Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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这项工作得到了国家自然科学基金 (81473692) 对马勇的支持。作者感谢南京中医药大学第一临床医学院医学研究中心的全体工作人员。

这里描述的所有涉及动物的方法都得到了南京中医药大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。
1. 设置
<ol><li>准备几个纵向切割的1毫升移液器吸头 (1 厘米) 和几个 1.5 mL 微离心管。将移液器吸头和微型离心管放在103千帕和121°c 处 20分钟, 并确保它们是无菌的。</li>
	<li>准备一盒冰和几个无菌的盘子, 以保存隔离的组织在隔离过程中。</li>
</ol>2. 培养基的?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

对于任何希望研究骨代谢的研究人员来说, 体外获得和研究破骨细胞的能力是一项关键和基本的技能, 这可能有助于了解骨吸收不良的机制, 并开发出新的治疗药物。本研究描述了一种基于以往方法的协议, 并进行了一些修改。
与传统方法相比, 采用移液器吸头和微离心管获得骨髓, 大大缩短了获得骨髓的手术时间和实验室人员的工作量。同时, 该方法避免了骨髓丢失或针杆损伤...

骨稳态是一个复杂的生理过程, 是由骨吸收破骨细胞和成骨细胞1调节。在成骨细胞和破骨细胞活动之间的平衡, 分别通过成骨细胞和破骨细胞介导, 是非常重要的, 以维持骨骼健康和稳态, 因为在骨稳态的摄动可能会导致骨骼疾病, 如骨生长异常或骨密度下降。破骨细胞作为独特的骨吸收细胞, 在与异常骨破坏相关的疾病中非常重要, 包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解2,3。
破骨细胞培养的发展主要分为两个阶段。Boyde 等人和chambers等人确定的方法构成了1980年代的第一阶段。他们从新生动物的骨骼中获得了相对丰富的破骨细胞, 这是一个快速的重塑期。骨细胞克隆通过在特殊培养基中的碎裂和搅拌来释放。然而, 这种方法获得的细胞数量和纯度都很低。第二阶段是利用从骨髓6中提取的造血谱系细胞, 发展成骨细胞的长程培养。细胞因子, 如1α、25-二羟基维生素 d3、前列腺素 e2 (pge-2) 和甲状旁腺激素 (pth), 加入培养基, 通过成骨细胞/基质细胞系统作用,刺激破骨细胞形成 7,8.然而, 该方法获得的破骨细胞的纯度和数量不能满足现代分子生物学研究的需要。然后, 巨噬细胞集落刺激因子 (m-csf) 和受体激活剂的发现核因子-b 配体 (rankl) 使骨细胞生成更容易 9,10,11, 并使用 m-csf 和RANKL 直接刺激破骨细胞的形成在世界范围内得到了广泛的应用。然而, 方法中仍有一些细节需要改进。
目前, 最常用的破骨细胞培养方法, 如 Marino等人12和pei 等 13所述, 通常需要切除骨周围的周围组织, 并使用消毒针冲洗骨髓腔。完成的媒体。这个过程有一些缺点, 包括 (1) 切除周围的组织周围的组织需要大量的时间和伟大的手术技术, (2) 骨骼是脆弱的, 可以导致骨髓流出, (3) 骨髓腔可能是太小, 不能冲洗, (4) 有针头受伤的风险。为了避免这些问题, 我们离心管含有骨髓的骨头, 而不是针头冲洗骨髓。在这里, 我们介绍了一种稳定和安全的方法, 分离骨髓在更短的时间和更少的努力相比, 传统的程序。结合密度梯度离心, 我们在体外获得大量完全分化的破骨细胞.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

骨细胞是大的, 多核的, 和骨吸收细胞的单核细胞巨噬细胞谱系, 形成的单核细胞或巨噬细胞前体的融合。过度的骨吸收是导致溶骨性疾病的最重要的细胞机制之一, 包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解。破骨细胞的主要生理功能是吸收羟基磷灰石矿物成分和骨的有机基质, 在骨骼表面产生典型的吸收外观。与体内其他细胞相比, 破骨细胞相对较少, 尤其是在成人骨骼中。最近的研究集中在如何在更短的时间内获得更成熟的破骨细胞, 这一直是一个问题。为了获得更成熟的破骨细胞, 实验室在分离和培养技术方面有了一些改进。在这里, 我们介绍了一种方法, 分离骨髓在更短的时间和更少的努力, 与传统的程序相比, 使用一个特殊和简单的设备。利用密度梯度离心技术, 我们从大鼠骨髓中获得了大量完全分化的破骨细胞, 并采用经典方法进行鉴定。

该方案的目的是方便地分离和纯化大量破骨细胞前体, 成功诱导破骨细胞。通过对 M-CSF 和 RANKL 的补充, 在第5-6 天看到了巨大的破骨细胞。通过 TRAP 染色成功地鉴定了破骨细胞的形成 (图 1a)。大细胞和紫色细胞被认为是具有多个细胞核 (通常≥3个核) 的 trap 阳性细胞。通过这种方法, 典型的获得800个破骨细胞, 每个破骨细胞含有多达30个细胞核, 在一个24...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

大鼠骨髓破骨衣原体的分离、纯化及鉴别

破骨细胞是来源于造血干细胞单核巨噬细胞谱系的组织特异性巨噬细胞多核细胞。该方案描述了如何分离骨髓细胞, 以便获得大量的破骨细胞, 同时降低传统方法中发现的事故风险。

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

此方法很重要，因为它可用于在体外获得大量完全分化的骨质。与传统方法相比，这种方法的主要优点是，它更稳定、更安全，在更少的时间和更少的努力中分离骨髓。该技术可以提供稳定的骨质疏松来源，骨质代谢疾病是骨代谢疾病的重要对象，包括骨质疏松症、帕罗顿炎和肠胃骨解病。稍作修改后，此协议也可用于获取从大鼠或其他动物的细胞中提取的各种骨髓。首先，将安乐死动物放在消毒板上，放在一个上一个位置上。使用无菌剪刀，在近近股骨上做一个大约一厘米长的切口，以剥皮。接下来，解剖股骨和头骨。小心而轻柔地切割臀部、膝盖和脚踝关节周围的双边连接部分，以隔离头骨和股骨。切断骨头周围的部分组织，确保彻底。然后，将清洁的骨头放入一个五毫升的完整培养培养的盘子中。用无菌剪刀切掉长骨。使用一毫升注射器针用 10 毫升完整介质小心冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白。将这种细胞悬浮液转移到50毫升管中，用70微米滤株过滤，以去除剩余的组织。加入五毫升红血解液缓冲液，在冰上孵化细胞8分钟。在此之后，将细胞在250倍G下离心5分钟，以产生细胞颗粒。吸升液，并在10毫升的完整介质中重新暂停细胞。使用血细胞计计算细胞，并计算为此方法执行操作所花费的时间。首先，将安乐死动物放在消毒板上，放在一个上一个位置上。使用无菌剪刀，在近近股骨上做一个大约一厘米长的切口，以剥皮。接下来，解剖股骨和头骨。切断骨头周围的组织部分，虽然没有必要完全切除组织。用12毫升PBS冲洗头骨和股骨，然后切成两半。将被狙击的头骨和股骨放入准备好的一毫升移液器尖端，并放入准备好的微型离心管中。在1000次G和4摄氏度下将管离心三次，45秒。在此之后，从管中取出含有骨骼的移液器尖端，将骨髓留在管中。将 200 微升 PBS 添加到管中，并反复上下移液器，彻底分解骨髓。将这种细胞悬浮液转移到50毫升管中，用70微米滤株过滤，以去除任何剩余的组织。然后，使用血细胞计计算细胞，并计算在本节中所走的步骤所花费的时间。将六毫升细胞分离溶液加入无菌硅化离心管。将稀释的细胞悬浮液加入管中。添加悬浮液后，细胞层和分离溶液之间将出现一个明确的限制。接下来，以 45 度角将移液器尖端粘附在管内表面。在水平离心机中，以 500 倍 G 将分层溶液离心 30 分钟。在此之后，从上到下吸吸包含目标单元格的多云第二层。将目标细胞转移到新管。加入5毫升PBS清洗细胞，以250倍G离心5分钟。通过添加 PBS 和离心，重复此洗涤过程，总共进行三次洗涤。用骨髓诱导培养重新吸血细胞颗粒。使用血细胞计计算细胞数。然后，加入5至8毫升的骨髓诱导介质，获得每毫升30万个细胞的最终细胞溶液。在24井板的每个井中加入一毫升的细胞溶液。在37摄氏度下孵育细胞24小时后，轻轻吸气，并在每个井中加入一毫升的骨质诱导介质。轻轻搅拌盘子，然后返回孵化器。每48小时，从每一井取出并更换0.8毫升的骨细胞诱导介质。轻轻搅拌盘子，然后再将盘子返回到孵化器中。要开始预处理骨片，请使用微型电锯将新鲜的牛股骨皮层沿着纵轴切割成两厘米厚的切片。切割和研磨切片后，将切片浸入脱压水杯中清洗切片，并以 100 赫兹进行超声波检查一小时。重复此洗涤过程三次。将洗净的切片浸入75%酒精中两小时。然后，吸出酒精，在干净的平台上将每一张切片片暴露在紫外线下一小时。要开始对蓝色染色，请将预处理的骨片放入24孔板的孔中。在此之后，将培养培养中等到24井板中，将骨片浸入两小时。植物和诱导细胞，如前面证明。在四到六天出现骨质疏松后，用一毫升0.25摩尔氢氧化铵洗涤切片。将切片进行三次声波化，每次五分钟，以去除活细胞，并允许分析骨片上的吸附坑。然后，去除氢氧化铵，用每片1%托利丁蓝色溶液一毫升染色两分钟。用 PBS 清洗污渍切片。随机选择五个视图，并使用图像分析软件对吸收区域进行半定量分析。首先，在室温下，用每片2.5%谷胱甘肽的一毫升为骨片前缀两个小时。用一个氢氧化铵对前缀切片进行三次声波化，每次三分钟，以去除细胞。然后，取出氢氧化铵，用PBS洗三次骨片，每次洗涤持续12分钟。在室温下用1%的振荡将洗净的骨片固定两小时。执行文本协议中概述的乙醇梯度脱水。在此之后，用乙酰乙酸酯代替乙醇15分钟。用金铂涂覆切片，然后通过扫描电子显微镜进行分析。在这项研究中，大量的骨细胞前体被分离、纯化并成功诱导成为骨细胞。通过补充M-CSF和LFL，巨大的骨质在五至六天被看到。这些骨质的形成通过陷阱染色成功识别。大细胞和紫色细胞被视为具有多个核的 TRAP 阳性细胞。通过这种方法，在24个井板中，通常获得800个骨质原，每骨细胞含有多达30个核。与传统方法相比，这种改进的方法整个隔离过程可节省约 20 分钟。使用骨片评估骨吸收的活性是典型的体外方法。通过托卢伊丁蓝色染色，吸附区域被可视化为浅绿色。通过扫描电子显微镜可以清楚地观察到骨坑的结构和特性。CTR是骨细胞特异性细胞标记之一，对于识别骨细胞和研究骨细胞的形成至关重要。CTR 的正表达可以清楚地识别骨细胞，并将其与巨噬细胞多核生物区别。在免疫荧光测定中，CTR以绿色明确指示，而蓝色则表示细胞核。确保股骨和头骨不骨折，以避免失去骨髓。以前从未执行过这种技术的人，在帮助细胞操作解决方案时可能会挣扎。移液器尖端必须粘附在管内表面，并保持在内表面 45 度角。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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