Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation at JoVE.com

Finanziamenti per la ricerca per il progetto MERS presentato in questo manoscritto è stato fornito da NIH concedere AI111085 R21. Lo studio di coronavirus felino è stato sostenuto da borse di ricerca da Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation e la Cornell Feline Health Center. Vorremmo anche ringraziare Malik Peiris per averci fornito Mor213 sequenza prima che fosse accessibile al pubblico.

1. progettazione e preparazione dei peptidi
<ol><li>Acquisire la sequenza della proteina di fusione di interesse da parte di una banca dati pubblica come NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o il database dei virus patogeno (https://www.viprbrc.org). Scegliere il sito di riconoscimento di proteasi che precede il peptide di fusione e comprendono 2-3 aminoacidi a Monte e a valle di questa sequenza.</li>
	<li>Quando si ordinano i peptidi, modificarli con l'acetile 7-methoxycoumarin-4-yl di coppia FRET (MCA) all'estremità N-terminale e N-2,4-dinitrophenyl (DNP) al C-terminale. Nota: Alcuni fornitori forniscono queste modifiche. Prezzo e tempi di consegna dipendono dal fornitore di scelta. Tuttavia, le modifiche alternative esistono che variano nella sensibilità e richiede regolazioni del lettore della piastra in termini di lunghezze d'onda.</li>
	<li>Risospendere il peptide secondo le raccomandazioni del costruttore pipettando delicatamente su e giù. Ad esempio, risospendere peptidi in etanolo al 70% alla concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Facoltativamente, aggiungere nella provetta contenente il peptide e il solvente in un bagno di sonicazione, fino a quando esso è completamente risospese se il peptide non risospendere molto bene di pipettaggio.</li>
	<li>Aliquotare il peptide in luce di bagnatura o resistenti tubi per proteggere il peptide di sbiancamento. Mantenere aliquotare dimensioni piccole per evitare più cicli di gelo/disgelo (ad es., 100 µ l). Conservare le aliquote a-20 ° C.</li>
</ol>2. preparare il lettore di piastre di fluorescenza
<ol><li>Accendere il lettore e attendere l'autotest è finito.</li>
	<li>Aprire il software operativo il computer collegato e assicurarsi che è collegato con il lettore di piastre.</li>
	<li>Aprire l'impostazione della temperatura e impostato su 30 ° C (o la temperatura richiesta per prestazioni ottimali per la proteasi).</li>
	<li>Fare clic sul controllo | Configurazione dello strumento per impostare l'esperimento.</li>
	<li>Scegliere cinetica.</li>
	<li>Selezionare a fluorescenza.</li>
	<li>Immettere le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione: 330 nm e 390 nm rispettivamente.</li>
	<li>Deseleziona Auto Cut-off.</li>
	<li>Selezionare Media, normale sensibilità.</li>
	<li>Scegliere una durata di 1 h per il dosaggio e si seleziona una misura ogni 60 s.</li>
	<li>Set di 5 s miscelazione prima della prima misurazione e 3 s prima di ogni misurazione</li>
	<li>Selezionare pozzetti da leggere e avviare il test.</li>
</ol>3. preparazione del dosaggio
<ol><li>Preparare il tampone del calcolo dei quantitativi appropriati per ogni ingrediente e aggiungendolo. Per furin, rendere buffer costituito da 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1mm 2-mercaptoetanolo, 5% Triton X-100. Per tripsina, utilizzare standard tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Nota: I volumi da 10 mL o meno sono sufficienti. Il buffer varia a seconda del protease(s) usato per il test.</li>
	<li>Raffreddare il buffer sul ghiaccio.</li>
	<li>Posizionare la piastra di test sul ghiaccio con una sottile piastra metallica sotto raffreddamento supporto e stabilità. Uso un solido nero polistirolo piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e non trattata. Nota: È indispensabile utilizzare piastre nere per evitare fluorescente "perdite" da pozzetti adiacenti.</li>
	<li>Calcolare la quantità appropriata di proteasi di aggiungere per ogni reazione sulla base di precedenti pubblicazioni o dati sperimentali. Per furin, utilizzare 1 unità per reazione che corrisponde a 0,5 µ l. Per tripsina, utilizzare 0,5 µ l della tripsina TPCK 160 nM.</li>
	<li>Per campione preparare 3 ripetizioni tecnici per analisi in un volume totale di 100 µ l per campione. Nota: È stato valutato sperimentalmente che non fa una differenza se il pipettaggio è effettuato in condizioni di luce normali o grigio luce. Tuttavia, i peptidi non dovrebbero essere esposta alla luce per un periodo prolungato di tempo.</li>
	<li>Dispensare la quantità appropriata di tampone del saggio (94,5 µ l come descritto al punto 3.1) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere la proteasi in ciascun pozzetto. Per entrambi, furin e tripsina TPCK, utilizzare 0,5 µ l per campione. 6 pozzetti (3 pozzi per un controllo in bianco) e 3 pozzi per un controllo del peptide, aggiungere 0,5 µ l di tampone invece la rispettiva proteasi.</li>
	<li>Aggiungere il peptide ad una concentrazione finale di 50 µM a ciascun pozzetto tranne il controllo in bianco. In questo caso, pipettare 5 peptide µ l preparato come descritto al punto 1.3. Aggiungere 5 µ l di tampone per il controllo in bianco invece del peptide. Nota: Diverse concentrazioni del peptide inizialmente sono state testate con le concentrazioni di enzima descritto per garantire che gli enzimi erano saturi.</li>
	<li>Inserire la placca nel lettore della piastra di fluorescenza e fare clic su start.</li>
</ol>4. analisi dei dati
<ol><li>Salvare il file di esperimento.</li>
	<li>Fare clic su Esporta ed esportare il file come file txt.</li>
	<li>Importare il file. txt in un foglio di calcolo.</li>
	<li>Per ogni tecnica replicare per campione, è possibile creare un grafico tracciato la relativa unità fluorescenti (RFU) sull'asse y contro il tempo sull'asse x (Supplemental figura 1).</li>
	<li>Selezionare l'intervallo di dati in cui il grafico è un intervallo lineare e la più vicina all'inizio dell'aumento di fluorescenza.</li>
	<li>Tracciare i dati selezionati su un secondo grafico e aggiungere una linea di tendenza lineare.</li>
	<li>Selezionare nelle opzioni di trendline equazione Display grafico. L'equazione mostrerà il Vmax.</li>
	<li>Calcolare che la media Vmax per ciascun campione da 3 tecnici replica.</li>
	<li>Ripetere l'esperimento altre due volte per ottenere 3 replicati biologici.</li>
	<li>Calcolare la deviazione standard sulla base dei dati da 3 indipendente biologiche replica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Presentiamo qui un saggio di peptide fluorogenico che consente uno screening veloce di sequenze proteiche per la loro scissione proteolitica da proteasi. Nel nostro primo esempio abbiamo scelto il clivaggio diverso motivi sito della proteina spike (S) MERS-CoV per illustrare una sola applicazione per questo test. Molti avvolto virus che possiedono classe fusione proteine quali MERS-CoV, SARS-CoV (sindrome respiratoria acuta grave) e influenza sono maggiori preoccupazioni per la salute pubblica e nuovi sottotipi sono in costante evoluzione che ho un potenziale di attraversare specie barriere da loro ospiti naturali per gli esseri umani1,15,16. Isolare il virus e coltivarle in laboratorio potrebbe non essere sempre fattibile o richiede laboratori speciali che non sono disponibili in ogni struttura di ricerca. Quindi, non c'è necessità di metodi valutare la potenziale minaccia di salute pubblica di virus emergenti che possono essere condotti in condizioni di laboratorio regolari. Oltre ai virus targeting per gli esseri umani, alcuni virus animale come FCoV inoltre possiedono le stesse proteine di fusione, di conseguenza, le caratteristiche simili rispetto alle loro controparti umane di classe I. Isolare questi virus può anche essere una sfida, rendendo necessario l'utilizzo di strumenti innovativi per studiarli.
Un passo cruciale nel ciclo di vita dei suddetti virus è voce cella host e fusione mediato dal processamento proteolitico della proteina di fusione rispettivi host proteasi1,2. È un modo standard per indagare su questa parte del ciclo di vita virale per clonare il gene della proteina di fusione in un vettore di espressione mammifera, transfect cellule di mammifero che permettono l'espressione della proteina, incubare o co-transfect con la proteasi di interesse, isolare il proteina ed eseguire un'analisi di western blot. Questo metodo viene fornito con diverse limitazioni: disponibilità di DNA/RNA virale per la clonazione, i costi per la sintetizzazione del gene se DNA e RNA non è disponibile, disponibilità di un anticorpo per rilevare la proteina di fusione e suoi prodotti di scissione e si può richiedere fino a diversi settimane fino a quando viene eseguito l'intero studio. Diventa anche più che richiede tempo, soldi e lavoro intenso se l'interesse dello studio è quello di indagare diverse mutazioni nel sito di clivaggio, poiché richiede la mutagenesi sito-diretta. Descriviamo qui il dosaggio del peptide fluorogenico non hanno queste limitazioni. I peptidi di interesse possono essere progettati basato su sequenze pubblicamente disponibili, ci sono diversi fornitori che forniscono una vasta gamma delle proteasi ricombinante che sono rilevanti per questi generi di studi e l'analisi tra cui l'analisi può essere eseguita all'interno di un singolo giorno.
Nel nostro esempio, abbiamo esaminato il clivaggio furin-mediata del S2' luogo di riconoscimento della proteasi della proteina S di MERS-CoV derivato dagli esseri umani e cammelli dall'Egitto e Marocco. Sia l'umano EMC/2012 e il cammello HKU205 S2' siti contengono un tipico motivo di clivaggio furin RXXR. Tuttavia, secondo il clivaggio di PiTou 2.0 segnando algoritmo la S2 HKU205' sito non è previsto per essere clivata da furin, che abbiamo confermato sperimentalmente19. La ragione perché HKU5 S2' non viene elaborato da furin potrebbe essere dovuto l'isoleucina nel P1' posizione. Quando abbiamo provato due peptidi che ha trasportato le mutazioni individuali nel EMC/2012 S2' sequenza, siamo stati in grado di confermare che l'isoleucina nel P1' in gran parte abroga scissione mentre l'alanina alla sostituzione della serina ha provocato ridotto clivaggio. La S2 Mor213' sito non contiene un motivo di clivaggio furin e non era sorprendente per non rilevare quasi nessuna scissione. Abbiamo anche esaminato come furin fende il S1/S2 e la S2' siti di riconoscimento della proteasi della proteina FCoV S. Siamo stati in grado di osservare il clivaggio furin di entrambi i peptidi FECV (FECV I e-4 S1/S2 e S2 FECV II 1683'), mentre sequenze mutate da virus FIPV non erano spaccati dalla furina.
Quando si confrontano clivaggio furin-mediata della EMC/2012 S2' peptide (Figura 1A) con i peptidi di FECV I S1/2 e-4 (Figura 2A), abbiamo scoperto che c'era una 26-fold differenza approssimativa in Vmax. Questo può spiegarsi con il motivo della scissione di furin in entrambe le sequenze (tabella 1). Mentre il requisito minimo per la scissione di furin è un motivo RXXR, una sequenza RXRR è molto più favorevole2. Di conseguenza, il EMC/2012 S2' peptide, che ha un motivo RSAR, viene scisso con meno specificità rispetto al peptide FECV I e-4 S1/2 che contiene un sito di clivaggio furin RSRR (tabella 1).
Tuttavia, uno dei principali limiti del dosaggio è che i peptidi non riflettono la struttura terziaria della proteina in che sono solitamente incorporati. Clivaggio della proteina di fusione integrale espone il peptide di fusione e trigger ospitano cella voce1. L'interazione tra la proteina proteasi e fusione potrebbe essere interessato anche dalla struttura terziaria della proteina di fusione mentre si assume che i peptidi sono più o meno lineari. Quindi, clivaggio rilevato nel dosaggio del peptide può essere artificiale e potrebbe non riflettere la situazione in vivo . Questo è stato segnalato per la scissione della riossidazione sottotipo H3N2 HA di matriptase. Mentre diversi gruppi descritti clivaggio di H3N2 HA di matriptase nelle analisi di peptidi, inoltre è stato indicato che l'incubazione di H3N2 HA proteina integrale e matriptase nella coltura delle cellule non ha provocato un fusogena HA proteina4,20, 21. Ci sono altri esempi che dimostrano che il regolamento biologicamente importante del clivaggio proteolitico è sul livello di conformazione della proteina. È stata descritta che proteine di fusione a volte bisogno di una serie di eventi pre-fusione per poter esporre i siti di fenditura sulla fusione. La proteina di fusione del virus della foresta di Semliki, ad esempio, richiede riorganizzazioni strutturali durante un numero di eventi Monitore al fine di esporre la sua proteina di fusione e renderlo disponibile per l'attivazione proteolitica22. Di conseguenza, i risultati ottenuti in un'analisi di peptidi fluorogenici devono essere convalidati da saggi di fusione cellulare o esperimenti simili. Tuttavia, il dosaggio del peptide ancora consente uno screening veloce di varie proteasi/peptide combinazioni e di ridurre il lavoro e il tempo di follow-up esperimenti poiché combinazioni che non mostrano fenditura sono molto probabili esibire lo stesso risultato in vivo.
La seconda limitazione principale del test riguarda le proteasi. Finora è solo possibile testare proteasi solubili ma non transmembrane proteasi. A seconda delle intenzioni dell'esperimento, questo può essere un problema. Ad esempio, l'influenza ha è attivati da un numero di proteasi del transmembrane situato a membrane cellulari8. In una certa misura, questo problema può essere aggirato utilizzando i domini attivi proteolitici solubili, ma i risultati devono essere interpretati con cautela e devono essere convalidati con metodi convenzionali. Vogliamo fare riferimento all'esempio sopra con matriptase e la sua attività verso H3N2 ettari. In vivo matriptase si trova nella membrana delle cellule, ma l'enzima disponibile in commercio è il dominio catalitico solubile. Come discusso per quanto riguarda le proteine di fusione, è possibile che richiede anche la proteasi Full-Length per interagire con il substrato di proteine full-length per ottenere la scissione e che prova solo singoli domini può provocare falsi positivi.
Questa metodologia è indicato per essere efficace per studiare la fenditura di sequenze dell'amminoacido specifico dalla furina. Tuttavia, le applicazioni delle estensioni tecnica per qualsiasi proteasi disponibili (ad es., catepsine, proteina convertasi), che lo rende un metodo utile ai candidati di peptide di schermo per la scissione della proteasi. Inoltre, è stato indicato che questo test può essere utilizzato anche per testare l'efficacia degli inibitori della proteasi e quindi fornisce un veloce e facile strumento per schermo proteina inibitori23.
Il dosaggio di fenditura del peptide fluorogenico descritto qui rappresenta un'aggiunta alla fenditura di bioinformatic segnando algoritmi, che predice la fenditura del peptide da una proteasi determinata, sulla base delle proprietà dell'amminoacido e sequenza. Queste due tecniche, in combinazione con la tradizione western blotting tecniche utilizzabile come un metodo efficace per studiare la proteasi clivaggio in vitro.

Fusione virale con la membrana cellulare di host è un passo cruciale nel ciclo di vita del virus capsulati e facilita l'ingresso nella cella e replicazione del virus. In genere, virus possiedono una proteina specializzata (o proteine) che si lega ai recettori sulla membrana della cellula ospite e scatena il virus-cellula membrana fusione1. Proteine di fusione virale sono stati raggruppati in tre classi principali (I-III)1. Un numero di virus che sono attualmente delle principali preoccupazioni per la salute pubblica, come il virus dell'influenza (che rappresenta una lunga emersione zoonotica dagli uccelli) e sindrome-coronavirus respiratorio medio Oriente (MERS-CoV) (che rappresenta una recente zoonotici emergere dai cammelli), utilizzano le cosiddette proteine di fusione, che richiedono elaborazione proteolitica da proteasi di host, per esercitare la loro attività fusogena2di classe I. Allo stesso modo, il coronavirus felino (FCoV), che rappresenta una minaccia grave malattia per gatti selvatici e domestici, possiedono anche una classe la proteina di fusione. Classe I fusione virale proteine in genere sono sintetizzate come precursore dell'ApoAlert e generalmente consistono in due domini che sono responsabili del recettore vincolante e innescando l'evento di fusione rispettivamente. Ad oggi, l'emoagglutinina (HA) di riossidazione è meglio compreso proteina di fusione e numerosi studi hanno descritto il suo ruolo meccanicistico in host cella voce e fusion3. In questo caso la fenditura della proteina di fusione si verifica in una sequenza specifica o un sito di clivaggio all'interno HA e in combinazione con cambiamenti conformazionali di pH-dipendente, risultati dell'esposizione di fusione virale del peptide1,2.
Il peptide di fusione e la sua sequenza di riconoscimento di proteasi sono critici per la patogenicità e l'adattamento di ospite del virus. Cambiamenti nella sequenza del riconoscimento della proteasi possono alterare la fenditura significativamente con conseguenze potenzialmente drammatiche per il virus e l' ospite4. Da un lato, può abrogare fenditura ed eliminare così il ciclo di vita del virus. Ma d'altra parte, una mutazione può aumentare la specificità di substrato per una proteasi determinata e/o consentire una "nuova" proteasi fendere la proteina di fusione. Successivamente, questo può anche espandere il trofismo delle cellule e dei tessuti, come osservato, per esempio, con l'influenza virus sottotipi5,6. Solitamente a bassa patogenicità (LPAI) virus e virus influenzali più umano sono limitati al tratto gastrointestinale o delle vie respiratorie a causa la localizzazione limitata delle proteasi che li attivano. In genere, il peptide di fusione di tali proteine HA è preceduto da una sequenza di acido 4-amino consiste di 1-2 non consecutivi amminoacidi basici, che è riconosciuta dalla proteasi della serina tripsina-simile come tripsina, matriptase o TMPRSS27, 8. quando il virus acquisisce gli inserimenti o mutazioni che cambia il luogo di fenditura di un sito polibasici, consente a furin per attivare l'HA e potenzialmente causare un molto più grave infezione sistemica6,9. Questi virus sono denominati virus di influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI), caratterizzata da ceppi H5N1.
Al contrario HA l'influenza, molti coronavirus, quali MERS-CoV, hanno due siti di fenditura distinti all'interno di loro proteina spike. Il sito di S1/S2 separa il dominio di legame del recettore N-terminale (S1) dal dominio C-terminale fusione (S2), con un secondo sito di clivaggio, chiamato S2', a valle del sito S1/S2, in prossimità del peptide di fusione10. È stato suggerito che i siti sono spaccati in modo sequenziale, seguita da S2 S1/S2 '. In contrasto con l'HA della maggior parte dei ceppi di virus dell'influenza, della proteina S di MERS-CoV S1/S2 e S2' siti possono essere riconosciuti da proteasi della famiglia proteina convertasi (PC), ad esempio furin. Membri di questa famiglia cleave a base accoppiati residui con il motivo R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Generalmente, gli aminoacidi a Monte del sito di clivaggio si riferisce come P1, P2, P3, ecc. conteggio del sito di clivaggio e gli aminoacidi a valle sono designati come P1', P2', P3', ecc. 11. FCoV ceppi possono avere un singolo o un sito di clivaggio doppio. Come MERS-CoV, alcuni ceppi di FCoV possiedono anche due siti di fenditura (S1/S2 e S2') in loro proteina S. Tuttavia, questa caratteristica è esclusa sierotipo I FCoVs (clade A). Al contrario, i membri del raggruppamento sierotipo II (clade B) hanno solo un sito di clivaggio singolo (S2')2,12. Proteasi diversi sono state suggerite per fendere i siti di fenditura di FCoV, tra cui furin, proteasi tripsina-simile e catepsina. È stato proposto che la proteina S di FCoV enterici (noto anche come felino coronavirus enterico o FECV) rischia di essere clivata da furin nel sito S1/S2 e mutazioni in questo sito (nonché presso S2') conduce ai cambiamenti nei requisiti di proteasi. Queste mutazioni sono state associate con i cambiamenti nel trofismo e patogenicità di questi virus, permettendo che il virus diventi sistemica e macrofago-tropico (peritonite infettiva felina anche conosciuto come virus o FIPV)13.
Virus naturalmente introdurre mutazioni nel loro genoma durante ogni ciclo di replica e frequentemente nuovi sottotipi e ceppi di influenza, MERS-CoV e FCoV sono descritti14,15,16. Come parte di una valutazione veloce per valutare la minaccia di salute pubblica di virus emergenti, è fondamentale per studiare i cambiamenti del sito di clivaggio e come influisce la gamma delle proteasi attivazione di questi virus. Qui, descriviamo un saggio basato a peptide che permette una valutazione molto veloce di come i cambiamenti del sito di clivaggio in proteina S MERS-CoV incidono la specificità di substrato di una proteasi determinata e allo schermo rapidamente varie proteasi per la loro capacità di fendere un determinato o più sequenze4. In una seconda serie di esperimenti, abbiamo usato la tecnica per determinare l'attività di clivaggio furin sui ceppi, nonchè diversi sierotipi di FCoV.
I peptidi usati per questo test vengono modificati con la coppia transfer (FRET) energia di risonanza di fluorescenza, 7-methoxycoumarin-4-yl acetile (MCA) all'estremità N-terminale e N-2,4-dinitrophenyl (DNP) al C-terminale. Durante il dosaggio, MCA è eccitato ed emette energia luminosa che si spegne di DNP, purché la coppia sia nelle immediate vicinanze a vicenda. In caso di scissione, tuttavia, DNP non è in grado di placare l'emissione di piu ' e può essere letto da lettore della piastra di fluorescenza. Le modifiche nella fluorescenza viene misurata durante l'esperimento per determinare il tasso di fenditura del peptide e per calcolare la velocità alla quale la proteasi fende il peptide specifico (noto anche come Vmax)17.
Al fine di progettare i peptidi, il gene della proteina di fusione rispettivi deve siano stato sequenziato e reso disponibili in un database. Tuttavia, il metodo è meno manodopera-intenso e costoso rispetto ai metodi tradizionali che richiedono solitamente la clonazione del gene della proteina di fusione in vettori di espressione per esprimerla in cellule di mammifero per analizzare la fenditura. Dall'inizio alla fine, questo può richiedere diversi giorni fino a un paio di settimane, mentre i dosaggi di peptide presentati qui possono essere fatto entro un giorno, non appena sono disponibili peptidi e proteasi. L'installazione del dosaggio dura tra 5 e 30 min a seconda del numero di campioni e il runtime nel lettore della piastra di fluorescenza è 1 h. analisi dei dati potrebbe richiedere fino a 2 h di nuovo a seconda della dimensione del campione.
Qui, abbiamo scelto due esempi diversi di presentare il dosaggio. Nel primo esempio, presentiamo i dati che confronta il clivaggio furin-mediata di umano e cammello-derivato MERS-CoV, per valutare il potenziale dei ceppi cammello-derivati di essere attivato negli esseri umani se attraversano la barriera di specie. Nel secondo esempio, abbiamo usato un'analisi di peptidi fluorogenici per determinare il clivaggio furin-mediata della S1/S2 e S2' siti o S2' sito di due sierotipo io e due sierotipo II FCoV ceppi, rispettivamente. Per questi esperimenti, abbiamo usato il clivaggio di tripsina come controllo positivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

Virus capsulati quali coronavirus o influenza virus richiedono clivaggio proteolitico del loro proteina di fusione per essere in grado di infettare la cellula ospite. Spesso i virus esibiscono il trofismo delle cellule e dei tessuti e sono adattati alle specifiche proteasi delle cellule o del tessuto. Inoltre, questi virus possono introdurre mutazioni o inserimenti nel loro genoma durante la replica che può influenzare la fenditura e può contribuire così a adattamenti ad un nuovo ospite. Qui, presentiamo un saggio di clivaggio di peptide fluorogenico che consente un rapido screening di peptidi che imita il sito di clivaggio delle proteine di fusione virale. La tecnica è molto flessibile e può essere utilizzata per studiare l'attività proteolitica di una proteasi singola su molti substrati diversi, e inoltre, permette anche l'esplorazione dell'attività delle proteasi multiple su uno o più substrati del peptide. In questo studio, abbiamo utilizzato peptidi che imita i motivi del sito di clivaggio della proteina spike coronavirus. Abbiamo testato umano e cammello derivato coronavirus della sindrome respiratoria Medio Oriente (MERS-CoV) per dimostrare che singole e doppie sostituzioni nel sito di clivaggio possono alterare l'attività della Furina e modificare drasticamente l'efficienza di clivaggio. Abbiamo anche usato questo metodo in combinazione con bioinformatica per attività di clivaggio furin di coronavirus felino spike proteine da diversi sierotipi e di ceppi di test. Questo metodo basato a peptide è meno manodopera e tempo intensivo rispetto ai metodi tradizionali utilizzati per l'analisi di attività proteolitica per virus e risultati possono essere ottenuti all'interno di un singolo giorno.

Nella prima parte di questo studio, abbiamo utilizzato peptidi che rappresentano la S2' sito di clivaggio di tre distinte proteine di MERS-CoV S: dal prototipo EMC/2012 ceppo umano (Genbank AFS88936.1) e da due selezionati cammello-derivato MERS-CoV, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) e Mor215 (Genbank AVN89324.1) ceppi, isolati in Egitto e Marocco, rispettivamente (tabella 1)16,18.
Rispetto al ceppo EMC/2012, la S2 HKU205' sito di clivaggio ha due mutazioni nel P2 e P1' posizioni che potrebbero potenzialmente influenzare il suo riconoscimento dalla furina e alterare l'efficienza di clivaggio (tabella 1). Inoltre, eravamo interessati a studiare se e come ogni mutazione individuale trovata nel ceppo HKU205 influisce clivaggio furin. Abbiamo, pertanto, inclusi due peptidi dove le singole sostituzioni sono stati introdotti la sequenza del peptide EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' ed EMC/2012 mutS-ho S2') (tabella 1). Furin era in grado di fendere il peptide EMC/2012 in modo efficiente con un Vmax di 6,3 ± 1.2 RFU/min, mentre abbiamo non rilevato quasi nessuna scissione quando si utilizza la S2' peptide del ceppo HKU205 (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Figura 1a). Quando si esamina la EMC/2012 mutA-S S2' peptide, abbiamo trovato che la scissione è stata fortemente ridotta rispetto alla sequenza wild-type (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). Non c'era quasi nessuna scissione durante il test il mutS EMC/2012-io S2' peptide (Vmax 1.1 ± 0,9 RFU/min) (Figura 1a).
Recentemente, gli isolati di MERS-CoV dall'Africa occidentale sono stati segnalati che sono filogeneticamente distinti da MERS-CoV trovato nella penisola arabica16. Uno degli isolati recentemente descritti è il ceppo Mor213, che trasporta una leucina invece un'arginina in posizione P4 della S2' sito (tabella 1), e che potrebbe potenzialmente impatto relativo riconoscimento dalla furina e alterare l'efficienza di clivaggio. Nostra analisi di peptidi ha mostrato che c'è solo minima fenditura della S2 Mor213' sito rispetto al sito EMC/2012 (Figura 1b). Il Vmax per il peptide di Mor213 è di 1,0 ± 0,1.
Per la seconda parte di questo studio, abbiamo usato la stessa analisi di peptidi per valutare clivaggio furin-mediata di siti di fenditura della proteina di FCoV S. Abbiamo usato peptidi che imita il sito di clivaggio S1/S2 due FCoV sierotipo ho virus: FECV I e-4 (da laboratorio Whittaker) e FIPV I Black (Genbank AB088223.1). Abbiamo usato anche peptidi che imita la S2' sito di questi virus, come pure due FCoV sierotipo II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) e ceppi di FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (tabella 1). Furin scissione si verifica in genere, quando sono presenti nelle posizioni P1 e P4 del sito di clivaggio base residui (arginina e lisina). Mutazioni nel P1, P4 e P1' posizioni sono suggeriti per interferire con furin spaccabilità, alterando di conseguenza i requisiti della proteasi della proteina. (Tabella 1). Clivaggio furin è stata osservata per il prototipo S1/S2 peptide FECV I e-4 S1/S2 (± 100.36 Vmax 7,61 RFU/min) ma non nel mutato S1/S2 peptide FIPV ho nero S1/S2 (Vmax -1.37 ± 1.29 RFU/min) (Figura 2A). Allo stesso modo, era in grado di fendere il prototipo S2 furin' peptide FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0,97 RFU/min), ma non il mutato S2' peptidi FECV I e-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV ho S2 nero ' (Vmax 0.30 ± 0,14 RFU/min) e FIPV II 1146 S2' (Vmax -0,36 ± 0,11 RFU / min) (Figura 2B). Abbiamo usato la tripsina come controllo positivo per la scissione del peptide e abbiamo osservato il clivaggio di tripsina in tutti i peptidi utilizzati (Supplemental figura 2).
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
Tabella 1. Peptidi usati e corrispondente dell'amminoacido sequenze. I peptidi utilizzati nelle analisi contengono la coppia FRET (MCA/DNP) acetil/2,4-dinitrophenyl (7-methoxycoumarin-4-yl). I P4 e P1 fenditura sito posizionato arginina (R) residui, che sono riconosciuti dalla furina, sono in grassetto. Residui in rosso corrispondono a mutazioni rispetto alle sequenze di riferimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> Figura 1 . Clivaggio proteolitico Furin-mediata di umano e cammello-derivato MERS-CoV S2' siti peptidi fluorogenici. R. saggio di clivaggio Furin umano MERS-CoV EMC/2012 S2 ' sito e sforzo cammello-derivato HKU205 (doppio mutante), insieme a varianti singoli mutante di EMC/2012 (mutA-S e mutS-io). B. analisi di clivaggio Furin umano MERS-CoV EMC/2012 S2 ' sito e sforzo cammello-derivato Mor213. Per i pannelli A e B, peptidi sono stati incubati con furin ricombinante e l'aumento della fluorescenza a causa di processamento proteolitico è stata misurata usando un fluorimetro. Le analisi sono state eseguite in triplici copie con risultati che rappresentano medie di Vmax da tre esperimenti indipendenti (n = 3). Barre di errore indicano SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> Figura 2 . Furin-mediata di clivaggio proteolitico di FCoV S1/S2 e S2' siti peptidi fluorogenici. R. clivaggio Furin dosaggio di FECV I e-4 e FIPV sono siti nero S1/S2. Peptidi sono stati incubati con furin ricombinante. B. analisi di clivaggio Furin di FECV I e-4, FIPV nero, FECV II 1683 e FIPV II 1146 S2' siti. L'aumento della fluorescenza a causa di processamento proteolitico è stata misurata usando un fluorimetro. Le analisi sono state eseguite in triplici copie con risultati che rappresentano medie di Vmax da tre esperimenti indipendenti (n = 3). Barre di errore indicano SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
Supplemental tabella 1: Valori di Vmax utilizzati per Figura 1 e Figura 2. Il Vmax valori sono stati calcolati dai grafici come illustrato in supplementare nella figura 1 e come descritto nel protocollo sezione 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Supplementare Figura 1: illustrazione di dati grezzi derivati dal piatto lettore software. Aumento di fluorescenza sopra grafici temporali che sono stati utilizzati per la determinazione del Vmax. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Supplementare nella figura 2: il clivaggio proteolitico tripsina-mediata del FCoV S1/S2 e S2' siti peptidi fluorogenici. Clivaggio di tripsina dosaggio di FECV I e-4 e FIPV ho nero S1/S2 siti e di FECV I e-4, FIPV nero, FECV II 1683 e FIPV II 1146 S2' siti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Presentiamo un'analisi di clivaggio di peptide fluorogenico che consente un rapido screening dell'attività proteolitica delle proteasi su peptidi che rappresenta il sito di clivaggio di peptidi virali fusione. Questo metodo può essere utilizzato anche su qualsiasi altro motivo dell'amminoacido all'interno di una sequenza della proteina per verificare l'attività della proteasi.

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica, come la modifica proteolitica delle proteine, così come la caratterizzazione di inibitori e proteasi e peptidasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un rapido screening dell'attività proteolitica delle proteasi sui peptidi, rappresentando il lato di scissione della proteina data. L'uso qui è quello di studiare le proteasi che attivano la fusione virale.Il primo passo nella progettazione peptidica è quello di acquisire la sequenza della proteina di fusione di interesse da un database pubblico come NCBI o il database di agenti patogeni virali. Scegli il sito di riconoscimento della proteasi procedendo con il peptide di fusione e includi da due a tre amminoacidi a monte e a valle di questa sequenza. Quando si ordina il peptide, modificarlo con il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza o la coppia FRET, Mca al capolinea finale e Dnp al capolinea c.Durante il saggio, Mca è eccitato ed emette energia luminosa che viene spenta da Dnp finché la coppia è in prossimità l'una dell'altra. Tuttavia, se si verifica una scissione, Dnp non sarà in grado di spegnere l'emissione che può quindi essere letta dal lettore di piastre a fluorescenza. Riprendono il peptide secondo le raccomandazioni dei produttori tubazionando delicatamente su e giù.Ad esempio, resuspend in 70%etanolo ad una concentrazione finale di un millimolare. Se il peptide non si rimospende molto bene con la pipettazione, posizionare il tubo contenente il peptide e il solvente in un bagno di sonicazione fino a quando non viene completamente rimorsi. Distribuire 100 aliquote microliter del peptide in tubi leggeri di smorzamento o resistenti per proteggere il peptide dallo sbiancamento.Conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius. Iniziare questa procedura accendendo il lettore di lastre e aspettando fino al termine dell'autotest. Quindi, aprire il software operativo sul computer collegato e assicurarsi che sia collegato al lettore di piastre.Aprire l'impostazione della temperatura e impostarla sulla temperatura richiesta per prestazioni ottimali per la proteasi, che è di 30 gradi Celsius, in questo caso. Per impostare l'esperimento, fare clic sulla configurazione dello strumento di controllo, scegliere cinetico e quindi selezionare fluorescenza. Immettere una lunghezza d'onda di eccitazione di 330 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 390 nanometri.Deselezionate il taglio automatico e selezionate la sensibilità medio/normale. Scegli un tempo di esecuzione di un'ora per il saggio e seleziona una misurazione ogni 60 secondi. Impostare cinque secondi di miscelazione prima della prima misurazione e tre secondi prima di ogni misurazione.Infine, selezionare i pozzi da leggere. Preparare i tamponi di dosaggio appropriati per le proteasi come descritto nel protocollo di testo e raffreddare i tamponi sul ghiaccio. Posizionare una piastra solida in polistirolo nero non trattato a 96 poggiale sul ghiaccio con una sottile piastra metallica sottostante per supportare il raffreddamento e la stabilità.È essenziale utilizzare una piastra nera come piastra di dosaggio, per evitare perdite fluorescenti da pozzi adiacenti. Per peptide, preparare tre repliche tecniche per saggio e un volume totale di 100 microlitri per campione. Pipettare la quantità appropriata di tampone di dosaggio in ogni pozzo della piastra di dosaggio.Aggiungere 0,5 microlitri di proteasi ad ogni pozzo. A sei pozzi, aggiungere 0,5 microlitri di tampone invece della rispettiva proteasi. Tre di questi saranno controlli ciechi e gli altri tre saranno controlli peptidici.Aggiungere cinque microlitri del peptide a una concentrazione finale di 50 micromolari ad ogni pozzo, ad eccezione dei controlli ciechi. A ciascuno dei tre pozzi di controllo ciechi, aggiungere cinque microlitri di tampone invece del peptide. Inserire il piatto nel lettore di lastre flourescents e fare clic su avvia.Prima di avviare l'analisi dei dati, salvare il file dell'esperimento. Fare clic sull'esportazione ed esportare il file come txt. Importare il file txt in un foglio di calcolo.Iniziate l'analisi creando un grafico, tracciando le unità fluorescenti relative sull'asse y rispetto al tempo sull'asse x per ogni replica tecnica per campione. Selezionare l'intervallo di dati in cui il grafico si trova in un intervallo lineare e il più vicino all'inizio dell'aumento della fluorescenza. Tracciate i dati selezionati su un secondo grafico e aggiungete una linea di tendenza lineare.Nelle opzioni della linea di tendenza selezionare Visualizza equazione nel grafico. L'equazione mostrerà V max, che corrisponde alla pendenza della linea di tendenza. Calcolare il valore medio V max per ogni campione dalle tre repliche tecniche.Dopo aver ripetuto l'esperimento altre due volte, per ottenere tre repliche biologiche, calcolare la deviazione standard in base ai dati delle tre repliche biologiche indipendenti. Un saggio di scissione furina del coronavirus MERS umano, del sito principale EMC/2012 S2 e del ceppo doppio mutante derivato dal cammello HKU205, insieme alle singole varianti mutanti di EMC/2012, ha rivelato che il peptide EMC/2012 è stato efficacemente scisto, mentre quasi nessuna scissione del peptide primario S2 di HKU205 si è verificata. La scissione del peptide primario S2 mutato da A-S/2012 È stata fortemente ridotta e non c'è stata quasi alcuna scissione del peptide primario DA EMC/2012 S a I mutato S2.Un altro saggio di scissione della furina ha mostrato solo una scollatura minima del sito principale Marocco 213 S2 derivato dal cammello, rispetto al coronavirus MERS umano, sito principale EMC / 2012 S2. La scissione della furina è stata osservata per il peptide prototipo S1/S2, FECV I e 4 S1/S2, ma non nel peptide S1/S2 mutato, FIPV I Black S1/S2. Allo stesso modo, furin fu in grado di scindere il peptide primario S2 prototipo, FECV II 1683 S2 prime, ma non i peptidi primi S2 mutati, FECV I e 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime e FIPV II 1146 S2 prime.Seguendo questa procedura, l'analisi western della macchia o i saggi di ammino-fluorescenza, utilizzando la proteina a tutta lunghezza di interesse possono essere eseguiti per verificare la scissione proteica, o in questo caso, se la scissione si traduce in una versione fusogena della proteina di fusione virale.

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...