Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81473692) إلى يونغ ما. ويشكر المؤلفون جميع موظفي مركز البحوث الطبية في الكلية الاولي للطب السريري في جامعه نانجينغ للطب الصيني.

تمت الموافقة علي جميع الطرق التي تنطوي علي الحيوانية الموصوفة هنا من قبل المؤسسة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من جامعه نانجينغ للطب الصيني.
1. الاعداد
<ol><li>اعداد عده طوليا قطع 1 مل نصائح ماصه (1 سم) والعديد من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 mL. وضع نصائح ماصه وأنا?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

القدرة علي الحصول علي ودراسة العظم الكبدي في المختبر هو مهارة حاسمه وأساسيه لأي باحث يرغب في دراسة استقلاب العظام ، والتي قد تساعد علي فهم أليات الامراض التي تمتص العظام وتطوير العوامل العلاجية الجديدة. وقد وصفت هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استنادا إلى الأساليب السابقة.
<p class=...

التوازن العظام هو عمليه الفسيولوجية المعقدة التي ينظمها العظم resorbing العظام والعظام تشكيل عظم1. التوازن بين النشاط العظمي والعظام التي توسطت من خلال عظم والعظم ، علي التوالي ، هو ضروري للغاية للحفاظ علي صحة العظام والتوازن ، وذلك لان الاضطرابات في التوازن العظام قد يؤدي إلى امراض العظام ، مثل كما غير طبيعي نمو العظام أو فقدان كثافة العظام. كخلايا ارتشاف العظام الفريدة من نوعها ، فان العظم الكبدي مهم في الامراض المتعلقة بتدمير العظام غير الطبيعي ، بما في ذلك ترقق العظم ، والتهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي2،3.
يتم تقسيم تطور الثقافة العظمية بشكل رئيسي إلى مرحلتين. وقد شكلت الأساليب التي وضعتها Boyde et al.4 والدوائر وآخرون5 المرحلة الاولي في الثمانينات من القرن الماضي. انها حصلت علي وفره نسبيا العظم من عظام المواليد الجدد ، والتي هي فتره أعاده عرض السريع. يتم الإفراج عن العظم عن طريق تفتيت وتحريك العظام في وسط خاص. ومع ذلك ، فان الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب منخفضه الكمية والنقاء. وكانت المرحلة الثانية تطوير الثقافات طويلة المدى للتشكيل العظمي ، وذلك باستخدام خلايا السلالة المكونة للدم المستمدة من نخاع العظم6. السايتوكينات ، مثل 1α ، 25-ديهيدروكسيفيتامين D3 ، بروستاستارين E2 (pge-2) ، وهرمون الغدة الدرقية (pge) ، والتي تضاف إلى الوسط الثقافي ، والعمل من خلال نظام الخلايا العظمة/اللحمية لتحفيز تشكيل العظم7،8 . ومع ذلك ، فان نقاء وكميه العظام التي يتم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة لا يمكن ان تلبي احتياجات البحوث البيولوجيا الجزيئية الحديثة. ثم ، اكتشاف عامل التحفيز مستعمره الضامة (م-السائل الدماغي الشوكي) والمنشط مستقبلات لعامل النووية-κb يجند (rankl) جعل العظمية أسهل9،10،11، وطريقه استخدام M-السائل الدماغي الشوكي RANKL لتحفيز مباشره تشكيل العظم يستخدم علي نطاق واسع في جميع انحاء العالم. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض التفاصيل في المنهجية التي تحتاج إلى تحسين.
وفي الوقت الحالي ، فان طريقه الاستزراع العظمي الأكثر استخداما ، كما وصفتها مارينو وآخرون12 و Pei et al.13، غالبا ما تتطلب أزاله الانسجه المحيطة حول العظم وتستخدم ابره معقمه لمسح تجويف النخاع مع وسائل الاعلام المكتملة. هناك بعض العيوب لهذه العملية ، بما في ذلك حقيقة ان (1) أزاله الانسجه المحيطة حول العظام يتطلب الكثير من الوقت والتقنية الجراحية كبيره ، (2) العظام هشه ويمكن ان يؤدي إلى تدفق نخاع العظم ، (3) قد يكون تجويف نخاع العظم صغيره جدا لدافق ، و (4) هناك خطر أصابه ابره العصا. لتجنب هذه المشاكل ، ونحن الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي علي العظام لنخاع العظم بدلا من ابره-تنظيف نخاع العظم. هنا ، ونحن نقدم طريقه مستقره وأمنه التي تعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الإجراءات التقليدية. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما في المختبر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

العظم والعظام هي الخلايا الكبيرة ، نوى ، والعظم-ارتشاف السلالة الاحاديه الضامة التي تتشكل من خلال انصهار البويضات الاحاديه أو السلائف الضامة. ارتشاف العظم المفرط هو واحد من أهم أليات الخلوية التي تؤدي إلى امراض العظم ، بما في ذلك هشاشة العظام ، التهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي. تتمثل الوظيفة الفسيولوجية الرئيسية للعظام في امتصاص كل من مكون هيدروكسيباتيت المعدني والمصفوفة العضوية للعظام ، مما يولد مظهر الارتشاف المميز علي سطح العظام. هناك عدد قليل نسبيا من العظم العظمي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى في الجسم ، وخاصه في عظام الكبار. وقد ركزت الدراسات الاخيره علي كيفيه الحصول علي أكثر نضجا العظام في وقت اقل ، والتي كانت دائما مشكله. وقد تطورت العديد من التحسينات في تقنيات العزلة والثقافة في المختبرات من أجل الحصول علي أكثر نضجا العظام. هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الاجراء التقليدي ، وذلك باستخدام جهاز خاص وبسيط. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما من نخاع العظم الفئران ، والتي يتم تحديدها بواسطة الأساليب الكلاسيكية.

وكان الغرض من البروتوكول لعزل وتنقيه اعداد كبيره من السلائف العظمية الاخيره مريح وتحفز العظم بنجاح. من خلال المكمل مع M-السائل الدماغي الشوكي و RANKL, وشهدت العظام العملاقة في الأيام 5 – 6. تم تحديد تشكيل العظم العظمي بنجاح عن طريق تلطيخ فخ (الشكل 1A). واعتبرت ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

العظم والعظام هي الانسجه الخاصة الضامة الكريات العظمية المشتقة من سلاله أحاديه الضامة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم. يصف هذا البروتوكول كيفيه عزل خلايا نخاع العظم بحيث يتم الحصول علي كميات كبيره من العظم العظمي مع الحد من مخاطر الحوادث الموجودة في الطرق التقليدية.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

هذه الطريقة هامة لأنه يمكن استخدامها للحصول على كميات كبيرة من العظام المتمايزة تماما في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه أكثر استقرارا وآمنة ويعزل نخاع العظام في وقت أقل ومع جهود أقل مقارنة مع الإجراءات التقليدية. هذه التقنية يمكن أن توفر مصدرا مستقرا من العظام، والتي هي الكائن المهم من أمراض التمثيل الغذائي العظام، بما في ذلك هشاشة العظام، التهاب البارودوتي، والعظام البيربوستة.مع تعديلات طفيفة، يمكن أن يكون هذا البروتوكول أيضا مناسبة للحصول على أنواع مختلفة من نخاع العظام المشتقة الخلايا في الفئران أو الحيوانات الأخرى. للبدء ، ضع الحيوانات الرحيمة على لوحة مطهرة في وضعية supine. باستخدام مقص معقمة، وجعل شق ما يقرب من سنتيمتر واحد في الطول في عظم الفخذ القريب لقشر الجلد.بعد ذلك، تشريح من عظم الفخذ والساق. بعناية ولطف، وقطع أجزاء اتصال الثنائية حول الورك والركبة، والمفاصل الكاحل لعزل الساق والفخذ. قطع جزء من الأنسجة حول العظام، والتأكد من أن تكون شاملة.ثم، ضع العظام النظيفة في طبق مع خمسة ملليلتر من الثقافة الكاملة المتوسطة. استخدام مقص معقمة لقطع العظام الطويلة. استخدام حقنة المليلتر واحد إبرة لطرد بعناية تجويف النخاع مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة حتى تجويف النخاع يتحول الأبيض.نقل هذا التعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر وتصفية ذلك مع مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة الأنسجة المتبقية. إضافة خمسة ملليلتر من الدم الأحمر العازلة، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة ثماني دقائق. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 250 مرات G لمدة خمس دقائق ل تسفر عن بيليه الخلية.تعرق وssuspend الخلايا في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا، وحساب الوقت الذي يقضيه في الإجراءات المتخذة لهذا الأسلوب. أولاً، ضع الحيوانات الرحيمة على لوح مطهر في وضعية ية.باستخدام مقص معقمة، وجعل شق ما يقرب من سنتيمتر واحد في الطول في عظم الفخذ القريب لقشر الجلد. بعد ذلك، تشريح من عظم الفخذ والساق. قطع أجزاء من الأنسجة حول العظام، على الرغم من أنه ليست هناك حاجة لإزالة الأنسجة تماما.شطف الساق والعظمة مع 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم قطع لهم في النصف. ضع الساق المقصوصة وعظم الفخذ في طرف ماصة مليلتر واحد معد، ووضع هذا في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير جاهز. جهاز طرد مركزي الأنبوب ثلاث مرات في 1،000 مرات G و أربع درجات مئوية لمدة 45 ثانية.بعد ذلك، قم بإزالة طرف الماصات الذي يحتوي على العظم من الأنبوب، تاركاً نخاع العظم في الأنبوب. إضافة 200 ميكروليترس من برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب، وماصة صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا لتفكك النخاع بدقة. نقل هذا التعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر، وتصفية ذلك مع مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة أي الأنسجة المتبقية.ثم استخدم مقياس الهيموسيتات لحساب الخلايا، وحساب الوقت الذي يقضيه في الخطوات التي تم اتخاذها في هذا القسم. إضافة ستة ملليلترات من محلول فصل الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المعقم. أضف تعليق الخلية المخفف إلى الأنبوب.بعد إضافة التعليق، سيظهر حد واضح بين طبقة الخلايا وحل الفصل. بعد ذلك، التزم بطرفة ماصة إلى السطح الداخلي للأنبوب بزاوية 45 درجة. الطرد المركزي الحل الطبقات في جهاز طرد مركزي أفقي في 500 مرة G لمدة 30 دقيقة.بعد هذا، pirate الطبقة الثانية الغائمة التي تحتوي على الخلايا المستهدفة من أعلى إلى أسفل. نقل الخلايا المستهدفة إلى أنبوب جديد. إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا، والطرد المركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق.كرر عملية الغسيل هذه عن طريق إضافة PBS والطرد المركزي لما مجموعه ثلاثة يغسل. Resuspend بيليه الخلية مع نخاع العظم تحريض المتوسطة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.ثم، إضافة 5-8 ملليلتر من نخاع العظام تحريض المتوسطة للحصول على حل الخلايا النهائية من 300،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من هذا الحل الخلية إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. بعد احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، بلطف التعرق قبالة المتوسطة وإضافة ملليلتر واحد من وسط التعريفي العظام إلى كل بئر.يهيج لوحة بلطف وإعادته إلى الحاضنة. كل 48 ساعة، وإزالة واستبدال 0.8 ملليلتر من وسط التعريفي في أوستيوكلات من كل بئر. تهيج لوحة بلطف قبل إعادته إلى الحاضنة.للبدء في مرحلة ما قبل علاج شرائح العظام، استخدم منشار كهربائي صغير لقطع قشرة العظام الفخذية البقرية الطازجة إلى شريحتين سميكتين سنتيمتر على طول المحور الطولي. بعد قطع وطحن الشرائح، وغسل شرائح عن طريق غمر لهم في منقار من الماء الأيونية وإخضاعهم لالموجات فوق الصوتية في 100 هيرتز لمدة ساعة واحدة. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات.تزج شرائح غسلها في 75٪ الكحول لمدة ساعتين. ثم، التعرق قبالة الكحول وفضح كل شريحة من شرائح للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على منصة نظيفة. للبدء في تلطيخ الأزرق التولويديين، ضع شرائح العظام المعالجة مسبقًا في آبار 24 بئرًا.بعد ذلك، أضف الثقافة المتوسطة في لوحة 24 بئر لتزج شرائح العظام لمدة ساعتين. زرع والحث على الخلايا كما هو موضح سابقا. بعد ظهور العظام في أربعة إلى ستة أيام، وغسل شرائح مع ملليلتر واحد من 0.25 الوليار هيدروكسيد الأمونيوم.سونيكات شرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل لإزالة الخلايا الحية والسماح لتحليل حفر ريسوشن على شرائح العظام. ثم، إزالة هيدروكسيد الأمونيوم وصمة عار الشرائح مع ملليلتر واحد من 1٪ toluidine حل الأزرق لكل شريحة لمدة دقيقتين. غسل شرائح وصمة عار مع برنامج تلفزيوني.اختر عشوائيا خمس طرق عرض واستخدام برنامج تحليل الصور لإجراء تحليل شبه كمي لمنطقة إعادة الامتصاص. أولاً، بادئة شرائح العظام مع ملليلتر واحد من 2.5٪ الجلوتارالديهيد لكل شريحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. Sonicate شرائح البادئة ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها مع واحد العث الأمونيوم هيدروكسيد لإزالة الخلايا.ثم، إزالة هيدروكسيد الأمونيوم وغسل شرائح العظام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، مع كل غسل دائم 12 دقيقة. إصلاح شرائح العظام غسلها مع حمض osmic 1٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تنفيذ الجفاف المتدرجة الإيثانول كما هو موضح في بروتوكول النص.بعد ذلك، استبدل الإيثانول بآسيت الإيزوميل لمدة 15 دقيقة. معطف شرائح مع البلاديوم الذهب وتحليلها عن طريق مسح المجهري الإلكترون. في هذه الدراسة، تم عزل أعداد كبيرة من السلائف العظمية، وطهرت وتم حثها بنجاح لتصبح العظام.من خلال المكمل مع M-CSF و رانكل، وينظر إلى العظام العملاقة في الأيام من خمسة إلى ستة. يتم تحديد تشكيل هذه العظام بنجاح عن طريق وصمة عار فخ. وتعتبر الخلايا الكبيرة والأرجوانية كخلة إيجابية TRAP مع نويات متعددة.من خلال هذه الطريقة، من المعتاد الحصول على 800 من العظام التي تحتوي على ما يصل إلى 30 نواة لكل نوى في 24 بئر. مقارنةً بالأساليب التقليدية، يوفر هذا الأسلوب المحسن حوالي 20 دقيقة خلال عملية العزل بأكملها. استخدام شرائح العظام لتقييم نشاط إعادة الامتصاص العظام هو طريقة نموذجية في المختبر.من خلال تلطيخ الأزرق التولويدي، يتم تصور منطقة resorption كالأخضر الفاتح. يمكن ملاحظة بنية وخصائص حفر العظام بوضوح عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. إنّ نسبة النقر إلى الظهور، وهي واحدة من علامات خلايا العظام المحددة، أمر بالغ الأهمية لتحديد العظام ودراسة تكوين العظام في العظام.التعبير الإيجابي لـ CTR يحدد بشكل واضح عظام العظام ويميزها عن البوليكاريونات الضامة. يشار بوضوح CTR في مقايسات المناعة من قبل لون أخضر، في حين يشير الأزرق نواة الخلية. تأكد من عدم كسر عظم الفخذ والنخاع لتجنب فقدان نخاع العظم.الفرد الذي لم يسبق له أن أجرى هذه التقنية من قبل قد النضال عند مساعدة الخلايا الحل العملية. يجب أن يتم الالتزام بطرفة الماصات بالسطح الداخلي للأنبوب والاحتفاظ بها بزاوية 45 درجة إلى السطح الداخلي.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

عزل وتمايز الخلايا التمهيدية الأولية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...