Name: a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation
Uploaded: 2019-01-09T14:45:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation at JoVE.com

Financiación de la investigación para el proyecto de la TCM presentado en este manuscrito fue proporcionado por los NIH grant AI111085 R21. El estudio del coronavirus felino fue apoyado por becas de investigación de la Morris Animal Foundation, Fundación felina Winn y Cornell Feline Health Center. También nos gustaría agradecer a Malik Peiris por facilitarnos la secuencia de Mor213 antes de que sea públicamente accesible.

1. diseño y preparación de los péptidos
<ol><li>Adquirir la secuencia de la proteína de fusión del interés de una base de datos pública como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o la base de datos del patógeno de virus (https://www.viprbrc.org). Elegir el sitio de reconocimiento de proteasa anterior el péptido de fusión e incluyen 2-3 aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia.</li>
	<li>Al ordenar los péptidos, modificarlos con acetilo traste par 7-methoxycoumarin-4-yl (MCA) en el N-terminal y N-2, 4-dinitrofenilo (DNP) en el C-terminal. Nota: Hay varios proveedores que estas modificaciones. Precio y tiempo de entrega depende del proveedor de elección. Sin embargo, modificaciones alternativas existen que varían en sensibilidad y requieren ajustes del lector de la placa en términos de longitudes de onda.</li>
	<li>Resuspender el péptido según las recomendaciones del fabricante transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Por ejemplo, resuspender péptidos en etanol al 70% a la concentración final de 1 mM.</li>
	<li>Opcionalmente, añadir al tubo que contiene el péptido y el solvente en un baño de sonicación hasta que completamente se resuspendió si el péptido no suspender de nuevo muy bien por pipeteo.</li>
	<li>Alícuota el péptido en amortiguación ligera o resistente a los tubos para proteger el péptido de blanqueo. Mantener alícuotas tamaños pequeños para evitar ciclos de congelación/descongelación múltiples (por ejemplo, 100 μL). Almacenar en alícuotas a-20 ° C.</li>
</ol>2. preparar al lector de la placa de fluorescencia
<ol><li>Activar el lector de la placa y esperar hasta que termine la prueba automática.</li>
	<li>Abra el software operativo en el equipo adjunto y asegúrese de que está conectado con el lector de placas.</li>
	<li>Abrir el ajuste de temperatura y a 30 ° C (o la temperatura para un rendimiento óptimo de la proteasa).</li>
	<li>Haga clic en Control de | Instrumento de configuración de configurar el experimento.</li>
	<li>Elegir cinético.</li>
	<li>Seleccione de la fluorescencia.</li>
	<li>Entrar en longitudes de onda de excitación y emisión: 330 nm y 390 nm respectivamente.</li>
	<li>Deseleccionar el corte Auto.</li>
	<li>Seleccione sensibilidad medio, normal.</li>
	<li>Elegir un tiempo de 1 h para el análisis y seleccionar una medición cada 60 s.</li>
	<li>Sistema 5 s de mezcla antes de la primera medición y 3 s antes de cada medición</li>
	<li>Seleccionar pozos para leer y comenzar el ensayo.</li>
</ol>3. preparación del ensayo
<ol><li>Preparar el tampón de ensayo por calcular las cantidades apropiadas para cada ingrediente y agregarlo. Para furin, hacer buffer de 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-Mercaptoetanol, 5% Tritón X-100. Para la tripsina, uso estándar fosfato tampón salino (PBS). Nota: Volúmenes de 10 mL o menos son suficientes. El búfer varía dependiendo el protease(s) utilizado en el ensayo.</li>
	<li>Chill el buffer en el hielo.</li>
	<li>Coloque la placa de ensayo en el hielo con una placa delgada de metal debajo de refrigeración de apoyo y estabilidad. Uso un sólido negro placa poliestireno de 96 pocillos con fondo plano y no tratadas. Nota: Es imprescindible utilizar placas de negro para evitar "fugas" fluorescente de pozos adyacentes.</li>
	<li>Calcular la cantidad apropiada de proteasa a insertar para cada reacción basada en publicaciones anteriores o los datos experimentales. Para furin, usar 1 unidad por reacción que corresponde a 0,5 μl. Para la tripsina, utilizar 0,5 μl de la tripsina TPCK de 160 nM.</li>
	<li>Por ejemplo preparar 3 repeticiones técnicas por ensayo en un volumen total de 100 μl por muestra. Nota: Experimentalmente se evaluó que no hace una diferencia, pipetear se lleva a cabo bajo condiciones de luz normales o luz atenuaron. Sin embargo, los péptidos no deben estar expuestos a luz por un período prolongado de tiempo.</li>
	<li>Pipetear la cantidad apropiada de tampón de ensayo (94,5 μl según se describe en el paso 3.1) en cada pocillo.</li>
	<li>Añadir la proteasa a cada pocillo. Furin tanto tripsina TPCK, utilice 0,5 μl por muestra. A 6 pozos (3 pozos para un control en blanco) y 3 pozos para el control de un péptido, Añadir 0,5 μl de tampón en vez de la proteasa respectiva.</li>
	<li>Añadir el péptido a una concentración final de 50 μm a cada pocillo, excepto para el control en blanco. En este caso, tomar con pipeta 5 péptido μl preparado como se describe en el paso 1.3. Añadir 5 μl de buffer para el control en blanco en lugar de péptido. Nota: Inicialmente se probaron varias concentraciones del péptido con las concentraciones de enzima descrita para asegurar que las enzimas estaban saturadas.</li>
	<li>Inserte la placa en el lector de fluorescencia y haga clic en Inicio.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Guarde el archivo de experimento.</li>
	<li>Haga clic en exportar y exporte el archivo como un txt.</li>
	<li>Importar el archivo txt en una hoja de cálculo.</li>
	<li>Para cada repetición técnica por ejemplo, crear un gráfico trazado las unidades fluorescentes relativa (RFU) en el eje y el tiempo en el eje x (figura 1 complementaria).</li>
	<li>Seleccione el rango de datos donde la gráfica es una variedad lineal y el más cercano al comienzo del aumento de la fluorescencia.</li>
	<li>Parcela los datos seleccionados en un segundo gráfico y añadir una línea de tendencia lineal.</li>
	<li>Seleccione en las opciones de línea de tendencia ecuación Display gráfico. La ecuación muestra el Vmax.</li>
	<li>Calcular que la media Vmax para cada muestra de técnica de 3 repeticiones.</li>
	<li>Repetir el experimento dos veces más para obtener 3 repeticiones biológicas.</li>
	<li>Calcular la desviación estándar basándose en los datos del biológico independiente 3 repeticiones.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Virology. 479-480, 498-507 (2015).</li><li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+proteases:+Critical+determinants+of+coronavirus+tropism+and+pathogenesis.">Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis.</a> Virus Research. , (2014).</li><li>Hamilton, B. S., Whittaker, G. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos un análisis de péptidos fluorógenos que permite una rápida proyección de secuencias de la proteína para su clivaje proteolítico por proteasas. En nuestro primer ejemplo elegimos escote diferentes motivos de sitio de la proteína de la espiga (S) de MERS-CoV para ilustrar una aplicación para este ensayo. Varios envolvieron virus que poseen clase fusión proteínas como MERS-CoV, CoV-SRAS (síndrome respiratorio agudo severo) y la influenza son preocupaciones importantes para la salud pública y nuevos subtipos están en constante evolución tengo un potencial para cruzar especies barreras de sus anfitriones naturales a los seres humanos1,15,16. Aislar el virus y cultivar en el laboratorio no siempre pueden ser factibles o requiere laboratorios especiales que no están disponibles en cada centro de investigación. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos para evaluar la potencial amenaza de salud pública de virus emergentes que pueden llevarse a cabo bajo condiciones de laboratorio regulares. Además de los virus a los seres humanos, algunos virus animales como FCoV también poseen la misma clase I proteínas de fusión, por lo tanto, comparten las características similares a sus homólogos humanos. Aislamiento de estos virus también puede ser un desafío, haciendo necesario el uso de herramientas innovadoras para estudiarlos.
Un paso crucial en el ciclo de vida de los virus mencionados es entrada de la célula huésped y fusión mediada por procesamiento proteolítico de la proteína de fusión respectivos anfitrión proteasas1,2. Una manera estándar para investigar esta parte del ciclo de vida viral es clonar el gen de la proteína de fusión en un vector de expresión mamífero, transfectar las células mamíferas que permitan la expresión de la proteína, incuban o transfectar conjuntamente con la proteasa de interés, aislar el proteína y realizar un análisis de western blot. Este método viene con varias limitaciones: disponibilidad de ADN/ARN viral para la clonación, los costos para sintetizar el gen si no hay ADN o ARN está disponible, la disponibilidad de un anticuerpo para detectar la proteína de fusión y su producto de clivaje (s) y puede tomar hasta varios semanas hasta que se realiza todo el estudio. Incluso es más desperdiciador de tiempo, dinero y mano de obra si el interés del estudio es investigar varias mutaciones en el sitio de la hendidura porque requiere mutagénesis sitio-dirigida. El ensayo de péptidos fluorógenos que Describimos aquí no tiene estas limitaciones. Los péptidos de interés pueden ser diseñados en base a secuencias públicamente disponibles, hay varios proveedores que ofrecen una amplia gama de las proteasas recombinantes que son relevantes para este tipo de estudios y el ensayo incluyendo el análisis puede realizarse dentro de un solo día.
En nuestro ejemplo, hemos examinado escote furin-mediada de la S2' sitio de reconocimiento de proteasa de la proteína de MERS-CoV S derivados de los seres humanos y los camellos de Egipto y Marruecos. El humano EMC/2012 y el camello HKU205 S2' sitios contienen una típica RXXR furin escote. Sin embargo, según el escote de PiTou 2.0 puntuación algoritmo la S2 HKU205' sitio no se predice para ser dividido por el furin, que experimentalmente confirmados19. La razón por qué S2 HKU5' no se procesa por furin podría deberse a la isoleucina en la P1' posición. Cuando probamos dos péptidos que llevan a las mutaciones individuales en el S2 EMC/2012 ' secuencia, hemos podido confirmar que la isoleucina en la P1' en gran medida deroga escote mientras que la alanina para la sustitución de serina dio lugar a la hendidura menor. La S2 Mor213' sitio no contienen una furin escote y no es sorprendente detectar casi sin escote. También examinamos cómo furin hiende S1/S2 y S2' sitios de reconocimiento de proteasa de la proteína S FCoV. Hemos podido observar furin escote de ambos péptidos FECV (FECV I y 4 S1/S2 y S2 FECV II 1683'), mientras que secuencias mutadas del virus de la FIPV no fueron troceadas por furin.
Cuando se comparan escote furin-mediada de la S2 EMC/2012 ' péptido (figura 1A) con los péptidos de FECV I y 4 S1/2 (figura 2A), se encontró que existía una diferencia aproximada de 26-fold en la Vmax. Esto puede explicarse por el adorno del escote furin en ambas secuencias (tabla 1). Mientras que el requisito mínimo para escote furin es un motivo RXXR, una secuencia RXRR es mucho más favorable2. Por lo tanto, el S2 EMC/2012 ' péptido, que tiene un motivo RSAR, es dividido con menos especificidad en comparación con el péptido de FECV I y 4 S1/2 que contiene un sitio de la hendidura RSRR furin (tabla 1).
Sin embargo, una limitación importante del análisis es que los péptidos no reflejan la estructura terciaria de la proteína que se encajan generalmente en. Clivaje de la proteína de la fusión de longitud completa expone el péptido de fusión y disparadores anfitrión célula entrada1. La interacción entre la proteína proteasa y fusión también podría ser afectada por la estructura terciaria de la proteína de fusión mientras que asumimos que los péptidos son más o menos lineales. Por lo tanto, escote detectado en el análisis de péptidos puede ser artificial y puede no reflejar la situación en vivo . Esto fue informado por el escote de influenza subtipo H3N2 HA por Matriptasa. Mientras que varios grupos según escote de la H3N2 HA Matriptasa en ensayos del péptido, también fue demostrado que incubación de H3N2 HA proteína de longitud completa y Matriptasa en cultivo celular no produjo un fusogénicas HA proteína4,20, 21. Hay otros ejemplos que demuestran que la regulación biológica importante de clivaje proteolítico en el nivel de conformación de proteínas. Se ha descrito que las proteínas de fusión a veces necesitan una serie de eventos pre-fusion para poder exponer los sitios de clivaje sobre fusión. La proteína de la fusión del virus Semliki Forest, por ejemplo, requiere de cambios estructurales durante una serie de eventos prefusión para exponer su proteína de la fusión y que esté disponible para la activación proteolítica22. Por lo tanto, los resultados obtenidos en un ensayo de péptido fluorógenos deban ser validada por estudios de fusión de células o experimentos similares. Sin embargo, el análisis de péptidos aún permite una detección rápida de varias combinaciones de proteasa/péptido y reducir la mano de obra y tiempo de seguimiento de experimentos ya que combinaciones que muestran el escote están muy probables que exhiben el mismo resultado en vivo.
La segunda limitación importante del análisis refiere a las proteasas. Hasta el momento sólo es posible probar las proteasas soluble pero no transmembrana proteasas. Dependiendo de la intención del experimento, esto puede ser un problema. Por ejemplo, la gripe ha es activadas por un número de proteasas transmembranales localizado en las membranas celulares8. Hasta cierto punto, este problema puede eludirse mediante el uso de los dominios activos proteolíticos solubles, pero los resultados tienen que interpretarse con precaución y deben ser validados con métodos convencionales. Queremos que consulte el ejemplo de beforementioned con Matriptasa y su actividad hacia la H3N2 HA. En vivo Matriptasa está situado en la membrana de la célula pero la enzima disponible comercialmente es el dominio catalítico soluble. Como hemos comentado con respecto a las proteínas de fusión, es posible que también requiere la proteasa integral para interactuar con el sustrato de la proteína de larga duración para obtener el escote y que pruebas sólo dominios solo pueden resultar en falsos positivos.
Esta metodología ha demostrado ser eficaz para el estudio de la ruptura de secuencias específicas del aminoácido por furin. Sin embargo, las aplicaciones de los alcances de la técnica a cualquier proteasa disponible (e.g., catepsinas, cualquiera convertasa), lo que es un método útil a los candidatos de péptido de pantalla para el escote de la proteasa. Por otra parte, se ha demostrado que este análisis también pueden utilizarse para probar la eficacia de los inhibidores de la proteasa y por lo tanto, proporciona un rápido y fácil herramienta para pantalla proteína inhibidores23.
El ensayo de clivaje de péptido fluorógenos descrito aquí representa una adición al escote de Bioinformática que algoritmos, que predice el clivaje de péptidos por una proteasa determinada, basada en las propiedades de aminoácidos y la secuencia. Estas dos técnicas, en combinación con la tradición occidental borrar técnicas pueden utilizarse como un método eficaz para el estudio de proteasas escote in vitro.

Fusión viral con la membrana de la célula huésped es un paso crucial en el ciclo vital del virus envueltos y facilita la entrada en la célula y la replicación del virus. Por lo general, los virus poseen una proteína especializada (o proteínas) que se une a receptores en la membrana de la célula huésped y desencadena el virus-célula membrana fusión1. Proteínas de fusión viral han sido agrupadas en tres clases principales (I-III)1. Un número de virus que son actualmente un motivo de preocupación para la salud pública, como el virus de la gripe (que representa una larga aparición zoonótica de aves) y síndrome-coronavirus respiratorio de Oriente (MERS-CoV) (representando un reciente zoonóticos aparición de camellos), utilizar el supuesto clase I proteínas de fusión, que requieren procesamiento proteolítico por las proteasas del huésped, para ejercer su actividad fusogénica del2. Del mismo modo, coronavirus felino (FCoV), que representa una amenaza importante enfermedad de los gatos salvajes y domésticos, también posee una clase proteína de la fusión. Clase I fusión viral las proteínas normalmente se sintetizan como un precursor de uncleaved y generalmente consisten en dos dominios que son responsables del receptor binding y desencadenar el evento de fusión respectivamente. Hasta la fecha, la hemaglutinina (HA) de la influenza es había entendido de la mejor proteína de la fusión y numerosos estudios han descrito su papel mecánico en host celular fusión y entrada3. En este caso el clivaje de la proteína de fusión se produce en una secuencia específica o un sitio de la hendidura dentro de HA y en combinación con cambios conformacionales dependientes de pH, resultados en la exposición de la de1,de péptido fusión viral2.
El péptido de fusión y su secuencia de reconocimiento de proteasa anterior son esenciales para la patogenicidad y la adaptación de la huésped del virus. Cambios en la secuencia de reconocimiento de proteasa pueden alterar escote significativamente con consecuencias potencialmente dramáticas para el virus y el anfitrión4. Por un lado, puede derogar escote y así eliminar el ciclo de vida del virus. Pero por otro lado, una mutación puede aumentar la especificidad de sustrato para una proteasa determinada o permitir una proteasa "nueva" para unirse a la proteína de fusión. Posteriormente, esto también puede expandirse el tropismo celular y tejido, como se observa, por ejemplo, con el virus de la influenza subtipos5,6. Bajo generalmente virus de la gripe aviar (LPAI) de patogenicidad y más humanos virus de la gripe están confinadas al tracto gastrointestinal o respiratorio debido a la localización limitada de las proteasas que activan. Típicamente, el péptido de fusión de estas proteínas HA está precedido por una secuencia ácida 4-amino que consiste en 1-2 no consecutivos aminoácidos básicos, que es reconocida por proteasas de serina similar a tripsina como tripsina, Matriptasa o TMPRSS27, 8. cuando el virus adquiere mutaciones que cambian el sitio de la hendidura a un sitio polibásico o inserciones, permite furin activar la HA y potencialmente causar una infección sistémica más severa6,9. Estos virus se denominan virus de influenza aviar de alta patogenicidad (IAAP), caracterizado por las cepas de H5N1.
A diferencia de la gripe HA muchos coronavirus, como MERS-CoV, tienen dos sitios de clivaje distinto dentro de la proteína de la espiga. El sitio de S1/S2 separa el dominio N-terminal de unión del receptor (S1) el dominio c-terminal de fusión (S2), con un segundo sitio de la hendidura, llamado S2', aguas abajo del sitio de S1/S2, en proximidad a la del péptido de fusión10. Se sugirió que los sitios son troceados secuencialmente, en seguido por S2 S1/S2 '. En contraste con la HA de la mayoría de las cepas de virus de influenza, MERS-CoV S proteína S1/S2 y S2' sitios pueden reconocerse por las proteasas de la familia cualquiera convertasa (PC), como furin. Miembros de esta familia se desdoblan en los residuos básicos apareados con el adorno R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. En general, los aminoácidos aguas arriba del sitio de clivaje se denominan P1, P2, P3, etcetera. contados a partir de los aminoácidos aguas abajo y el sitio de la hendidura son designados como P1', P2', P3', etcetera. 11. cepas de FCoV pueden tener una sola o un sitio de doble hendidura. Como MERS-CoV, algunas cepas de FCoV también poseen dos sitios de clivaje (S1/S2 y S2') en su proteína S. Sin embargo, esta característica es exclusiva de serotipo I FCoVs (grupo A). Por el contrario, los miembros de la agrupación de serotipo II (grupo B) sólo tienen un sitio de solo escote (S2')2,12. Varias proteasas se han sugerido para unirse a los sitios de clivaje FCoV, incluyendo furin, proteasas como tripsina y catepsina. Se ha propuesto que la proteína S de FCoV entérico (coronavirus entérico felino también conocido como o FECV) es probable que ser hendida por furin en el sitio de S1/S2 y las mutaciones en este sitio (así como en S2') conduce a los cambios en los requisitos de la proteasa. Estas mutaciones se han asociado con cambios en el tropismo y la patogenicidad de estos virus, lo que permite al virus para convertirse en sistémica y macrófagos-trópico (peritonitis infecciosa felina también conocido como virus o FIPV)13.
Virus natural introducen mutaciones en su genoma durante cada ciclo de replicación y con frecuencia nuevos subtipos y cepas de la gripe, MERS-CoV y FCoV son descritas14,15,16. Como parte de una evaluación rápida para evaluar la amenaza de salud pública de los virus emergentes, es fundamental para investigar cambios en el sitio de la hendidura y cómo afecta a la gama de proteasas activando estos virus. Aquí, describimos un análisis basado en el péptido que permite una evaluación muy rápida de cómo los cambios de sitio de clivaje en MERS-CoV S proteína afectan la especificidad de sustrato de una proteasa determinada y rápidamente la pantalla varias proteasas por su capacidad para allegarse un dado o múltiples secuencias4. En un segundo grupo de experimentos, se utilizó la técnica para determinar la actividad de escote furin sobre cepas y serotipos diferentes de FCoV.
Los péptidos utilizados en este ensayo se modifican con el par de transferencia (traste) energía de fluorescencia resonancia, acetilo 7-methoxycoumarin-4-yl (MCA) en el N-terminal y N-2, 4-dinitrofenilo (DNP) en el C-terminal. Durante el ensayo, está emocionado y emite energía de luz que se apaga por el DNP como el par es muy cerca entre sí. Si la hendidura se produce, sin embargo, DNP no es capaz de saciar la emisión ya y puede ser leído por el lector de fluorescencia. Los cambios en la fluorescencia se mide durante el experimento para determinar la tasa de clivaje de péptidos y para calcular la velocidad a la que la proteasa escinde el péptido específico (también conocido como Vmax)17.
Para diseñar los péptidos, el gen de la proteína de fusión respectivos debe hayan sido ordenado y disponibles en una base de datos. Sin embargo, el método es menos mano de obra intensa y costosa que los métodos convencionales que requieren generalmente la clonación del gene de la proteína de fusión en vectores de expresión para expresar en células de mamífero para analizar el escote. De principio a fin, esto puede tomar varios días hasta unas pocas semanas mientras que los análisis de péptidos presentados aquí se pueden hacer en un día tan pronto como hay péptidos y proteasas. La configuración del ensayo toma entre 5 y 30 minutos dependiendo del número de muestras y el tiempo de ejecución en el lector de la placa de fluorescencia es 1 h. Análisis de los datos puede tomar hasta 2 h otra vez dependiendo del tamaño de la muestra.
Aquí, elegimos dos ejemplos diferentes para presentar el ensayo. En el primer ejemplo, se presentan datos que compara el clivaje mediado furin de humano y derivados de camello MERS-CoV, para evaluar el potencial de las cepas derivadas de camello de ser activado en los seres humanos si cruzan la barrera de las especies. En el segundo ejemplo, utilizamos un análisis de péptidos fluorógenos para determinar el clivaje mediado furin del S1/S2 y S2' sitios o S2' sitio de dos serotipo I y cepas de serotipo dos II FCoV, respectivamente. Para estos experimentos, se utilizó el escote de tripsina como control positivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Biomatik</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Furin</td>
			<td style="width:131px;">NEB</td>
			<td style="width:164px;">P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Trypsin, TPCK-treated</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">XPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SoftMax Pro 6.5.1&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated)</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:164px;">3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Light damping tubes</td>
			<td style="width:131px;">Watson Lab</td>
			<td>131-915BL or 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:131px;">Microsoft</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Prism 7</td>
			<td style="width:131px;">GraphPad</td>
			<td style="width:164px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorogenic peptide cleavage assay to screen for proteolytic activity: applications for coronavirus spike protein activation

Virus envueltos como el coronavirus o influenza virus requieren clivaje proteolítico de la proteína de la fusión para poder infectar la célula huésped. A menudo los virus presentan tropismo celular y el tejido y se adaptan a las proteasas de la célula o tejido específicas. Además, estos virus pueden introducir mutaciones o inserción en su genoma durante la replicación que puede afectar el escote y así puede contribuir a la adaptación a un nuevo host. Aquí, presentamos un ensayo de clivaje fluorógenos péptido que permite una rápida proyección de péptidos imitando el sitio de clivaje de proteínas de fusión viral. La técnica es muy flexible y puede utilizarse para investigar la actividad proteolítica de una sola proteasa en muchos sustratos diferentes, y además, también permite la exploración de la actividad de las proteasas múltiples en uno o más sustratos de péptido. En este estudio, se utilizaron péptidos imitando los motivos de sitio de clivaje de la proteína de la espiga de coronavirus. Hemos probado humana y camello derivados síndrome respiratorio Oriente coronavirus (CoV-MERS) para demostrar que sustituciones individuales y dobles en el sitio de la hendidura pueden alterar la actividad del furin y cambiar drásticamente la eficiencia del escote. También utilizamos este método en combinación con la bioinformática para probar la actividad de la hendidura del furin de coronavirus felino spike proteínas de diferentes serotipos y cepas. Este método basado en el péptido es menos mano de obra y tiempo intensivo que los métodos convencionales utilizados para el análisis de la actividad proteolítica en busca de virus, y se pueden obtener resultados en un solo día.

En la primera parte de este estudio, se utilizaron péptidos que representan el S2' sitio de la hendidura de tres proteínas distintas de MERS-CoV S: de la cepa humana prototípica de EMC/2012 (Genbank AFS88936.1) y de dos seleccionados MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank derivados de camello AHL18090.1) y Mor215 (Genbank AVN89324.1) cepas, aisladas en Egipto y Marruecos, respectivamente (tabla 1)16,18.
En comparación con la cepa EMC/2012, la S2 HKU205' sitio de la hendidura tiene dos mutaciones en el P2 y P1' posiciones que potencialmente podrían impactar su reconocimiento por furin y alterar la eficacia del escote (tabla 1). Además, estábamos interesados en investigar si y cómo cada mutación individual encontrada en la cepa de HKU205 afecta furin escote. Por lo tanto, incluimos dos péptidos donde se introdujeron las sustituciones individuales en la secuencia del péptido EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' y mutS EMC/2012-I S2') (tabla 1). Furin fue capaz de hender el péptido EMC/2012 eficientemente con una Vmax de 6,3 ± 1.2 RFU/min, mientras que no se detectaron casi ninguna hendidura cuando usando el S2' péptido de la cepa HKU205 (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Figura 1a). Al investigar la EMC/2012 mutA-S S2' péptido, encontramos que la división fue reducida fuertemente en comparación con la secuencia de tipo salvaje (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). No había casi ninguna hendidura cuando el mutS EMC/2012-I S2' péptido (Vmax 1.1 ± 0.9 RFU/min) (Figura 1a).
MERS-CoV aislados de África occidental se informaron recientemente, que filogenéticamente distinto de MERS-CoV se encuentran en la península arábiga16. Uno de los aislados recientemente descritos es la cepa Mor213, que lleva una leucina en lugar de una arginina en la posición P4 del S2' sitio (tabla 1), y que potencialmente podría impactar su reconocimiento por furin y alterar la eficacia del escote. Nuestro análisis del péptido demostraron que sólo es mínimo escote del S2 Mor213' sitio en comparación con el sitio EMC/2012 (Figura 1b). El Vmax para el péptido de Mor213 es de 1,0 ± 0,1.
Para la segunda parte de este estudio, utilizamos el mismo análisis de péptidos para evaluar escote furin-mediada de sitios de clivaje de la proteína FCoV S. Se utilizaron péptidos imitando el sitio de clivaje S1/S2 del serotipo dos de FCoV virus: FECV I y-4 (del laboratorio de Whittaker) y FIPV I negro (Genbank AB088223.1). También utilizamos péptidos imitando el S2' sitio de estos virus, así como dos FCoV serotipo II: FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) cepas (tabla 1) y FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1). Por lo general, furin escote se produce cuando los residuos básicos (arginina y lisina) están presentes en las posiciones P1 y P4 de la sitio de la hendidura. Las mutaciones en el P1, P4 y P1' posiciones se proponen interferir cleavability furin, alterando, por tanto, los requisitos de la proteasa de la proteína. (Tabla 1). Furin escote se observó para el prototipo S1/S2 péptido FECV I y 4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min) pero no en el péptido de S1/S2 mutado FIPV I negro S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1,29 RFU/min) (figura 2A). Asimismo, furin fue capaz de hender el prototipo S2' péptido FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0.97 RFU/min), pero no el S2 mutado ' péptidos FECV I y-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0.11 RFU/min), FIPV que S2 negro ' (Vmax 0.30 ± 0.14 RFU/min) y FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0.11 RFU / min) (figura 2B). Se utilizó tripsina como control positivo de hendidura peptídica y observamos escote de tripsina en todos los péptidos utilizados (suplementario Figura 2).
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58892/58892tbl1v2.jpg">
Tabla 1. Utilizado y el correspondiente aminoácido secuencias de péptidos. Los péptidos utilizados en los ensayos contienen el acetilo/2, 4-dinitrofenilo (7-methoxycoumarin-4-yl) (MCA/DNP) traste par. Las P4 y P1 escote residuos del sitio colocado arginina (R), que son reconocidos por furin, están en negrita. Residuos en rojo corresponden a mutaciones en comparación con secuencias de referencia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2.jpg"> Figura 1 . Clivaje proteolítico mediado furin de S2 de MERS-CoV humanos y derivados de camello ' sitios fluorógenos péptidos. A. análisis de escote Furin del humano MERS-CoV EMC/2012 S2' sitio y cepa camello-derivados HKU205 (doble mutante), junto con variantes solo mutantes de EMC/2012 (mutA-S y mutS-me). B. ensayo de escote Furin del humano MERS-CoV EMC/2012 S2' sitio y cepa camello derivado Mor213. Para los paneles A y B, péptidos se incubaron con furin recombinante y el aumento de fluorescencia debido a procesamiento proteolítico se midió usando un fluorómetro. Los ensayos se realizaron en triplicado con resultados que representan promedios de Vmax de tres experimentos independientes (n = 3). Barras de error indican SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig1v2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58892/58892fig2.jpg"> Figura 2 . Clivaje proteolítico mediado furin de FCoV S1/S2 y S2' sitios fluorógenos péptidos. A. escote Furin análisis de FECV I y-4 y FIPV I sitios negro S1/S2. Péptidos se incubaron con recombinante furin. B. ensayo de clivaje Furin de FECV I y-4, FIPV negro, FECV II 1683 y FIPV II 1146 S2' sitios. El aumento de fluorescencia debido a procesamiento proteolítico se midió con un fluorómetro. Los ensayos se realizaron en triplicado con resultados que representan promedios de Vmax de tres experimentos independientes (n = 3). Barras de error indican SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/58892fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
Suplemental tabla 1: Valores de Vmax para figura 1 y figura 2. El Vmax se calcularon los valores de los gráficos como se ilustra en el suplementario figura 1 y como se describe en la sección 4 del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Suplementario figura 1: ilustración de datos brutos derivados desde el software de lector de la placa. Aumento de la fluorescencia sobre gráficos de tiempo que fueron utilizados para la determinación del Vmax. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Fig_S1.ai" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario figura 2: clivaje proteolítico mediado por tripsina de FCoV S1/S2 y S2' sitios fluorógenos péptidos. Escote de tripsina ensayo de FECV I y-4 y FIPV sitios negro S1/S2 y de FECV I y-4, FIPV negro, FECV II 1683 y FIPV II 1146 S2' sitios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58892/Supplemental_Figure_2.eps" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

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A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Presentamos un ensayo de clivaje fluorógenos péptido que permite una rápida detección de la actividad proteolítica de las proteasas en péptidos que representan el sitio de clivaje de péptidos de fusión viral. Este método puede utilizarse también en cualquier otro motivo del aminoácido dentro de una secuencia de la proteína para probar la actividad de proteasa.

Un ensayo de escote de péptido fluorógenos para detectar actividad proteolítica: aplicaciones para coronavirus punto de activación de la proteína

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica, como la modificación proteolítica de proteínas, así como la caracterización de inhibidores y proteasas y peptidasas. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado rápido de la actividad proteolítica de las proteasas en péptidos, representando el lado de escisión de la proteína dada. El uso aquí es estudiar las proteasas que activan la fusión viral.El primer paso en el diseño de péptidos es adquirir la secuencia de la proteína de fusión de interés de una base de datos pública como NCBI o la base de datos de patógenos del virus. Elija el sitio de reconocimiento de proteasa que procede del péptido de fusión e incluya de dos a tres aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia. Al ordenar el péptido, modifíquelo con la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o par FRET, Mca en la terminal final y Dnp en la terminal c.Durante el ensayo, Mca se excita y emite energía lumíña que es sofocada por Dnp mientras el par esté cerca uno del otro. Sin embargo, si se produce un escote, Dnp no podrá apagar la emisión que luego puede ser leída por el lector de placas de fluorescencia. Resuspender el péptido de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.Por ejemplo, resuspend en 70%etanol a una concentración final de un milimolar. Si el péptido no se resuspía muy bien por pipeteo, coloque el tubo que contiene el péptido y el disolvente en un baño de sonicación hasta que se resuspend. Dispensar 100 microlitros alícuotas del péptido en tubos de amortiguación de luz o resistentes para proteger el péptido del blanqueo.Almacene las alícuotas a menos 20 grados centígrados. Comience este procedimiento encendiendo el lector de placas y esperando hasta que finalice la autoprueba. A continuación, abra el software operativo en el ordenador conectado y asegúrese de que está conectado con el lector de placas.Abra el ajuste de temperatura y establézcalo en la temperatura requerida para un rendimiento óptimo para la proteasa, que es de 30 grados centígrados, en este caso. Para configurar el experimento, haga clic en la configuración del instrumento de control, elija cinética y, a continuación, seleccione fluorescencia. Introduzca una longitud de onda de excitación de 330 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 390 nanómetros.Anule la selección del corte automático y seleccione la sensibilidad media/normal. Elija un tiempo de ejecución de una hora para el ensayo y seleccione una medida cada 60 segundos. Establezca cinco segundos de mezcla antes de la primera medición y tres segundos antes de cada medición.Por último, seleccione los pozos que desea leer. Prepare los búferes de ensayo adecuados para las proteasas como se describe en el protocolo de texto y enfríe los búferes sobre hielo. Coloque una placa plana de 96 pocillos de fondo plano no tratada de poliestireno negro sólido sobre hielo con una placa metálica delgada debajo para apoyar el enfriamiento y la estabilidad.Es esencial utilizar una placa negra como placa de ensayo, para evitar fugas fluorescentes de pozos adyacentes. Por péptido, prepare tres réplicas técnicas por ensayo y un volumen total de 100 microlitros por muestra. Pipetear la cantidad adecuada de tampón de ensayo en cada pozo de la placa de ensayo.Añadir 0,5 microlitros de proteasa a cada pozo. A seis pozos, agregue 0,5 microlitros de tampón en lugar de la proteasa respectiva. Tres de ellos serán controles ciegos y los otros tres serán controles de péptidos.Añadir cinco microlitros del péptido a una concentración final de 50 micromolares a cada pozo, excepto los controles ciegos. A cada uno de los tres pozos de control ciego, agregue cinco microlitros de tampón en lugar de péptido. Inserte la placa en el lector de placas de harina y haga clic en iniciar.Antes de iniciar el análisis de datos, guarde el archivo de experimento. Haga clic en exportar y exporte el archivo como un archivo txt. Importe el archivo txt a una hoja de cálculo.Inicie el análisis creando un gráfico, trazando las unidades fluorescentes relativas en el eje Y con el tiempo en el eje X para cada réplica técnica por muestra. Seleccione el rango de datos donde el gráfico está en un rango lineal y el más cercano al inicio del aumento de fluorescencia. Trazar los datos seleccionados en un segundo gráfico y añadir una línea de tendencia lineal.En las opciones de línea de tendencia, seleccione la ecuación de visualización en el gráfico. La ecuación mostrará V max, que corresponde a la pendiente de la línea de tendencia. Calcule el promedio de V máximo para cada muestra a partir de las tres réplicas técnicas.Después de repetir el experimento dos veces más, para obtener tres réplicas biológicas, calcule la desviación estándar basada en los datos de las tres réplicas biológicas independientes. Un ensayo de escisión de furin de coronavirus de MERS humano, sitio principal DE EMC/2012 S2 y cepa de doble mutante derivada de camellos HKU205, junto con variantes mutantes individuales de EMC/2012 revelaron que el péptido EMC/2012 fue cebado eficientemente, mientras que casi no se produjo ninguna escisión del péptido principal S2 de HKU205. El escote del péptido principal S2 mutado EMC/2012 A-S se redujo fuertemente, y casi no hubo escote del péptido primo EMC/2012 S a I mutado S2.Otro ensayo de escisión de furin mostró sólo un escote mínimo del sitio principal Marruecos 213 S2 derivado de camellos, en comparación con el coronavirus humano MERS, sitio principal EMC/2012 S2. Se observó escote de furin para el péptido prototípico S1/S2, FECV I y 4 S1/S2, pero no en el péptido S1/S2 mutado, FIPV I Negro S1/S2. Del mismo modo, el furin fue capaz de cortar el péptido primo prototípico S2, FECV II 1683 S2 primo, pero no los péptidos primos S2 mutados, FECV I y 4 S2 primo, FIPV I Black S2 primo, y FIPV II 1146 S2 primo.Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de manchas occidentales o ensayos de aminofluorescencia, utilizando la proteína de longitud completa de interés para verificar la escisión proteica, o en este caso, si la escisión da lugar a una versión fusogénica de la proteína de fusión viral.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...