsi le cycle de vie du virus. Mais en revanche, une mutation peut augmenter la spécificité de substrat pour une protéase donnée et/ou permettre une protéase « nouveau » en conjonction avec la protéine de fusion. Par la suite, cela peut également développer le tropisme cellulaire et tissulaire, comme observé, par exemple, avec l’influenza virus sous-types5,6. Généralement faible des virus de la grippe aviaire (LPAI) de pathogénicité et virus de l’influenza humaines plus sont confinés au tractus digestif ou respiratoire en raison de la localisation limitée des protéases qui activent leur. En règle générale, le peptide de fusion de ces protéines HA est précédée d’une séquence 4-amino d’acide qui se compose d’acides aminés basiques non consécutifs de 1-2, qui est reconnue par la trypsine sérines protéases comme la trypsine, matriptase ou TMPRSS27, 8. quand le virus acquiert des insertions ou des mutations qui modifient le site de clivage vers un site polybasiques, il permet la furine pour activer l’AP et potentiellement provoquer une beaucoup plus sévère infection systémique6,9. Ces virus sont appelés virus de l’influenza aviaire hautement pathogène (IAHP), caractérisé par des souches H5N1.
Contrairement à la grippe HA, nombreux coronavirus, comme les MERS-CoV, ont deux sites de clivage distinct au sein de leur protéine de spike. Le site de S1/S2 sépare le domaine N-terminal de liaison du récepteur (S1) le domaine C-terminal de la fusion (S2), avec un second site de clivage, appelé S2', en aval du site S1/S2, à proximité de la peptide de fusion10. Il a été suggéré que les sites sont clivés séquentiellement, à S1/S2 suivie S2'. Contrairement à l’AP de plupart souches de virus de la grippe, la protéine S MERS-CoV S1/S2 et S2' sites peuvent être reconnus par des protéases de la famille de la proprotéine convertase (PC), comme la furine. Membres de cette famille s’attacher à des résidus basiques appariés avec le motif R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. En règle générale, les acides aminés en amont du site de clivage sont appelés P1, P2, P3, etc.. comptant à partir du site de clivage et les acides aminés en aval sont désignés comme P1', P2', P3', etc.. 11. FCoV souches peuvent avoir un seul ou un site de clivage double. Comme les MERS-CoV, certaines souches FCoV possèdent également deux sites de clivage (S1/S2 et S2') dans leur protéine S. Cependant, cette caractéristique est l’exclusion sérotype j’ai FCoVs (clade A). En revanche, les membres du groupement sérotype II (clade B) ont seulement un site unique clivage (S2')2,12. Plusieurs protéases ont été suggérées en conjonction avec les sites de clivage FCoV, y compris furine, protéases de trypsine et cathepsine. Il a été proposé que la protéine S de FCoV entérique (également connu sous le nom de feline coronavirus entérique ou FECV) est susceptible d’être clivée par furine dans le site S1/S2 et mutations dans ce site (ainsi qu’à S2') entraîne des changements dans les exigences de la protéase. Ces mutations ont été associées à des changements dans le tropisme et la pathogénicité de ces virus, permettant au virus de devenir systémique et le macrophage-tropic (virus de la péritonite infectieuse féline également connu sous le nom ou FIPV)13.
Virus introduisent naturellement des mutations dans leurs génomes au cours de chaque cycle de réplication et fréquemment de nouveaux sous-types et les souches de la grippe, MERS-CoV et FCoV sont décrit14,15,16. Dans le cadre d’une évaluation rapide afin d’évaluer la menace de santé publique des virus émergents, il est essentiel de cerner l’évolution du site de clivage et comment il affecte l’éventail des protéases activant ces virus. Nous décrivons ici un essai à base de peptides qui permet une évaluation rapide des conséquences des changements de site de clivage en protéine S MERS-CoV sur la spécificité de substrat d’une protéase donnée et pour dépister rapidement les différentes protéases pour leur capacité à s’attacher une donnée ou plusieurs séquences4. Dans une deuxième série d’expériences, nous avons utilisé la technique pour déterminer l’activité de clivage furine sur souches et sérotypes différents de FCoV.
Les peptides utilisés dans cet essai sont complétés par la fluorescence resonance energy transfert (FRET) paire, 7-méthoxycoumarine-4-yl acétyle (MCA) à l’extrémité N-terminale et N-2, 4-dinitrophényl (DNP) à l’extrémité C-terminale. Pendant le test, le MCA est excité et émet de l’énergie lumineuse qui est piégée par DNP, aussi longtemps que la paire est à proximité immédiate les uns aux autres. En cas de clivage, cependant, DNP ne parvient pas à étancher l’émission plus et il peut être lu par le lecteur de plaque de fluorescence. Les changements dans la fluorescence est mesurée au cours de l’expérience pour déterminer le taux de clivage du peptide et pour calculer la vitesse à laquelle la protéase fend le peptide spécifique (également connu sous le nom de Vmax)17.
Après la guerre, afin de concevoir les peptides, le gène de la protéine de fusion respectifs doit ont été séquencé ou mis à disposition dans une base de données. Toutefois, la méthode est moins coûteuse que les méthodes conventionnelles qui exigent habituellement le clonage du gène de protéine de fusion dans des vecteurs d’expression de l’exprimer dans des cellules de mammifères pour analyser le clivage et labor-intense. Du début à la fin, cela peut prendre plusieurs jours jusqu'à quelques semaines alors que les dosages de peptide présentés ici peuvent être faits dans la journée, dès que les peptides et les protéases sont disponibles. La configuration du test prend entre 5 et 30 min en fonction du nombre d’échantillons et le runtime dans le lecteur de fluorescence est 1 h. analyse des données peut prendre jusqu'à 2 h, là encore selon la taille de l’échantillon.
Ici, nous avons choisi deux exemples différents de présenter le test. Dans le premier exemple, nous présentons des données qui compare le clivage furin-mediated des MERS-CoV humain et dérivés de chameau, pour évaluer le potentiel des souches dérivées de chameau d’être activé chez l’être humain s’ils franchissent la barrière des espèces. Dans le deuxième exemple, nous avons utilisé un dosage du peptide fluorogène pour déterminer le clivage furin-mediated des S1/S2 et S2' sites ou S2' site de deux sérotypes j’et souches de sérotype deux de FCoV II, respectivement. Pour ces expériences, nous avons utilisé le clivage de la trypsine comme témoin positif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

Virus enveloppés tels que coronavirus ou influenza virus nécessitent un clivage protéolytique de leur protéine de fusion pour pouvoir infecter la cellule hôte. Souvent les virus pièce tropisme cellulaire et tissulaire et sont adaptés à des protéases cellulaires ou tissulaires spécifiques. En outre, ces virus peuvent introduire des mutations ou des insertions dans leur génome lors de la réplication pouvant influer sur le clivage, et peut ainsi contribuer à l’adaptation à un nouvel hôte. Nous présentons ici un essai de clivage du peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide des peptides mimant le site de clivage des protéines de fusion virale. La technique est très flexible et peut être utilisée pour étudier l’activité protéolytique d’une protéase unique sur nombreux substrats différents, et en outre, il permet également une exploration de l’activité des protéases multiples sur un ou plusieurs substrats de peptide. Dans cette étude, nous avons utilisé des peptides mimant les motifs de site de clivage de la protéine de spike de coronavirus. Nous avons testé humaine et chameau dérivés Moyen-Orient Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) pour démontrer que les substitutions simples et doubles dans le site de clivage peuvent modifier l’activité de furine et changer radicalement l’efficacité clivage. Nous avons également utilisé cette méthode en combinaison avec la bio-informatique pour tester la furine activité de clivage des protéines spike coronavirus félin de souches et sérotypes différents. Cette méthode à base de peptides est moins labor - et temps intensif que les méthodes conventionnelles utilisées pour l’analyse de l’activité protéolytique des virus, et les résultats peuvent être obtenus dans une seule journée.

Dans la première partie de cette étude, nous avons utilisé des peptides qui représentent le S2' site de clivage de trois protéines distinctes de MERS-CoV S : de la souche humaine prototypique de EMC/2012 (Genbank AFS88936.1) et de deux sélectionné chameau-dérivés MERS-COV, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) et Mor215 (Genbank AVN89324.1) souches, isolées en Égypte et au Maroc, respectivement (tableau 1)16,18.
Par rapport à la souche EMC/2012, le S2 HKU205' site de clivage a deux mutations dans la P2 et P1' positions qui pourraient potentiellement un impact sa reconnaissance par furine et altérer l’efficacité de clivage (tableau 1). En outre, nous nous sommes intéressés à déterminer si et comment chaque mutation individuelle dans la souche HKU205 affecte furine clivage. Nous avons, par conséquent, inclus deux peptides où les substitutions individuelles ont été introduites dans la séquence peptidique de EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' et EMC/2012 mutS-j’ai S2') (tableau 1). Furine a été capable de cliver le peptide EMC/2012 efficacement avec une Vmax de 6,3 ± 1.2 RFU/min, alors que nous avons ne détecté presque aucun clivage lorsque vous utilisez le S2 « peptide de la souche HKU205 (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Figure 1 a). Lors de la vérification de la CEM/2012 mutA-S S2 "peptide, nous avons trouvé que le clivage a été fortement réduit par rapport à la séquence de type sauvage (Vmax 3,6 ± 1 RFU/min). Il n’y avait presque pas de clivage lorsque vous testez le mutS EMC/2012-J’ai S2 "peptide (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (Figure 1 a).
Récemment, MERS-CoV isolats provenant de l’Afrique occidentale ont été signalés que sur le plan phylogénétique distinct de MERS-CoV se trouvent dans la péninsule arabique16. Un des isolats a récemment décrits est la souche de Mor213, qui transporte une leucine au lieu d’une arginine en position du S2 P4' site (tableau 1), et qui pourrait potentiellement un impact sa reconnaissance par furine et altérer l’efficacité de clivage. Notre essai de peptide a montré qu’il y a seulement minime clivage du S2 Mor213' site contre le site EMC/2012 (Figure 1 b). La Vmax pour le peptide Mor213 est de 1,0 ± 0,1.
Pour la deuxième partie de cette étude, nous avons utilisé la même épreuve de peptide pour évaluer la furine médiée par clivage des sites de clivage des protéines FCoV S. Nous avons utilisé des peptides mimant le site de clivage S1/S2 de deux FCoV sérotype j’ai virus : FECV I et-4 (à partir de laboratoire Whittaker) et FIPV j’ai noir (Genbank AB088223.1). Nous avons aussi utilisé des peptides mimant la S2' site de ces virus, ainsi que deux FCoV sérotype II : FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) et les souches FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (tableau 1). Furin clivage se produit généralement, lorsque les résidus basiques (arginine et lysine) sont présents dans les positions P1 et P4 du site de clivage. Les mutations en P1, P4 et P1' postes sont suggérés pour gêner la furine cleavability, donc de modifier les exigences de la protéase de la protéine. (Tableau 1). Clivage furine a été observé pour le peptide de S1/S2 prototypique FECV I et 4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min), mais pas dans le peptide de S1/S2 muté FIPV j’ai Noir S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1,29 RFU/min) (Figure 2 a). De même, la furine était capable de cliver le S2 prototypique ' peptide FECV II 1683 S2' (Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), mais pas le S2 muté "peptides FECV I et-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV j’ai S2 noir ' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) et S2 FIPV II 1146' (Vmax -0,36 ± 0,11 RFU / min) (Figure 2 b). Nous avons utilisé la trypsine comme témoin positif pour le clivage du peptide et nous avons observé le clivage de la trypsine dans tous les peptides utilisés (la Figure 2).
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
Tableau 1. Séquences d’acides aminés utilisés et correspondant peptides. Les peptides utilisés dans les essais contiennent la paire de frette (MCA/DNP) acétyl/2, 4-dinitrophényl (7-méthoxycoumarine-4-yl). La P4 et P1 clivage site positionné arginine (R) les résidus, qui sont reconnue par la furine, sont en caractères gras. Résidus en rouge correspondent à des mutations par rapport aux séquences de référence.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> Figure 1 . Furin-mediated le clivage protéolytique des humains et dérivés de chameau MERS-CoV S2' sites fluorogène peptides. A. dosage clivage furine humaine MERS-CoV EMC/2012 S2 ' site et souche dérivée chameau HKU205 (double mutant), ainsi que de simples variantes mutantes d’EMC/2012 (mutA-S et mutS-je). B. test de clivage furine humaine MERS-CoV EMC/2012 S2 ' site et souche dérivée chameau Mor213. Pour les panneaux A et B, peptides ont été incubées avec recombinante furine et l’augmentation de fluorescence en raison du traitement protéolytique a été mesurée à l’aide d’un fluorimètre. Les analyses ont été effectuées en géométrie avec des résultats qui représentent des moyennes de Vmax de trois expériences indépendantes (n = 3). Barres d’erreur indiquent SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> Figure 2 . Furin-mediated de clivage protéolytique de FCoV S1/S2 et S2' sites peptides fluorogène. A. clivage furine dosage du FECV I et-4 et FIPV j’ai sites Black S1/S2. Peptides ont été incubées avec furine recombinante. B. test de clivage furine du FECV I et-4 FIPV I noir, FECV II 1683 et FIPV II 1146 S2' sites. L’augmentation de fluorescence en raison du traitement protéolytique a été mesurée à l’aide d’un fluorimètre. Les analyses ont été effectuées en géométrie avec des résultats qui représentent des moyennes de Vmax de trois expériences indépendantes (n = 3). Barres d’erreur indiquent SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
La Table 1 : Vmax valeurs utilisées pour la Figure 1 et Figure 2. La Vmax valeurs ont été calculées à partir graphique tel qu’illustré dans la Figure 1 et tel que décrit dans le protocole 4 de l’article. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.</a>
Supplémentaire Figure 1: Illustration des données brutes provenant du logiciel de lecteur de plaque. Augmentation de la fluorescence sur des courbes de temps qui ont été utilisés pour la détermination de la Vmax. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaire Figure 2: clivage protéolytique trypsine-mediated de FCoV S1/S2 et S2' sites peptides fluorogène. Clivage de la trypsine dosage du FECV I et-4 et FIPV sites Black S1/S2 et du FECV I et-4 FIPV I noir, FECV II 1683 et FIPV II 1146 S2' sites. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Nous présentons un dosage de clivage du peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide de l’activité protéolytique des protéases sur les peptides représentant le site de clivage des peptides viraux de fusion. Cette méthode peut également être utilisée sur tout autre motif d’acides aminés dans une séquence de la protéine pour tester l’activité de la protéase.

Un dosage de clivage du Peptide Fluorogène pour dépister l’activité protéolytique : demandes de coronavirus doper l’activation de la protéine

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biochimie, telles que la modification protéolytique des protéines, ainsi que la caractérisation des inhibiteurs et des protéases et peptidases. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un dépistage rapide de l’activité protéolytique des protéases sur les peptides, représentant le côté clivage de la protéine donnée. L’utilisation ici est d’étudier les protéases qui activent la fusion virale.La première étape de la conception du peptide consiste à acquérir la séquence de la protéine de fusion d’intérêt à partir d’une base de données publique comme ncbi ou la base de données sur les pathogènes du virus. Choisissez le site de reconnaissance de la protéase procédant au peptide de fusion et incluez deux à trois acides aminés en amont et en aval de cette séquence. Lors de la commande du peptide, modifiez-le avec le transfert d’énergie par résonance fluorescence ou la paire FRET, Mca au terminus d’extrémité et Dnp au terminus c.Pendant l’analyse, Mca est excité et émet de l’énergie lumineuse qui est trempée par Dnp tant que la paire est à proximité les uns des autres. Toutefois, si le clivage se produit, Dnp ne sera pas en mesure d’étancher l’émission qui peut ensuite être lu par le lecteur de plaque de fluorescence. Resuspendez le peptide selon les recommandations des fabricants en pipetting doucement de haut en bas.Par exemple, resuspendez dans 70% d’éthanol à une concentration finale d’un millimolaire. Si le peptide ne se résusue pas très bien par pipetage, placez le tube contenant le peptide et le solvant dans un bain de sonication jusqu’à ce qu’il soit entièrement résuspendé. Distribuez 100 aliquots microlitres du peptide dans des tubes légers amortissants ou résistants pour protéger le peptide du blanchiment.Conservez les aliquots à moins 20 degrés Celsius. Commencez cette procédure en allumer le lecteur de plaque et en attendant que l’auto-test soit terminé. Ensuite, ouvrez le logiciel d’exploitation sur l’ordinateur ci-joint et assurez-vous qu’il est connecté avec le lecteur de plaque.Ouvrez le réglage de la température et réglez-le à la température requise pour une performance optimale pour la protéase, qui est de 30 degrés Celsius, dans ce cas. Pour configurer l’expérience, cliquez sur la mise en place de l’instrument de commande, choisissez cinétique, puis sélectionnez fluorescence. Entrez une longueur d’onde d’excitation de 330 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 390 nanomètres.Désélectionner le cut-off automatique et sélectionner la sensibilité moyenne/normale. Choisissez un temps de course d’une heure pour l’analyse et sélectionnez une mesure toutes les 60 secondes. Réglez cinq secondes de mélange avant la première mesure, et trois secondes avant chaque mesure.Enfin, sélectionnez les puits à lire. Préparez les tampons d’analyse appropriés pour les protéases décrites dans le protocole de texte et refroidissez les tampons sur la glace. Placez une plaque de 96 puits en polystyrène noir massif non traitée sur la glace avec une mince plaque métallique en dessous pour soutenir le refroidissement et la stabilité.Il est essentiel d’utiliser une plaque noire comme plaque d’essai, pour éviter les fuites fluorescentes des puits adjacents. Par peptide, préparer trois répliques techniques par essai, et un volume total de 100 microlitres par échantillon. Pipette la quantité appropriée de tampon d’essai dans chaque puits de la plaque d’essai.Ajouter 0,5 microlitres de protéase à chaque puits. À six puits, ajouter 0,5 microlitres de tampon au lieu de la protéase respective. Trois d’entre eux seront des contrôles aveugles et les trois autres seront des contrôles peptidique.Ajouter cinq microlitres du peptide à une concentration finale de 50 micromolaires à chaque puits, à l’exception des commandes aveugles. À chacun des trois puits de contrôle aveugle, ajouter cinq microlitres de tampon au lieu de peptide. Insérez l’assiette dans le lecteur de plaque flourescents et cliquez sur démarrer.Avant de commencer l’analyse des données, enregistrez le fichier d’expérience. Cliquez sur l’exportation, et exportez le fichier comme un txt. Importez le fichier txt dans une feuille de calcul.Commencez l’analyse en créant un graphique, en traçant les unités fluorescentes relatives sur l’axe Y par rapport au temps sur l’axe x pour chaque réplique technique par échantillon. Sélectionnez la plage de données où le graphique se trouve dans une plage linéaire, et la plus proche du début de l’augmentation de fluorescence. Tracez les données sélectionnées sur un deuxième graphique et ajoutez une ligne de tendance linéaire.Dans les options de ligne de tendance, sélectionnez l’équation d’affichage sur le graphique. L’équation montrera V max, qui correspond à la pente de la ligne de tendance. Calculez le V max moyen pour chaque échantillon à partir des trois répliques techniques.Après avoir répété l’expérience deux fois de plus, pour obtenir trois répliques biologiques, calculer l’écart type basé sur les données des trois répliques biologiques indépendantes. Un essai de clivage de furin du coronavirus humain de MERS, du site principal d’EMC/2012 de S2, et de la souche double mutante HKU205 dérivée de chameau, avec des variantes mutantes simples d’EMC/2012 a indiqué que le peptide d’EMC/2012 a été efficacement fendillé, alors que presque aucun clivage du peptide premier S2 de HKU205 s’est produit. Le clivage du peptide principal S2 muté EMC/2012 A-S a été fortement réduit, et il n’y avait presque aucun clivage de l’EMC/2012 S à I muté peptide principal de S2.Un autre test de clivage de furin n’a montré qu’un clivage minimal du site principal du Maroc 213 S2 dérivé du chameau, comparé au coronavirus humain MERS, emc/2012 S2 site principal. Le clivage de furin a été observé pour le peptide prototypique de S1/S2, FECV I et 4 S1/S2, mais pas dans le peptide muté de S1/S2, FIPV I Black S1/S2. De même, furin a été en mesure de fendre le peptide prototypique S2 premier, FECV II 1683 S2 premier, mais pas les peptides mutés S2 premier, FECV I et 4 S2 premier, FIPV I Black S2 premier, et FIPV II 1146 S2 premier.Après cette procédure, l’analyse occidentale de tache ou les analyses d’amino-fluorescence, utilisant la protéine pleine longueur d’intérêt peut être exécutée pour vérifier le clivage de protéine, ou dans ce cas, si le clivage a comme conséquence une version fusogenic de la protéine virale de fusion.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...