Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
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Financiamento da investigação para o projeto MERS apresentado neste manuscrito foi fornecido pelo NIH grant R21 AI111085. O estudo de coronavirus felino foi apoiado por bolsas de investigação da Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation e do centro de saúde de felino de Cornell. Gostaríamos também de agradecer Malik Peiris para fornecer-nos com Mor213 sequência antes que fosse acessível ao público.

1. projetar e preparar os peptídeos
<ol><li>Adquira a sequência da proteína de fusão de interesse de um público de banco de dados tais como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou o banco de dados do patógeno de vírus (https://www.viprbrc.org). Escolher o local de reconhecimento de protease precede o peptídeo de fusão e incluir 2-3 aminoácidos a montante e a jusante da sequência.</li>
	<li>Quando encomendar os peptídeos, modificá-los com o acetil de 7-Metoxicumarina-4-yl FRET par (MCA) na extremidade N-terminal e N-2,4-dinitrophenyl (DNP) no C-terminal. Nota: Vários fornecedores fornecem essas modificações. Preço e tempo de entrega dependem do fornecedor de escolha. No entanto, modificações alternativas existem que variam em sensibilidade e exigir ajustes do leitor em termos de comprimentos de onda.</li>
	<li>Ressuspender o peptídeo de acordo com as recomendações dos fabricantes suavemente pipetando acima e para baixo. Por exemplo, resuspenda peptídeos em etanol a 70% para a concentração final de 1 mM.</li>
	<li>Opcionalmente, adicione o tubo contendo o peptídeo e o solvente em um banho de sonication até que ele é totalmente resuspended se o peptídeo não Ressuspender muito bem por pipetagem.</li>
	<li>Alíquota do peptídeo em luz de umedecimento ou resistente tubos para proteger o peptídeo de branqueamento. Manter a alíquotas tamanhos pequenos para evitar vários ciclos de congelamento/descongelamento (por exemplo, 100 µ l). Loja alíquotas a-20 ° C.</li>
</ol>2. preparar o leitor de placa de fluorescência
<ol><li>Ligue o leitor de placa e esperar terminar o autoteste.</li>
	<li>Abra o software operacional no computador anexado e certifique-se que está relacionado com o leitor.</li>
	<li>Abra o ajuste da temperatura e defina a 30 ° C (ou a temperatura necessária para um desempenho ideal para o protease).</li>
	<li>Clique no controle de | Configuração do instrumento para configurar o experimento.</li>
	<li>Escolha a cinética.</li>
	<li>Selecione a fluorescência.</li>
	<li>Insira a excitação e emissão de comprimentos de onda: 330 nm e 390 nm respectivamente.</li>
	<li>Cancelar a seleção automática de corte.</li>
	<li>Selecione a sensibilidade média, normal.</li>
	<li>Escolher uma duração de 1h para o ensaio e selecione uma medição a cada 60 s.</li>
	<li>Conjunto de 5 s mistura antes da primeira medição e 3 s antes de cada medição</li>
	<li>Selecione poços para ler e começar o ensaio.</li>
</ol>3. preparação do ensaio
<ol><li>Prepare o buffer de ensaio, calcular as quantidades adequadas para cada ingrediente e adicioná-lo. Para furina, fazer reserva consistindo de 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1mm 2-Mercaptoetanol, 5% Triton X-100. Por tripsina, use tamponado de fosfato padrão fisiológico (PBS). Nota: Os Volumes de 10 mL ou menos são suficientes. Dependendo do protease(s) utilizado no ensaio de buffer varia.</li>
	<li>Acalme o buffer no gelo.</li>
	<li>Coloque a placa de ensaio no gelo com uma placa de metal fina por baixo para resfriamento de suporte e estabilidade. Uso um sólido preto placa poliestireno de 96 poços com um fundo plano e não-tratados. Nota: É essencial usar pretas placas para evitar fluorescente "fugas" de poços adjacentes.</li>
	<li>Calcule a quantidade adequada de protease para adicionar para cada reação com base nos dados experimentais ou publicações anteriores. Para furina, use 1 unidade por reação, que corresponde a 0,5 µ l. Por tripsina, use 0,5 µ l de tripsina TPCK 160 nM.</li>
	<li>Por exemplo, prepare-se 3 repetições técnicas por ensaio em um volume total de 100 µ l por amostra. Nota: Ele foi avaliado experimentalmente que não faz diferença se a pipetagem é realizado sob condições de luz normais ou esmaecido luz. No entanto, os peptídeos não devem ser expostos à luz por um período prolongado de tempo.</li>
	<li>Pipete a quantidade adequada de buffer de ensaio (94,5 µ l como descrito no passo 3.1) para cada poço.</li>
	<li>Adicione a protease a cada poço. Para tanto, furina e tripsina TPCK, use 0,5 µ l por amostra. 6 poços (3 poços para um controle em branco) e 3 poços para um controle de peptídeo, adicione o buffer de 0.5 µ l em vez das respectiva protease.</li>
	<li>Adicione o peptídeo para uma concentração final de 50 µM a cada poço exceto o controle em branco. Neste caso, pipete 5 peptídeo µ l, preparada como descrito no passo 1.3. Adicione 5 µ l de tampão para o controle em branco em vez de peptídeo. Nota: Várias concentrações do peptide foram inicialmente testadas com as concentrações de enzima descrito para garantir que as enzimas foram saturadas.</li>
	<li>Insira a placa para o leitor de placa de fluorescência e clique em Iniciar.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Salve o arquivo do experimento.</li>
	<li>Clique em Exportar e exportar o arquivo como um. txt.</li>
	<li>Importe o arquivo. txt em uma planilha.</li>
	<li>Para cada técnica replicar, por exemplo, crie um gráfico, plotando as unidades fluorescentes relativas (RFU) no eixo y contra o tempo no eixo x (Supplemental Figura 1).</li>
	<li>Selecione o intervalo de dados onde o gráfico está em uma escala linear e o mais próximo para o início do aumento da fluorescência.</li>
	<li>Plotar os dados selecionados em um segundo gráfico e adicionar uma linha de tendência linear.</li>
	<li>Selecione as opções de linha de tendência equação de Display gráfico. A equação mostrará o Vmax.</li>
	<li>Calcule que média Vmax para cada amostra de técnicas a 3 repetições.</li>
	<li>Repeti o experimento mais duas vezes para obter 3 repetições biológicas.</li>
	<li>Calcule o desvio padrão baseado nos dados do biológico independente 3 repetições.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos aqui um ensaio de peptídeo de fluorogenic que permite para uma rápida exibição de sequências de proteínas por sua clivagem proteolítica por proteases. Em nosso primeiro exemplo escolhemos clivagem diferente motivos local da proteína MERS-CoV espiga (S) para ilustrar uma aplicação para este ensaio. Vários envolto de vírus que possuem classe fusão proteínas como MERS-CoV, SARS-CoV (síndrome respiratória aguda grave) e a gripe são grandes preocupações para a saúde pública e novos subtipos estão em constante evolução que tenho um potencial para cruzar espécies barreiras de seus hospedeiros naturais para os seres humanos1,15,16. Isolar os vírus e cultivando-os em laboratório podem não ser sempre viáveis ou requer laboratórios especiais que não estão disponíveis em todas as instalações de pesquisa. Portanto, há uma necessidade de métodos para avaliar a ameaça potencial de saúde pública de vírus emergentes que podem ser conduzidas em condições laboratoriais regulares. Além de vírus visando os humanos, alguns vírus animais como FCoV também possuem a mesma classe I proteínas da fusão, portanto, partilha as características similares do que suas contrapartes humanas. Isolar esses vírus também pode ser um desafio, tornando a utilização de ferramentas inovadoras para estudá-los, se necessário.
Um passo crucial no ciclo de vida dos vírus acima mencionados é a entrada da pilha de anfitrião e fusão mediada pelo processamento proteolítica da proteína respectiva fusão por host proteases1,2. Uma maneira padrão para investigar esta parte do ciclo de vida viral é clonar o gene da proteína de fusão em um vetor de expressão dos mamíferos, transfect células de mamíferos que permitem a expressão da proteína, incubam ou co transfect com a protease de interesse, isolar a proteína e realizar uma análise ocidental do borrão. Este método vem com várias limitações: disponibilidade de DNA/RNA viral para a clonagem, os custos para sintetizar o gene se nenhum DNA ou RNA está disponível, a disponibilidade de um anticorpo para detectar a proteína de fusão e seus produtos de clivagem e pode demorar até vários semanas, até que é realizado o estudo inteiro. Torna-se ainda mais demorado, dinheiro e trabalho intensivo, se o interesse do estudo é investigar várias mutações no site do decote, porque requer mutagenesis local-dirigido. O ensaio de peptídeo fluorogenic que descrevemos aqui não tem essas limitações. Os peptídeos de interesse podem ser projetados com base em sequências publicamente disponíveis, existem vários fornecedores que fornecem uma vasta gama de proteases recombinantes que são relevantes para estes tipos de estudos e o ensaio, incluindo a análise pode ser realizado dentro de um único dia.
No nosso exemplo, nós examinamos mediada por furina clivagem de S2' local de reconhecimento de protease da proteína S MERS-CoV derivado de seres humanos e camelos do Egito e Marrocos. Tanto o humano EMC/2012 e o camelo HKU205 S2' sites contêm um motivo de clivagem furina RXXR típico. No entanto, de acordo com a clivagem de PiTou 2.0 marcando o algoritmo HKU205 S2' local não está previsto para ser clivada por furina, que nós experimentalmente confirmado19. A razão por que HKU5 S2' não é processado pelo furina pode ser devido a isoleucina no P1' posição. Quando testamos dois peptídeos que carregava as mutações individuais em S2 o EMC/2012 ' sequência, fomos capazes de confirmar que a isoleucina no P1' largamente revoga clivagem, Considerando que a alanina para substituição de serina resultou no decote reduzido. O Mor213 S2' local não contiver um motivo de clivagem furina e não foi surpreendente para detectar quase sem clivagem. Também examinamos como furina cliva o S1/S2 e S2' sites de reconhecimento protease da proteína FCoV S. Fomos capazes de observar furina clivagem de ambos os peptídeos FECV (FECV I e-4 S1/S2 e S2 FECV II 1683'), enquanto o mutantes sequências de vírus FIPV não foram clivadas por furina.
Ao comparar clivagem furina-mediada da EMC/2012 S2' peptídeo (figura 1A) com os peptídeos FECV I e-4 S1/2 (Figura 2A), descobrimos que havia uma 26-fold diferença aproximada no Vmax. Isso pode ser explicado por motivo de clivagem de furina em ambas as sequências (tabela 1). Enquanto o requisito mínimo para furina clivagem é um motivo RXXR, uma sequência RXRR é muito mais favorável2. Portanto, a EMC/2012 S2' peptídeo, que tem um motivo RSAR, é clivado com menor especificidade em comparação com o peptídeo FECV I e-4 S1/2 que contém uma RSRR clivagem furina (tabela 1).
No entanto, uma limitação importante do ensaio é que os peptídeos não refletem a estrutura terciária da proteína em que geralmente estão inseridos. Clivagem da proteína de fusão do comprimento total expõe o peptídeo de fusão e gatilhos hospedam a célula de entrada1. A interação entre a proteína protease e fusão também pode ser afetada pela estrutura terciária da proteína de fusão enquanto assumimos que os peptídeos são mais ou menos lineares. Daí, detectada no ensaio de peptídeo de clivagem pode ser artificial e pode não refletir a situação na vivo . Isto foi relatado para a segmentação da gripe H3N2 HA subtipo por matriptase. Enquanto vários grupos descritos clivagem do H3N2 HA por matriptase em ensaios de peptídeo, também foi mostrado que incubação do comprimento total H3N2 HA proteína e matriptase na cultura de pilha não resultou em uma fusogenic HA proteína4,20, 21. Existem outros exemplos que mostram que o Regulamento biologicamente importante da clivagem proteolítica é no nível da conformação da proteína. Tem sido descrito que proteínas da fusão às vezes precisam de uma série de eventos pre-fusão para poderes expor os sítios de clivagem após a fusão. A proteína de fusão de vírus Semliki Forest, por exemplo, requer rearranjos estruturais durante um número de eventos prefusion para expor sua proteína de fusão e torná-lo disponível para ativação proteolítica22. Portanto, os resultados obtidos em um ensaio de peptídeo fluorogenic precisam ser validado pela célula fusão ensaios ou experiências semelhantes. No entanto, o ensaio de peptídeo ainda permite um rastreio rápido de várias combinações de protease/peptídeo e para reduzir o trabalho e o tempo de acompanhamento de experiências, desde que as combinações que não mostram a clivagem são muito prováveis que apresentam o mesmo resultado na vivo.
A segunda grande limitação do ensaio diz respeito as proteases. Até agora só é possível testar proteases solúveis mas não transmembranares proteases. Dependendo da intenção do experimento, isto pode ser um problema. Por exemplo, tem gripe é ativadas por uma série de proteases do transmembrane localizado em membranas celulares8. Em certa medida, este problema pode ser contornado usando os domínios ativos proteolíticas solúveis, mas os resultados têm de ser interpretados com precaução e devem ser validados com métodos convencionais. Nós queremos referir o exemplo referida com matriptase e sua atividade no sentido H3N2 HA. Na vivo matriptase situa-se na membrana celular, mas a enzima comercialmente disponível é o domínio catalítico solúvel. Conforme discutido em relação as proteínas de fusão, é possível que ele também requer a protease completo para interagir com o substrato de proteína completos para obter clivagem e que testes somente domínios único podem resultar em falsos positivos.
Esta metodologia tem demonstrado ser eficiente para estudar a clivagem de sequências específicas de aminoácidos por furina. No entanto, as aplicações de extensões técnica para qualquer protease disponível (por exemplo, cathepsins, proprotein convertase), tornando-se um método útil para candidatos de peptídeo de tela para a segmentação de protease. Além disso, ficou demonstrado que este ensaio também pode ser usado para testar a eficácia dos inibidores de protease e, portanto, fornece uma rápida e fácil de ferramenta a tela proteína inibidores23.
O ensaio de clivagem de peptídeo fluorogenic descrito aqui representa uma adição à clivagem de bioinformatic marcando algoritmos, que prevê a clivagem do péptido por uma protease determinada, com base nas propriedades do ácido aminado e sequência. Estas duas técnicas, em combinação com técnicas de mancha ocidental de tradição podem ser usadas como um método eficiente para estudar protease clivagem em vitro.

Fusão viral com a membrana da célula do hospedeiro é um passo crucial no ciclo de vida do vírus envelopadas e facilita a entrada dentro da célula e a replicação do vírus. Normalmente, os vírus possuem uma proteína especializada (ou proteínas) que se liga aos receptores na membrana da célula do hospedeiro e aciona o vírus-célula membrana fusão1. Proteínas de fusão viral foram agrupadas em três classes principais (I-III)1. Um número de vírus que estão atualmente uma grande preocupação para a saúde pública, tais como o vírus da gripe (representando um longo zoonótico surgimento de aves) e síndrome respiratória Oriente-coronavirus (MERS-CoV) (representando uma recente zoonóticos surgimento de camelos), utilizam os chamados classe I proteínas da fusão, que exigem processamento proteolítica por proteases de acolhimento, para exercer a sua actividade de fusogenic2. Da mesma forma, o coronavírus felinos (FCoV), que representa uma ameaça das principais doenças de gatos selvagens e domésticos, também possuem uma classe proteína da fusão. Classe I fusão viral proteínas normalmente são sintetizadas como um precursor de uncleaved e geralmente consistem em dois domínios que são responsáveis pelo receptor de vinculação e acionando o evento de fusão respectivamente. Até à data, a hemaglutinina de gripe (HA) é o melhor entendida a proteína de fusão e numerosos estudos descreveram seu papel mecanicista na célula entrada e fusão do hospedeiro3. Neste caso a clivagem da proteína de fusão ocorre em uma sequência específica ou local de clivagem dentro HA e em combinação com mudanças conformacionais dependente do pH, os resultados da exposição da fusão viral do peptide1,2.
O peptídeo de fusão e sua sequência de reconhecimento anterior protease são críticos para a patogenicidade e a adaptação do hospedeiro do vírus. Alterações na sequência do reconhecimento de protease podem alterar a clivagem significativamente com consequências potencialmente dramáticas para o vírus e o hospedeiro4. Por um lado, pode revogar a clivagem e, assim, eliminar o ciclo de vida do vírus. Mas por outro lado, uma mutação pode aumentar a especificidade de substrato para uma determinada protease ou permitir que um "nova" protease clivar a proteína de fusão. Posteriormente, este também pode expandir o tropismo celular e tecidos, como observado, por exemplo, com65,os subtipos do vírus da gripe. Geralmente baixo o vírus de patogenicidade (GABP) a gripe aviária e vírus de gripe mais humanos estão confinados ao trato respiratório ou gastrointestinal devido a localização limitada das proteases que ativá-los. Normalmente, o peptídeo de fusão de tais proteínas HA é precedido por uma sequência ácida 4-amino que consiste de 1-2 não-consecutivos aminoácidos básicos, que é reconhecida pela tripsina Serina proteases como tripsina, matriptase ou TMPRSS27, 8. quando o vírus adquire inserções ou mutações que alteram o local de clivagem para um site polibásicos, permite furina para ativar o HA e potencialmente causar um muito mais grave infecção sistêmica6,9. Esses vírus são denominados vírus de gripe aviária de alta patogenicidade (GAAP), caracterizada por cepas H5N1.
Em contraste com gripe HA, coronavírus muitos, tais como MERS-CoV, tem dois sites de clivagem distinta dentro de sua proteína de spike. O site S1/S2 separa o domínio de ligação do receptor de N-terminal (S1) do domínio C-terminal de fusão (S2), com um segundo local de clivagem, chamado S2', a jusante do site S1/S2, em proximidade com o peptídeo de fusão10. Foi sugerido que os sites são clivados sequencialmente, em seguido por S2 S1/S2 '. Em contraste com o HA da maioria das cepas de vírus da gripe, a proteína S MERS-CoV S1/S2 e S2' sites podem ser reconhecidos por proteases da família proprotein convertase (PC), tais como furina. Membros desta família cleave em resíduos básicos emparelhados com o motivo R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Geralmente, os aminoácidos montante do site clivagem são referidos como P1, P2, P3, etc. contando a partir do local de clivagem e os aminoácidos a jusante são designados como P1', P2', P3', etc. 11. FCoV estirpes ou podem ter um único ou um local de clivagem dual. Como MERS-CoV, algumas cepas de FCoV também possuem dois sítios de clivagem (S1/S2 e S2') em sua proteína S. No entanto, essa característica é exclusiva de sorotipo eu FCoVs (clado A). Em contraste, membros do sorotipo II (clado B) agrupamento apenas tem um site único clivagem (S2')2,12. Várias proteases têm sido sugeridos para decompor os locais de clivagem de FCoV, incluindo furina, tripsina proteases e catepsina. Tem sido proposto que a proteína S de FCoV entérica (também conhecida como felina do coronavirus entérico ou FECV) é susceptível de ser clivada por furina no site S1/S2 e mutações neste site (bem como na S2') leva a mudanças nos requisitos de protease. Estas mutações têm sido associadas com mudanças no tropismo e patogenicidade desses vírus, permitindo que o vírus se tornar sistêmica e macrófago-Trópico (peritonite infecciosa felina também conhecido como vírus ou FIPV)13.
Vírus naturalmente introduzir mutações em seus genomas durante cada ciclo de replicação e frequentemente novos subtipos e cepas de influenza, MERS-CoV e FCoV são descritos14,15,16. Como parte de uma avaliação rápida para avaliar a ameaça de saúde pública de vírus emergentes, é fundamental para investigar mudanças no local de clivagem e como isso afeta o intervalo de proteases ativando estes vírus. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em peptídeo que permite uma avaliação muito rápida de como as mudanças de local de clivagem na proteína S MERS-CoV afetam a especificidade de substrato de uma determinada protease e a tela rapidamente várias proteases por sua capacidade de decompor um determinado ou várias sequências de4. Em um segundo conjunto de experimentos, usamos a técnica para determinar a atividade de clivagem furina mais estirpes e diferentes sorotipos de FCoV.
Os peptídeos utilizados neste ensaio são modificados com o par de transferência (FRET) de energia de ressonância fluorescência, 7-Metoxicumarina-4-yl acetil (MCA) na extremidade N-terminal e N-2,4-dinitrophenyl (DNP) no C-terminal. Durante o ensaio, a MCA é animado e emite energia luminosa que é saciada pela DNP, enquanto o par está nas proximidades, um com o outro. Se clivagem ocorre, no entanto, DNP não é capaz de saciar a emissão mais e ele pode ser lido pelo leitor de placa de fluorescência. As alterações na fluorescência é medida durante o experimento para determinar a taxa de clivagem de peptídeos e para calcular a velocidade na qual a protease cliva o peptídeo específico (também conhecido como Vmax)17.
A fim de projetar os peptídeos, o gene da proteína respectiva fusão deve tenham sido sequenciado e disponibilizado em um banco de dados. No entanto, o método é menos trabalho intenso e dispendioso do que métodos convencionais, que geralmente requerem a clonagem do gene da proteína de fusão em vetores de expressão de expressá-las em células de mamíferos, para analisar a clivagem. Do início ao fim, isto pode demorar vários dias até algumas semanas enquanto os ensaios de peptídeo apresentados aqui podem ser feitos dentro de um dia, assim como peptídeos e proteases estão disponíveis. A instalação do ensaio leva entre 5 e 30 min, dependendo do número de amostras e o tempo de execução no leitor de placa de fluorescência é 1 h. análise dos dados pode levar até 2 h novamente, dependendo do tamanho da amostra.
Aqui, nós escolhemos dois exemplos diferentes para apresentar o ensaio. No primeiro exemplo, apresentamos dados que compara a clivagem mediada por furina dos humanos e camelo-derivado MERS-COVs, para avaliar o potencial das estirpes camelo-derivado de sendo ativado em humanos se cruzam a barreira da espécie. No segundo exemplo, usamos um ensaio de peptídeo fluorogenic para determinar a clivagem furina-mediada da S1/S2 e S2' sites ou S2' local de dois sorotipo I e cepas de dois sorotipo II FCoV, respectivamente. Para estas experiências, clivagem de tripsina foi utilizado como controle positivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

Vírus envelopadas como coronavírus ou gripe vírus requerem clivagem proteolítica de sua proteína de fusão para ser capaz de infectar a célula hospedeira. Muitas vezes o vírus apresentam tropismo celular e tecido e é adaptado a proteases específicas de célula ou tecido. Além disso, estes vírus podem apresentar mutações ou inserções em seu genoma durante a replicação que pode afetar o decote e assim pode contribuir para adaptações para um novo hospedeiro. Aqui, apresentamos um ensaio de clivagem de peptídeo fluorogenic que permite a exibição rápida de peptídeos imitando o local de clivagem de proteínas da fusão viral. A técnica é muito flexível e pode ser usada para investigar a atividade proteolítica de uma protease única em muitos substratos diferentes, e além disso, também permite a exploração da atividade de proteases múltiplos em um ou mais substratos de peptídeo. Neste estudo, nós usamos peptídeos imitando os motivos de sítio de clivagem da proteína coronavirus spike. Nós testamos humana e camelo derivada síndrome respiratória Oriente coronavírus (CoV-MERS) para demonstrar que duplos e substituições no local clivagem podem alterar a atividade de furina e mudar drasticamente a eficiência de clivagem. Também usamos este método em combinação com bioinformática para testar furina atividade de clivagem das proteínas de spike coronavirus felino de diferentes sorotipos e estirpes. Este método baseado em peptídeo é menos trabalho e tempo intensivo do que os métodos convencionais utilizados para a análise da atividade proteolítica de vírus, e os resultados podem ser obtidos dentro de um único dia.

Na primeira parte deste estudo, nós usamos peptídeos que representam o S2' local de clivagem de proteínas de MERS-CoV S três distintas: da estirpe humana prototípica EMC/2012 (Genbank AFS88936.1) e de dois selecionados camelo-derivado MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) e Mor215 (Genbank AVN89324.1) cepas, isoladas em Egipto e Marrocos, respectivamente (tabela 1)16,18.
Em comparação com a estirpe EMC/2012, o HKU205 S2' local de clivagem tem duas mutações na P1 e P2' posições que poderiam potencialmente impactar seu reconhecimento por furina e alterar a eficiência de clivagem (tabela 1). Além disso, estávamos interessados investigar se e como cada mutação individual encontrada na estirpe HKU205 afeta furina clivagem. Estamos, portanto, incluídos dois peptídeos, onde as substituições individuais foram introduzidas a sequência do peptídeo EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' e mutS EMC/2012-eu S2') (tabela 1). Furina foi capaz de decompor o peptídeo EMC/2012 eficientemente com uma Vmax de 6,3 ± 1.2 RFU/min, enquanto não detectamos quase nenhum decote quando usando o S2' peptídeo da estirpe HKU205 (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Figura 1a). Ao investigar o EMC/2012 mutA-S S2' peptídeo, encontramos que a clivagem foi fortemente reduzida em comparação com a sequência de tipo selvagem (Vmax 3,6 ± 1 RFU/min). Não havia quase nenhum decote ao testar o mutS EMC/2012-eu S2' peptídeo (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (Figura 1a).
Recentemente, MERS-CoV isolados da África Ocidental foram relatados que são filogeneticamente distintos de MERS-CoV encontrados no Península Arábica16. Um dos isolados recentemente descritos é a tensão de Mor213, que carrega uma leucina em vez de uma arginina na posição P4 de S2' site (tabela 1), e que potencialmente poderia impactar seu reconhecimento por furina e alterar a eficiência de clivagem. Nosso ensaio de peptídeo mostrou que só existe clivagem mínima de Mor213 S2' local em comparação com o site da EMC/2012 (Figura 1b). O Vmax para o Mor213 peptide é 1,0 ± 0,1.
Para a segunda parte deste estudo, foi utilizado o mesmo ensaio de peptídeo avaliar clivagem mediada por furina dos sítios de clivagem da proteína FCoV S. Usamos peptídeos imitando o S1/S2 local de clivagem de duas FCoV serótipo eu vírus: FECV I e-4 (do laboratório de Whittaker) e FIPV eu preto (Genbank AB088223.1). Também usamos peptídeos imitando o S2' site destes vírus, bem como dois FCoV sorotipo II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) e estirpes FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (tabela 1). Normalmente, furina clivagem ocorre quando os resíduos básicos (arginina e lisina) estão presentes nas posições P1 e P4 do local de clivagem. Mutações no P4, P1 e P1' posições são sugeridas para interferir com furina cleavability, alterando, portanto, os requisitos de protease da proteína. (Tabela 1). Furina clivagem foi observada para o protótipo S1/S2 peptide FECV I e-4 S1/S2 (± 100.36 Vmax 7.61 RFU/min), mas não no mutante S1/S2 peptide FIPV eu preto S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1,29 RFU/min) (Figura 2A). Da mesma forma, furina foi capaz de decompor o protótipo S2' peptídeo FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0,97 RFU/min), mas não o mutante S2' peptídeos FECV I e-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV eu S2 Black' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) e FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / min) (Figura 2B). Usamos a tripsina como um controle positivo para a segmentação do peptide e observamos a clivagem de tripsina em todos os peptídeos utilizados (Supplemental Figura 2).
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
Tabela 1. Sequências de aminoácidos usados e correspondente de peptídeos. Os peptídeos utilizados em ensaios contêm o par FRET (MCA/DNP) acetil/2,4-dinitrophenyl (7-Metoxicumarina-4-yl). Os P4 e P1 clivagem local posicionado arginina (R) de resíduos, que são reconhecidos pelo furina, estão em negrito. Resíduos em vermelho correspondem a mutações em comparação com sequências de referência.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> Figura 1 . Mediada por furina clivagem proteolítica de humanos e camelo-derivado S2 MERS-CoV' sites fluorogenic peptídeos. R. ensaio de clivagem furina dos humanos MERS-CoV EMC/2012 S2' site e camelo-derivado estirpe HKU205 (duplo mutante), juntamente com única variantes mutantes de EMC/2012 (mutA-S e mutS-eu). B. ensaio de clivagem furina dos humanos MERS-CoV EMC/2012 S2' site e camelo-derivado estirpe Mor213. Para os painéis A e B, peptídeos foram incubados com furina recombinante e o aumento na fluorescência devido ao processamento proteolítica foi medido usando um dados. Os ensaios foram realizados em triplica com resultados que representam as médias de Vmax de três experimentos independentes (n = 3). Barras de erro indicam SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> Figura 2 . Mediada por furina clivagem proteolítica de FCoV S1/S2 e S2' sites peptídeos fluorogenic. R. furina clivagem do ensaio de FECV I e-4 e FIPV eu sites Black S1/S2. Peptídeos foram incubados com furina recombinante. B. ensaio de clivagem furina dos FECV I e-4, FIPV preto, FECV II 1683 e FIPV II 1146 S2' sites. O aumento na fluorescência devido ao processamento proteolítica foi medido usando um dados. Os ensaios foram realizados em triplica com resultados que representam as médias de Vmax de três experimentos independentes (n = 3). Barras de erro indicam SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
Suplementar tabela 1: Valores de Vmax usadas para Figura 1 e Figura 2. O Vmax valores foram calculados de gráficos conforme ilustrado na Figura 1 de suplementar e conforme descrito na seção 4 de protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementar Figura 1: ilustração dos dados brutos derivado do software de leitor de placa. Aumento da fluorescência sobre gráficos de tempo que foram utilizados para determinação da Vmax. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Suplementar Figura 2: clivagem proteolítica mediada por tripsina de FCoV S1/S2 e S2' sites peptídeos fluorogenic. Clivagem de tripsina ensaio de FECV I e-4 e FIPV sites Black S1/S2 e do FECV I e-4, FIPV preto, FECV II 1683 e FIPV II 1146 S2' sites. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Apresentamos um ensaio de clivagem de peptídeo de fluorogenic que permite uma análise rápida da atividade proteolítica de proteases em peptídeos que representa o local de clivagem de peptídeos de fusão viral. Esse método também pode ser usado em qualquer outro motivo de aminoácido dentro de uma sequência da proteína para testar a atividade da protease.

Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da bioquímica, como a modificação proteolítica das proteínas, bem como a caracterização de inibidores e proteases e peptidases. A principal vantagem dessa técnica é que permite uma rápida triagem da atividade proteolítica de proteases em peptídeos, representando o lado do decote da proteína dada. O uso aqui é estudar proteases que ativam a fusão viral.O primeiro passo no design de peptídeos é adquirir a sequência da proteína de fusão de interesse de um banco de dados público como o NCBI ou o banco de dados de patógenos de vírus. Escolha o local de reconhecimento protease que procede o peptídeo de fusão e inclua dois a três aminoácidos rio acima e rio abaixo desta sequência. Ao encomendar o peptídeo, modifique-o com a transferência de energia de ressonância fluorescência ou par DE FRET, Mca no final do terminus e Dnp no c terminus.Durante o ensaio, Mca está animado e emite energia leve que é saciada pelo Dnp enquanto o par estiver próximo um do outro. No entanto, se ocorrer o decote, o Dnp não será capaz de saciar a emissão que pode ser lida pelo leitor de placas de fluorescência. Resuspenque o peptídeo de acordo com as recomendações dos fabricantes, empinando suavemente para cima e para baixo.Por exemplo, resuspend em 70% de etanol para uma concentração final de um milimiliar. Se o peptídeo não se resuspensar muito bem por pipetação, coloque o tubo contendo o peptídeo e o solvente em um banho de sônica até que esteja totalmente resuspendido. Dispense 100 alíquotas de microliter do peptídeo em tubos leves ou resistentes para proteger o peptídeo do branqueamento.Armazene as alíquotas a menos 20 graus Celsius. Inicie este procedimento ligando o leitor da placa e esperando até que o autoteste seja concluído. Em seguida, abra o software operacional no computador conectado e certifique-se de que ele está conectado com o leitor de placas.Abra a configuração de temperatura e ajuste-a à temperatura necessária para um desempenho ideal para a protease, que é de 30 graus Celsius, neste caso. Para configurar o experimento, clique na configuração do instrumento de controle, escolha cinética e selecione fluorescência. Entre em um comprimento de onda de excitação de 330 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 390 nanômetros.Desmarque o corte automático e selecione sensibilidade média/normal. Escolha um tempo de execução de uma hora para o ensaio e selecione uma medição a cada 60 segundos. Coloque cinco segundos de mistura antes da primeira medição e três segundos antes de cada medição.Por fim, selecione os poços para ler. Prepare os buffers de ensaio apropriados para os proteases descritos no protocolo de texto e esfrie os buffers no gelo. Coloque uma placa de poliestireno preto sólido não tratada no fundo plano 96-well no gelo com uma fina placa metálica por baixo para suportar o resfriamento e a estabilidade.É essencial usar uma placa preta como a placa de ensaio, para evitar vazamentos fluorescentes de poços adjacentes. Por peptídeo, prepare três réplicas técnicas por ensaio, e um volume total de 100 microliters por amostra. Pipeta a quantidade apropriada de tampão de ensaio em cada poço da placa de ensaio.Adicione 0,5 microliters de protease a cada poço. A seis poços, adicione 0,5 microliters de tampão em vez da respectiva protease. Três deles serão controles cegos e os outros três serão controles de peptídeos.Adicione cinco microliters do peptídeo a uma concentração final de 50 micromolars a cada poço, exceto os controles cegos. Para cada um dos três poços de controle cegos, adicione cinco microliters de tampão em vez de peptídeo. Insira a placa no leitor de placas de farinha e clique em iniciar.Antes de iniciar a análise de dados, salve o arquivo de experimento. Clique na exportação e exporte o arquivo como um txt. Importe o arquivo txt em uma planilha.Inicie a análise criando um gráfico, plotando as unidades fluorescentes relativas no eixo y contra o tempo no eixo x para cada replicação técnica por amostra. Selecione o intervalo de dados onde o gráfico está em uma faixa linear, e o mais próximo do início da fluorescência aumenta. Plote os dados selecionados em um segundo gráfico e adicione uma linha de tendência linear.Nas opções de linha de tendência, selecione a equação de exibição no gráfico. A equação mostrará V max, que corresponde à inclinação da linha de tendência. Calcule a média v máxima para cada amostra a partir das três réplicas técnicas.Depois de repetir o experimento mais duas vezes, para obter três réplicas biológicas, calcule o desvio padrão com base nos dados das três réplicas biológicas independentes. Um ensaio de decote de furina do coronavírus MERS humano, o site principal da EMC/2012 S2 e a cepa dupla mutante HKU205, juntamente com variantes mutantes únicas da EMC/2012, revelaram que o peptídeo EMC/2012 foi eficientemente cortado, enquanto quase nenhum decote do peptídeo principal S2 de HKU205 ocorreu. O decote do peptídeo prime S2 mutado da EMC/2012 foi fortemente reduzido, e quase não houve decote do EMC/2012 S para i mutado peptídeo S2 prime.Outro ensaio de decote de furina mostrou apenas o decote mínimo do local principal do Marrocos 213 S2 derivado do camelo, em comparação com o coronavírus MERS humano, emc/2012 S2 local principal. O decote furin foi observado para o peptídeo prototípico S1/S2, FECV I e 4 S1/S2, mas não no peptídeo S1/S2 mutado, FIPV I Black S1/S2. Da mesma forma, furin foi capaz de cortar o peptídeo primo prototípico S2, FECV II 1683 S2 prime, mas não os peptídeos principais S2 mutados, FECV I e 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime, e FIPV II 1146 S2 prime.Após este procedimento, a análise da mancha ocidental ou ensaios de amino-fluorescência, utilizando a proteína de comprimento total de interesse pode ser realizada para verificar o decote proteico, ou neste caso, se o decote resultar em uma versão fusogênica da proteína de fusão viral.

Research

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Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...