Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
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本稿で提示する MERS プロジェクトは、NIH によって提供された研究の資金は、R21 AI111085 付与します。猫コロナ ウイルスの研究は、モリス動物財団、ウィン ネコ科の基礎、コーネル猫健康センターからの研究補助金によって支えられました。我々 はまたマリク ピーリス提供いただきありがとうございます私たち Mor213 シーケンスを持つそれは公開前にしたいと思います。

1 設計およびペプチドの準備
<ol><li>NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) などのパブリック データベースまたはウイルス病原体データベース (https://www.viprbrc.org) からの興味の融合タンパク質のシーケンスを取得します。融合ペプチドの前プロテアーゼ認識サイトを選択し、2-3 アミノ酸上流と下流にこのシーケンスが含まれます。</li>
	<li>ペプチドをご注文の際は、N-2, 4-ジニトロフェニルアミン (DNP) C 末端と N 末端でフレット ペア 7-メトキシクマリン-4-イル アセチル (MCA) とそれらを修正します。 注: いくつかのサプライヤーは、これらの変更を提供します。価格や配送時間選択肢のサプライヤーに依存します。ただし、感度が異なるし、波長の面でプレート リーダーの調整を必要とする変更の選択肢が存在します。</li>
	<li>上下に軽くピペッティングによるメーカーの推奨事項に従ってペプチドを再懸濁します。たとえば、1 mM の最終濃度を 70% エタノールでペプチドを再懸濁します。</li>
	<li>必要に応じて、超音波風呂にペプチッドおよび溶媒を含むペプチドはピペッティングでよく再懸濁しましていない場合それは完全に再停止されるまでチューブを追加します。</li>
	<li>分注光減衰または耐性ペプチド漂白からペプチドを保護するチューブします。割り切れるサイズを小さく複数凍結/解凍サイクル (例えば100 μ L) を避けるために。因数-20 ° C で保存します。</li>
</ol>2. 蛍光プレート リーダーを準備します。
<ol><li>プレート リーダーで切り、セルフテストが終了するまで待ちます。</li>
	<li>接続しているコンピューターのオペレーティング ソフトウェアを開き、プレート リーダーと接続されていることを確認します。</li>
	<li>温度設定を開き、30 ° C (または、プロテアーゼの最適なパフォーマンスに必要な温度) に設定します。</li>
	<li>コントロールをクリックして |セットアップを計測器実験を設定します。</li>
	<li>運動を選択します。</li>
	<li>蛍光を選択します。</li>
	<li>励起と発光波長を入力: 330 nm と 390 nm それぞれ。</li>
	<li>自動カットオフを選択解除します。</li>
	<li>中、通常の感度を選択します。</li>
	<li>試金のための 1 時間のランタイムを選択し、選択の 1 つの測定すべての 60 s。</li>
	<li>最初の計測と 3 の前に混合セット 5 s の各測定前に s</li>
	<li>井戸を読むし、アッセイを開始を選択します。</li>
</ol>3. 試金の準備
<ol><li>各成分の適切な量を計算し、追加分析バッファーを準備します。風鈴の 100 mM HEPES、1 mM の CaCl2、1 mM 2-メルカプトエタノール、5% のバッファーを作るトリトン X-100。トリプシン、標準リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューションを使用します。 注: ボリュームの 10 mL 以下で十分です。試金で使用される protease(s) によってバッファーが異なります。</li>
	<li>氷の上のバッファーを冷やします。</li>
	<li>サポート冷却し安定性の下に薄い金属板が付いている氷にアッセイ プレートを配置します。ソリッド黒の底が平坦なポリスチレン 96 ウェル プレートと非投与に使用します。 注: それは隣接する井戸から蛍光「漏れ」を防ぐために黒いプレートを使用することが欠かせません。</li>
	<li>以前の出版物または実験データに基づいて各反作用のため追加するプロテアーゼの適切な量を計算します。風鈴、0.5 μ L に相当する反応ごとに 1 ユニットを使用します。トリプシン、160 nM TPCK トリプシンの 0.5 μ L を使用します。</li>
	<li>サンプルあたり 1 サンプルあたり 100 μ L の総ボリュームでアッセイあたり 3 技術的複製を準備します。 注: それは実験的、それ違いをしない、通常の光条件下で実施、ピペッティングまたは光を淡色表示されているかどうか評価しました。しかし、ペプチドは、長期間の光に公開されませんする必要があります。</li>
	<li>各ウェルにアッセイバッファー (94.5 μ L のステップ 3.1 で説明したよう) の適切な量をピペットします。</li>
	<li>各ウェルにプロテアーゼを追加します。風鈴と TPCK トリプシンの両方、サンプルあたり 0.5 μ L を使用します。6 井戸 (空白のコントロール用 3 井戸) ・ 3 井戸ペプチド コントロールのそれぞれのプロテアーゼではなく 0.5 μ L バッファーを追加します。</li>
	<li>空白のコントロールを除く各ウェルに 50 μ M の最終的な集中に、ペプチドを追加します。この場合、ピペットの 5 μ L ペプチド手順 1.3 で説明されています。バッファーの 5 μ L をペプチドではなく空白のコントロールに追加します。 注: いくつかのペプチド濃度は酵素が飽和しているように記述されていた酵素濃度の最初テストされました。</li>
	<li>蛍光プレート リーダーにプレートを挿入し、[開始] をクリックします。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>実験ファイルを保存します。</li>
	<li>エクスポートをクリックし、ファイルを .txt としてエクスポートします。</li>
	<li>.Txt ファイルをスプレッドシートにインポートします。</li>
	<li>サンプルごとの各技術的な複製、軸、y 軸 x 軸 (補足図 1) の時間に対する相対的な蛍光単位 (RFU) をプロット グラフを作成します。</li>
	<li>線形の範囲で蛍光の増加の開始に最も近いグラフがあるデータ範囲を選択します。</li>
	<li>2 番目のグラフに選択されているデータをプロットし、線形近似曲線を追加します。</li>
	<li>[近似曲線のオプショングラフに数式を表示します。方程式、Vmax が表示されます。</li>
	<li>3 技術から各サンプルの平均 Vmax を複製を計算します。</li>
	<li>3 生物の複製を取得するには、倍の実験を繰り返します。</li>
	<li>3 独立した生物からのデータに基づいて標準偏差を複製を計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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プロテアーゼの蛋白質分解開裂のタンパク質配列の高速スクリーニングにより蛍光ペプチド アッセイをご紹介します。最初の例では異なる胸の谷間を選んだが、サイトこの試金のための 1 つのアプリケーションを説明するために MERS コロナ ウイルス スパイク (S) 蛋白質のモチーフ。いくつか種を横断する可能性があります私は MERS コロナ ウイルス、Sars-cov (重症急性呼吸器症候群)、インフルエンザなどのタンパク質は、公衆衛生のための主要な懸念と新しいサブタイプを進化を続けるフュージョン クラスを所有しているウイルスに包まれて人間1,15,16に彼らの自然なホストからの障壁。実験室でそれらを栽培し、ウイルスを分離できない可能性があります常にまたは研究のすべての施設では利用できない特別な実験室が必要です。したがって、通常の実験室の条件の下で行うことができる新たなウイルスの潜在的な公衆衛生の脅威を評価する手法の必要性があります。ウイルスに加え人間のターゲット、FCoV のようないくつかの動物のウイルスも持っている同じクラス I の融合蛋白質、したがって、彼らの人間の同等よりも同様の特性を共有します。これらのウイルスを分離することに、挑戦、必要なそれらを勉強する革新的なツールの活用も可能です。
上記のウイルスのライフ サイクルの重要なステップは、セルに入力するホストとホスト プロテアーゼ1,2でそれぞれ融合タンパク質のプロテアーゼによるプロセシングを介した融合です。融合タンパク質の遺伝子を哺乳類発現ベクターにクローン、哺乳類細胞タンパク質発現を可能にする、孵化させなさいまたは共同関心、分離のプロテアーゼ transfect transfect にウイルスのライフ サイクルのこの部分を調査する標準的な方法は、タンパク質、西部のしみの分析を実行します。このメソッドは、いくつかの制限が付属しています: 融合タンパク質とその胸の谷間製品を検出する抗体の可用性は、いくつか取ることができる DNA ・ RNA クローニング、DNA または RNA が利用できない場合、遺伝子を合成するためのコストのための可用性週全体の研究が行われるまで。それより多くの時間がかかり、お金と労働集約的なサイト指示された突然変異誘発が必要なために、胸の谷間のサイトでいくつかの変異を調査する場合は、研究の関心をもなります。ここで述べる蛍光ペプチド アッセイでは、これらの制限はありません。興味のペプチドは、公に利用可能なシーケンスに基づくような研究のこれらの種類に関連する組換えのプロテアーゼの広い範囲を提供するいくつかの製造者がある、内分析を含むアッセイを行うことが、1 日。
S2 の風鈴を介した胸の谷間を調べた例では、' 人間とエジプトとモロッコからラクダに由来する MERS コロナ ウイルス S タンパク質のプロテアーゼ認識サイト。人間の EMC/2012 とラクダ HKU205 S2' サイトに典型的な RXXR 風鈴胸の谷間モチーフが含まれています。しかし、スコアリング アルゴリズム HKU205 S2 ピトー 2.0 胸の谷間によると ' サイトは実験的確認19風鈴、我々 によって裂かれると予測されていません。理由なぜ HKU5 S2' によっては処理されません風鈴は P1 のイソロイシンが原因かもしれない ' の位置。EMC/2012 S2 で個々 の変異を運ばれる 2 つのペプチドでテストしたとき 'シーケンス、我々 がすることを確認できた、P1 のイソロイシン' 主置換セリンをアラニンは、減らされた胸の谷間が胸の谷間を放棄します。Mor213 S2' 風鈴胸の谷間モチーフがサイトに含まれていないと、ほとんどない胸の谷間を検出する驚きではありません。S1/S2 と S2 の風鈴の切断、また調べた ' FCoV S タンパク質のプロテアーゼ認識サイト。両方 FECV ペプチドの風鈴胸の谷間を観察することができました (FECV I と 4 S1/S2 と FECV II 1683 S2')、FIPV ウイルス変異塩基配列された風鈴は切断しません。
風鈴を介した EMC/2012 S2 の胸の谷間を比較するとき ' FECV I と 4 S1/2 ペプチド (図 2 a) ペプチド (図 1 a)、私たちは、Vmax でおおよそ 26-fold 違いがあったことが分かった。これは、両方のシーケンス (表 1) に風鈴胸の谷間モチーフによって説明することができます。風鈴胸の谷間の最小要件は RXXR モチーフが、RXRR シーケンスははるかに有利な2です。したがって、EMC/2012 S2' RSRR 風鈴胸の谷間サイト (表 1) を含む FECV I と 4 S1/2 ペプチドと比較して少ない特異性の RSAR モチーフであるペプチドを切断します。
しかし、アッセイの 1 つの主要な制限は、ペプチドは、彼らは通常に埋め込まれているタンパク質の三次構造を反映していません。完全な長さの融合蛋白質の胸の谷間公開融合ペプチドとトリガー ホスト セルのエントリ1。プロテアーゼとの融合タンパク質間の相互作用も影響を受ける可能性融合タンパク質の三次構造で中のペプチドがもっとまたはより少なく線形場合を考えます。したがって、ペプチド アッセイの検出された胸の谷間は人工があり、体内の状況を反映していない可能性があります。これはインフルエンザ H3N2 HA サブタイプの胸の谷間の matriptase によって報告されました。いくつかのグループは、ペプチド アッセイの matriptase によって H3N2 HA の開裂を説明、また全長 H3N2 HA 蛋白質および細胞培養の matriptase の孵化でした融合性 HA 蛋白質4,20、発生しないことが示されました。 21。蛋白質分解開裂の生物学的に重要な規制がタンパク質の立体構造のレベルであることを示すその他の例があります。それは、融合蛋白質は時々 一連の融合時に胸の谷間サイトを公開できるように事前の融合イベントを必要があることが記載されています。セムリキ森林ウイルス融合タンパク質、たとえば、その融合タンパク質を公開し、プロテアーゼ活性化22の使用できるようにするために prefusion イベントの数の間に構造再配列が必要です。したがって、蛍光ペプチド分析で得られた結果は、細胞融合の試金または同様の実験によって検証する必要があります。ただし、ペプチド アッセイには、いくつかのプロテアーゼ/ペプチドの組み合わせと胸の谷間を表示しない組み合わせが生体内で同じ結果が発生する可能性が高いので、労力とフォロー アップの実験の時間を減らすために高速スクリーニングができます。
アッセイの 2 番目の主要な制限は、プロテアーゼを懸念します。これまでのところ溶性プロテアーゼですがない膜プロテアーゼをテストすることが可能です。に応じて、実験の意図、これ問題になることができます。たとえば、インフルエンザが8細胞膜にある膜プロテアーゼの数によってアクティブ化されます。ある程度、可溶性蛋白分解アクティブなドメインを使用してこの問題を回避ことができますが、結果は慎重に解釈しなければならないし、従来の方法で検証する必要があります。我々 は matriptase と h3n2 型 HA に向けて活動 beforementioned の例を参照してくださいしたいと思います。Matriptase生体内では細胞膜にあるが、市販の酵素は水溶性の触媒ドメイン。融合蛋白質に関して議論、胸の谷間と単一ドメインのみをテストの偽陽性の結果可能性があります取得する実物大蛋白質基板との対話をフルレングスのプロテアーゼがまた必要です可能な場合があります。
この方法論は、風鈴による特定のアミノ酸シーケンスの胸の谷間に効率的であると示しています。ただし、任意の利用可能なプロテアーゼ (例えばカテプシン、するプロタンパク質転換) する技術範囲のアプリケーション画面ペプチド候補者プロテアーゼ切断のために役に立つメソッドにすること。さらに、それは、この試金がプロテアーゼ阻害剤の有効性をテストするためにも使用できます、したがって、高速かつ簡単にするツール画面タンパク質阻害剤23を提供して示されています。
ここで説明した蛍光ペプチド胸の谷間アッセイは、アミノ酸のプロパティとシーケンスに基づいて断固としたプロテアーゼによってペプチド胸の谷間を予測するスコアリング アルゴリズム、バイオ情報谷間に加えを表します。ウェスタンブロッティング技術の伝統との組み合わせで、これらの 2 つの手法は、プロテアーゼの胸の谷間で培養を研究する効率的な方法として使用できます。

宿主細胞膜とウイルスの融合の囲まれたウイルスのライフ サイクルの重要なステップは、細胞やウイルスの増殖への参入を容易に.通常、ウイルスは宿主細胞膜上の受容体に結合し、ウイルス細胞膜融合1をトリガーする専門にされた蛋白質 (または蛋白質) を所有しています。ウイルスの融合蛋白質は、3 つの主要なクラス (I-iii)1に分類されています。インフルエンザ (鳥から長年獣出現を表す) および中東呼吸器症候群コロナ ウイルス (MERS コロナ ウイルス) などの公衆衛生のための主要な関心事は、現在ウイルスの数 (最近を表す人獣共通感染ラクダから出現)、いわゆる利用クラス I の融合蛋白質の膜融合活動2を発揮する、ホストのプロテアーゼによって蛋白質分解処理を必要とします。同様に、猫コロナ ウイルス (FCoV)、野生および国内猫のための主要な疾患の脅威を表し、またクラスを所有している私の融合タンパク質。クラス I 蛋白質通常分解されていないの前駆体として合成され、受容体結合とそれぞれ融合イベントのトリガーは、2 つのドメインから成っている一般にウイルスの融合。日に、インフルエンザ ヘマグルチニン (HA) は最高の融合蛋白質の理解し、多くの研究は、ホスト セルのエントリと融合3におけるその機構の役割を説明しています。この場合融合タンパク質の胸の谷間は、特定の順序または胸の谷間サイト HA、内および pH 依存性構造変化、ウイルス融合ペプチド1,2の露出の結果との併用で発生します。
融合ペプチドおよびその前のプロテアーゼ認識シーケンス病原性とウイルスの宿主適応のため重要です。プロテアーゼ認識シーケンスの変更は、大幅にウイルスのホスト4潜在的劇的な結果と胸の谷間を変更できます。一方で、胸の谷間を廃止し、ウイルスのライフ サイクルを排除することできます。しかし、その一方で、突然変異を特定プロテアーゼの基質特異性を増加したり、融合タンパク質を切断する「新しい」プロテアーゼを許可します。その後、これまた観察、例えば、インフルエンザ ウイルスのサブタイプ5,6細胞・組織親和性を拡張できます。通常低病原性鳥インフルエンザ (LPAI) ウイルスとほとんどの人間のインフルエンザ ウイルスは、それらをアクティブにするプロテアーゼの限定のローカリゼーションのため消化管や呼吸器管に限られています。通常、このような HA 蛋白質の膜融合ペプチド トリプシン様セリンプロテアーゼ トリプシン、matriptase または TMPRSS27,のように認識されているとは 1-2 非連続した塩基性アミノ酸で構成されています 4 アミノの酸シーケンス付加されて8します。 挿入または胸の谷間サイト多サイトに変更突然変異ウイルスを取得するとことができます風鈴 HA をアクティブにし、はるかに深刻な全身感染6,9を引き起こす可能性があります。これらのウイルスは、高病原性鳥インフルエンザ (HPAI)、h5n1 型株に代表されると呼ばれます。
インフルエンザ HA と対照をなして MERS コロナ ウイルスなど多くのコロナのスパイク蛋白質内の 2 つの明瞭な胸の谷間サイトがあります。S1/S2 サイト S2 と呼ばれる 2 番目の胸の谷間サイト C 末端融合領域 (S2) から N 末端受容体結合ドメイン (S1) で区切る ' 融合ペプチド10への近さで、S1/S2 サイトの下位。サイトが S1/S2 S2 の順で、順番に切断されることが示唆された」。ほとんどのインフルエンザ ウイルス、MERS コロナ ウイルス S タンパク質 S1/S2、S2 の HA と対照をなして ' サイトをするプロタンパク質転換 (PC) 家族、風鈴などのプロテアーゼによって認識できます。この家族のメンバーは、モチーフ R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2塩基性残基ペアで切断します。一般に、胸の谷間のサイトの上流アミノ酸はP1、P2、P3 などと呼ばれます。P1 に指定されている胸の谷間サイトとアミノ酸を下流から数えて '、P2'、P3'、等。11. FCoV 系統が単一またはデュアル胸の谷間サイトありますか。MERS コロナ ウイルスのようないくつかの FCoV 系統は、胸の谷間の 2 つのサイトをまた所有している (S1/S2 と S2') の S 蛋白質。しかし、この特徴は血清型を除く私の FCoVs (A クレードです)。対照的に、血清型 II (クレード B) グループのメンバーにのみシングル胸の谷間サイトがあります (S2')2,12。いくつかのプロテアーゼは、風鈴、トリプシン様プロテアーゼ カテプシンなど、月間 FCoV 胸の谷間サイトを切断して提案されています。それが、(として知られているネコ腸コロナ ウイルスまたは FECV) 腸の FCoV の S タンパク質が S1/S2 サイトの風鈴とこのサイトの突然変異によって裂かれる可能性が提案されている (同様 S2') プロテアーゼの要件の変更に 。これらの突然変異は親和性とウイルスが全身になるとマクロファージ トロピック (として知られているネコ伝染性腹膜炎ウイルスまたは FIPV)13、これらのウイルスの病原性の変化に関連付けられています。
ウイルスは当然各レプリケーション サイクル中に彼らのゲノムに突然変異を導入、頻繁に新しいサブタイプとインフルエンザ、MERS コロナ ウイルスと FCoV は説明14,,1516です。、新興ウイルスの公衆衛生上の脅威を評価するために迅速な評価の一環として、胸の谷間のサイトとどのようにこれらのウイルスを活性化プロテアーゼの範囲に影響を与える変更を調査するため重要です。ここでは、与えられたプロテアーゼと急速に画面のプロテアーゼ切断する機能のために基質特異性に影響を与える MERS コロナ ウイルス S タンパク質の胸の谷間のサイトの変更を非常に迅速に評価ができるペプチド ベースのアッセイについて述べる、与えられたまたは複数シーケンス4。実験の第二セットで、血清型 FCoV 別や系統風鈴切断活性を決定する手法を使いました。
この試金で使用されるペプチドは、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) ペア 7-メトキシクマリン-4-イル アセチル (MCA) N-2, 4-ジニトロフェニルアミン (DNP) C 末端と N 末端で変更されます。アッセイ中に MCA は、興奮して、ペアが互いに近くにある限り、DNP による焼入れは光のエネルギーを放出します。胸の谷間が発生した場合ただし、DNP はもう放出を抑制することができるないと蛍光プレート リーダーで読み取ることができます。ペプチド切断率を決定して、プロテアーゼ切断特異的ペプチド (として知られている Vmax)17速度を計算する実験中に蛍光の変化を測定します。
ペプチドを設計するためにそれぞれの融合蛋白質の遺伝子必要がありますシーケンスまたはされたデータベースで利用可能します。ただし、メソッドは、少ない労働強い、通常、胸の谷間を分析する哺乳類セルで表現する発現ベクターへの融合蛋白質遺伝子のクローニングを必要とする従来の方法よりも高価です。最初から最後まで、ペプチド、プロテアーゼがあり、すぐに 1 日の内でここに示すペプチド アッセイを行うことができます数週間まで数日かかることがありますこの。アッセイのセットアップは、サンプル数に応じて 5 〜 30 分間と蛍光プレート リーダーでランタイムは 1 時間データの分析は、サンプル サイズによって再び 2 h までをかかることがあります。
ここでは、分析を提示する 2 つの異なる例を選びました。最初の例では、我々 は人間の種の壁を越える場合にアクティブ化されるラクダの派生系統の潜在性を評価するために、人間とラクダ派生 MERS-コロナ ウイルスの風鈴を介した胸の谷間を比較データを提示します。2 番目の例では、S1/S2 と S2 の風鈴を介した胸の谷間を決定する蛍光ペプチド アッセイを使用 ' のサイトまたは S2' 2 つのサイト私は、2 つの血清型 II FCoV 株をそれぞれ血清型します。これらの実験は肯定的な制御としてトリプシン分裂を使用しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

コロナやインフルエンザ ウイルスなどエンベロープ ウイルスでは、宿主細胞に感染することができるため、融合蛋白質の蛋白質分解開裂を必要があります。多くの場合ウイルスは、細胞・組織親和性を展示し、特定の細胞や組織のプロテアーゼに適応しています。さらに、これらのウイルスは、胸の谷間に影響を与える可能性がありますし、新しいホストへの適応に貢献することができますレプリケーション中に突然変異または彼らのゲノムへの挿入を導入できます。ペプチド模倣ウイルス融合蛋白質の胸の谷間のサイトの迅速なスクリーニングを可能にする蛍光ペプチド胸の谷間の試金を紹介します。テクニックは非常に柔軟で、多くの異なる基板上に単一プロテアーゼのプロテアーゼ活性を調査する使用ことができます、さらに、ことも 1 つまたは複数のペプチド基板上に複数のプロテアーゼの活動の探査ができます。本研究では、コロナ ウイルス スパイク ・ プロテインの胸の谷間サイト モチーフを模倣したペプチドを使用しました。我々 は人間テストし、ラクダ派生中東呼吸器症候群コロナ (MERS CoV) 胸の谷間サイトのシングルとダブルの代用できる風鈴の活動を変えるし、開裂の効率を劇的に変えることを示す。バイオインフォマティクスとの組み合わせで、異なる血清型菌株から猫コロナ ウイルス スパイク蛋白質の風鈴胸の谷間アクティビティをテストするのにはこのメソッドを用いても。このペプチド ベースの方法はより少ない労働と時間のウイルスのプロテアーゼ活性の分析に使用する従来の方法よりも集中的な 1 日で結果が得られます。

この研究の最初の部分で S2 を表すペプチドを使用して ' 3 つの異なる MERS コロナ ウイルス S タンパク質の切断部位の: ラクダに派生する MERS コロナ、NRCE HKU205 (Genbank を原型 EMC/2012 人間ひずみ (Genbank AFS88936.1) から 2 つ選択AHL18090.1) と Mor215 (Genbank AVN89324.1) 系統、エジプトとモロッコ、それぞれ (表 1)16,18で分離されました。
HKU205 S2 EMC/2012 株に比べて ' 胸の谷間サイトに P1、P2 の 2 つの突然変異は、' 風鈴によってその認識に影響を与える可能性がありますと開裂の効率 (表 1) の変更の位置。さらに場合を調査する興味を持っていたし、HKU205 ひずみは、それぞれ個々 の突然変異が風鈴胸の谷間に影響を与えます。我々 は、したがって、個々 の置換が、EMC/2012 ペプチッド シーケンスに導入された 2 つのペプチドが含まれて (EMC/2012 牟田 S S2' と EMC/2012 mutS-私は S2') (表 1)。風鈴が 6.3 ± 1.2 の Vmax で効率的に EMC/2012 ペプチドを切断できた RFU/分、S2 を使用する場合、我々 はほとんどない胸の谷間を検出しながら ' HKU205 ひずみのペプチド (Vmax 0.5 ± 0.1 RFU/分) (図 1 a)。EMC/2012 牟田 S S2 を調査するとき ' ペプチド、我々 が強く、胸の谷間が減った野生型シーケンスと比較して (Vmax 3.6 ± 1 RFU/分)。EMC/2012 mutS をテストするときにほとんどない胸の谷間があった-私は S2' ペプチド (Vmax 1.1 ± 0.9 RFU/分) (図 1 a)。
最近では、西アフリカから MERS コロナ ウイルス分離株は、MERS コロナ ウイルスとは異なる系統にあるアラビア半島16を報告されました。最近、説明の分離の 1 つは S2 の P4 の位置にアルギニンの代わりにロイシンを運ぶ Mor213 ひずみ ' サイト (表 1) および潜在的風鈴によってその認識に影響を与えるし、開裂の効率を変えることができます。私たちペプチド アッセイのみ Mor213 S2 の最小限胸の谷間があることを示した「EMC/2012 サイト (図 1 b) と比較してサイト。Mor213 ペプチドの Vmax は 1.0 ± 0.1 です。
本研究の 2 番目の部分、FCoV S 蛋白質切断点の風鈴を介した胸の谷間を評価するのに同じペプチド アッセイを使用しました。血清型 FCoV 2 S1/S2 胸の谷間サイトを模倣したペプチドを用いて私ウイルス: FECV I と-4 (Whittaker 研究室) からと FIPV 黒色 (Genbank AB088223.1)。また、S2 を模倣したペプチドを使用 ' 2 つ FCoV 血清型 II と同様に、これらのウイルスのサイト: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) から FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) 系統 (表 1)。通常、風鈴胸の谷間は、塩基性残基 (アルギニンとリジン) に胸の谷間サイトの P1 および P4 の位置に存在する場合に発生します。変異 P1、P4 と P1' 風鈴裂、従って蛋白質のプロテアーゼ要件の変更と干渉する位置が示唆されました。(表 1)。風鈴胸の谷間も認めた原型 S1/S2 ペプチド FECV I と 4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/分) 変異 S1/S2 ペプチド FIPV ではなく私ブラック S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/分) (図 2 a)。同様に、風鈴は原型の S2 を切断できた ' ペプチド FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0.97 RFU/分)、変異 S2 ないしかし、' ペプチド FECV I と 4 S2' (Vmax 0.26 ± 0.11 RFU/分)、FIPV 私ブラック S2' (Vmax 0.30 ± 0.14 RFU/分) と FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0.11 RFU/分) (図 2 b)。我々 は、ペプチド胸の谷間の肯定的な制御としてトリプシンを使用し、すべてのペプチドが使用 (補足図 2) のトリプシン胸の谷間を見ました。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
テーブル 1。ペプチドに使用される、対応するアミノ酸配列。法で使用されるペプチドには (7-メトキシクマリン-4-イル) アセチル/2, 4-ジニトロフェニルアミン (MCA/DNP) フレット ペアが含まれます。P4 と P1 胸の谷間に配置サイト アルギニン (R) 残基、風鈴によって認識されるは、太字です。赤の残基は、参照シーケンスと比較して変異に対応します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> 図 1.人間とラクダの派生の MERS コロナ ウイルス S2 の風鈴を介した蛋白質分解開裂 ' 蛍光ペプチドをサイトします。A.風鈴胸の谷間アッセイ MERS コロナ ウイルス EMC/2012 S2 は人間の ' サイトとラクダ由来株 HKU205 (二重突然変異体)、EMC/2012 年の単一の突然変異亜種と一緒に (牟田 S と mutS-私)。B.風鈴胸の谷間アッセイ MERS コロナ ウイルス EMC/2012 S2 は人間の ' サイトとラクダから派生したひずみ Mor213。パネルAおよびBペプチドを添加して組換え風鈴とプロテアーゼによるプロセシングによる蛍光の増加は、蛍光光度計を用いて測定しました。法を 3 つの独立した実験から vmax 値の平均を表す結果トリプリケートで行った (n = 3)。誤差範囲を示す SD.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> 図 2.FCoV S1/S2 と S2 の風鈴を介した蛋白質分解開裂 ' 蛍光ペプチドをサイトします。A.風鈴胸の谷間の試金 FECV I と-4 の FIPV 私ブラック S1/S2 サイト。ペプチドは、遺伝子組換え風鈴を添加されました。B.風鈴胸の谷間アッセイ FECV I と-4、私は黒、FIPV FECV II 1683 と FIPV II 1146 S2 の ' のサイト。プロテアーゼによるプロセシングによる蛍光の増加は、蛍光光度計を用いて測定しました。法を 3 つの独立した実験から vmax 値の平均を表す結果トリプリケートで行った (n = 3)。誤差範囲を示す SD.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
図 1と図 2に使用される補足表 1: Vmax 値。算出した Vmax は、プロトコル セクション 4 で説明、補足図 1に示すようにグラフ化します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: raw データの図はプレート リーダー ソフトウェアから派生します。蛍光、Vmax の定量に使用された時間のグラフ上の増加。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 2: FCoV S1/S2 と S2 のトリプシンを介した蛋白質分解開裂 ' 蛍光ペプチドをサイトします。トリプシン分裂はマイク ブラック S1/S2 サイト FECV I と-4 と FIPV のアッセイと FECV I と-4、私は黒、FIPV FECV II 1683 と FIPV II 1146 S2' のサイト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

ウイルス融合ペプチドの胸の谷間のサイトを表すペプチドのプロテアーゼのプロテアーゼ活性の迅速なスクリーニングを可能にする蛍光ペプチド胸の谷間の試金を提案します。このメソッドは、プロテアーゼ活性をテストする蛋白質シーケンス内で他のアミノ酸モチーフにも使用できます。

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

この方法は、タンパク質のタンパク質分解修飾、阻害剤、プロテアーゼおよびペプチダーゼの特性化など、生化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ペプチドに対するプロテアーゼのタンパク質分解活性を迅速にスクリーニングし、所与のタンパク質の切断側を表す点である。ここでの使用は、ウイルス融合を活性化するプロテアーゼを研究することです。ペプチド設計の第一歩は、NCBIやウイルス病原体データベースなどの公的データベースから目的の融合タンパク質の配列を取得することです。融合ペプチドを進めるプロテアーゼ認識部位を選択し、この配列の上流および下流に2〜3個のアミノ酸を含む。ペプチドをオーダーする場合、蛍光共鳴エネルギー移動またはFRET対、末端のマカ、c末端のDnpで修飾する。アッセイの間、Mcaは興奮し、ペアが互いに近くにある限り、Dnpによって消光される光エネルギーを放出する。しかし、切断が発生した場合、Dnpは蛍光プレートリーダーによって読み取ることができる発光をクエンチすることができない。製造業者の推奨に従って、上下に軽くピペットを入れ替えることによって、ペプチドを再懸濁します。例えば、70%エタノール中で1ミリモルの最終濃度に再懸濁する。ペプチドがピペット処理によってあまりよく再懸濁しない場合は、完全に再懸濁されるまで、ペプチドと溶媒を含むチューブを超音波浴中に入れる。ペプチドの100マイクロリットルのアリコートを光減衰または耐性チューブに分配し、ペプチドを漂白から保護します。アリコートをマイナス20度で保管してください。この手順を開始するには、プレート リーダーの電源を入れ、セルフ テストが終了するまで待ちます。次に、接続されているコンピュータでオペレーティングソフトウェアを開き、プレートリーダーに接続されていることを確認します。温度設定を開き、必要な温度に設定して、プロテアーゼ(摂氏30度)を最適にする場合は、この場合に使用してください。実験をセットアップするには、制御器のセットアップをクリックし、運動を選択して蛍光を選択します。励起波長330ナノメートル、発光波長390ナノメートルを入力します。自動カットオフの選択を解除し、中/通常の感度を選択します。アッセイの実行時間を1時間選択し、60秒ごとに1つの測定値を選択します。最初の測定の前に5秒間、各測定の3秒前に混合を設定します。最後に、読み取る井戸を選択します。テキストプロトコルに記載されているように、プロテアーゼに適したアッセイバッファーを準備し、氷上のバッファーを冷やします。冷却と安定性を支えるために、氷の上に固体黒いポリスチレン非処理フラットボトム96ウェルプレートを下に薄い金属板を置きます。隣接するウェルからの蛍光漏れを防ぐためには、アッセイプレートとして黒板を使用することが不可欠です。ペプチドごとに、アッセイあたり3つの技術的複製を調製し、サンプルあたり100マイクロリットルの合計体積を調製する。アッセイプレートの各ウェルに適量のアッセイバッファーをピペットする。各ウェルに0.5マイクロリットルのプロテアーゼを加えます。6つのウェルに、それぞれのプロテアーゼの代わりに0.5マイクロリットルのバッファーを加えます。これらのうちの3つはブラインドコントロールであり、他の3つはペプチドコントロールになります。5マイクロリットルのペプチドを各ウェルに50マイクロモルの最終濃度に加えます( ブラインドコントロールを除く)。3つのブラインドコントロールウェルのそれぞれに、ペプチドの代わりに5マイクロリットルのバッファーを加えます。プレートを小麦粉プレートリーダーに挿入し、[開始]をクリックします。データ分析を開始する前に、実験ファイルを保存します。エクスポートをクリックし、ファイルを txt としてエクスポートします。txt ファイルをスプレッドシートにインポートします。分析を開始するには、グラフを作成し、サンプルごとの技術反復ごとに、Y軸上の相対的な蛍光単位をx軸上の時間に対してプロットします。グラフが線形範囲にあるデータ範囲を選択し、蛍光の開始に最も近い値を選択します。選択したデータを 2 番目のグラフにプロットし、線形傾向線を追加します。傾向線のオプションで、チャート上の数式を表示するを選択します。方程式は、トレンドラインの傾きに対応するV maxを示します。3 つの技術反復から各サンプルの平均 V max を計算します。実験を2回以上繰り返した後、3つの生物学的複製物を得て、3つの独立した生物学的複製からのデータに基づいて標準偏差を算出する。ヒトMERSコロナウイルス、EMC/2012 S2プライムサイト、ラクダ由来の二重変異株HKU205のフリン切断アッセイは、EMC/2012の単一突然変異変異体変異体と共に、EMC/2012ペプチドが効率的に切断されたことを明らかにしたが、HKU205のS2プライムペプチドの切断はほとんど起こらなかった。EMC/2012 A-S変異S2プライムペプチドの切断は大幅に減少し、EMC/2012 SからIに変異したS2プライムペプチドの切断はほとんどなかった。別のフリン切断アッセイは、ラクダ由来のモロッコ213 S2プライムサイトの最小切断のみを示し、ヒトMERSコロナウイルス、EMC/2012 S2プライムサイトと比較した。プロトタイプS1/S2ペプチド、FECV Iおよび4 S1/S2についてはフリン切断が認められたが、変異したS1/S2ペプチド、FIPV IブラックS1/S2では観察されなかった。同様に、フリンは原型S2プライムペプチドを切断することができたが、FECV II 1683 S2プライムは、変異したS2プライムペプチドではなく、FECV Iおよび4 S2プライム、FIPV IブラックS2プライム、およびFIPV II 1146 S2プライムである。この手順に従って、ウェスタンブロット分析またはアミノ蛍光アッセイは、目的の全長タンパク質を使用してタンパク質切断を検証し、この場合、切断がウイルス融合タンパク質のフソジェニックバージョンをもたらす場合に行うことができる。

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ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーションコロナウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化