Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81473692) til Yong ma. Forfatterne takker alle ansatte i Medical Research Center i det første kollegium af klinisk medicin i Nanjing Universitet for kinesisk medicin.

Alle de metoder, der involverer de dyr, der er beskrevet her, er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Nanjing University of Chinese Medicine.
1. opsætning af
<ol><li>Der tilberedes flere længde-og udskåret 1 mL pipettespidser (1 cm) og flere 1,5 mL mikrocentrifugerings glas. Sæt pipette spidserne og mikrocentrifugerings rørene på 103 kPa og 121 °C i 20 minutter, og sørg for, at de er sterile.</li>
	<li>Forbered en æske med is og flere sterile re...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

Evnen til at opnå og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grundlæggende færdighed for enhver forsker, der ønsker at studere knogle metabolisme, som kan hjælpe med at forstå mekanismerne i knogle absorberende sygdomme og udvikle nye terapeutiske midler. Den foreliggende undersøgelse beskrev en protokol med nogle ændringer baseret på tidligere metoder.
Ved at bruge pipettespidser og mikrocentrifugerings slanger til at opnå knoglemarv reducerede det i høj grad operationstiden...

Knogle homøostase er en kompleks fysiologisk proces, der reguleres af knogle resorbing osteoklaster og knogledannende osteoblaster1. En balance mellem osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet medieret gennem osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er meget vigtigt for at opretholde knogle sundhed og homøostase, fordi forstyrrelser i knogle homøostase kan føre til knoglesygdomme, såsom som unormal knoglevækst eller tab af knogletæthed. Som unikke knogleresorption celler, osteoklaster er vigtige i sygdomme relateret til unormal knogle ødelæggelse, herunder osteoporose, periodontitis, og periprosthetic osteolyse2,3.
Udviklingen af en osteoklast kultur er hovedsageligt opdelt i to etaper. De metoder, der blev fastlagt af Boyde et al.4 og Chambers et al.5 , bestod af første etape i 1980 ' erne. De opnåede relativt rigelige osteoklaster fra knoglerne hos nyfødte dyr, som er den hurtige remodeling periode. Osteoklaster frigives ved at fragmentere og omrøre knoglerne i et særligt medium. Men, cellerne opnået ved denne metode er lav i mængde og renhed. Den anden fase var udviklingen af langtrækkende kulturer af osteoklast dannelse, ved hjælp af hæmatopoietiske Lineage celler afledt af knoglemarv6. Cytokiner, såsom 1α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2) og parathyreoideahormon (pth), som tilsættes til dyrkningsmediet, virker gennem systemet af osteoblaster/stromale celler for at stimulere osteoklast-dannelsen på7,8 . Den renhed og mængde af osteoklaster, der opnås ved denne metode, kan imidlertid ikke opfylde behovene i forbindelse med moderne molekylær biologi forskning. Derefter, opdagelsen af makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator for nuklear faktor-κb ligand (rankl) gøre osteoclastogenesis lettere9,10,11, og metoden til at bruge M-CSF og RANKL til direkte at stimulere osteoklast dannelse er almindeligt anvendt rundt om i verden. Der er dog stadig nogle detaljer i den metodologi, der skal forbedres.
I øjeblikket kræver den hyppigst anvendte osteoklast kultur metode, som beskrevet af Marino et al.12 og Pei et al.13, ofte fjernelse af det omgivende væv omkring knoglen og bruger en steriliseret nål til at skylle knoglemarv hulrummet med afsluttede medier. Der er nogle ulemper ved denne proces, herunder det faktum, at (1) fjernelsen af det omgivende væv omkring knoglen kræver meget tid og stor kirurgisk teknik, (2) knoglerne er skrøbelige og kan føre til knoglemarv udstrømning, (3) knoglemarvs hulen kan være for lille til at skylle, og (4) der er risiko for nålestikskade. For at undgå disse problemer centrifugeres de rør, der indeholder knoglerne til knoglemarv, i stedet for nåle skylning af knoglemarven. Her introducerer vi en stabil og sikker metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure. Sammen med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteoklaster er store, fler umægede og knogle resorberende celler i monocyte-makrofag-Lineage, der dannes ved fusion af monocytter eller makrofag-prækursorer. Overdreven knogleresorption er en af de mest betydningsfulde cellulære mekanismer, der fører til osteolytiske sygdomme, herunder osteoporose, periodontitis og periprostetisk osteolyse. De vigtigste fysiologiske funktion af osteoklaster er at absorbere både hydroxyapatit mineral komponent og den organiske matrix af knogle, genererer den karakteristiske resorption udseende på overfladen af knogler. Der er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, især i voksne knogler. Nylige undersøgelser har fokuseret på, hvordan man får mere modne osteoklaster på mindre tid, hvilket altid har været et problem. Flere forbedringer i isolation og kultur teknikker har udviklet sig i laboratorier for at opnå mere modne osteoklaster. Her introducerer vi en metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure, ved hjælp af en særlig og enkel anordning. Med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster fra rotte knoglemarv, som er identificeret ved klassiske metoder.

Formålet med protokollen var at isolere og rense et stort antal osteoklast prækursorer bekvemt og inducere osteoklaster med succes. Ved at supplere med M-CSF og RANKL, blev gigantiske osteoklaster set på dag 5 – 6. Dannelsen af osteoklaster blev med held identificeret ved TRAP-farvning (figur 1a). Store og lilla celler blev betragtet som TRAP-positive celler med flere kerner (typisk ≥ tre kerner). Gennem denne metode, det var typisk at opnå 800 osteok...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolering, rensning og differentiering af Osteoklastprækursorer fra rotte knoglemarv

Osteoklaster er vævsspecifikke makrofag polykaryoner afledt af monocyte-makrofag-Lineage af hæmatopoietiske stamceller. Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer knoglemarvsceller, så der opnås store mængder osteoklaster, samtidig med at risikoen for ulykker, der findes i traditionelle metoder, mindskes.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Denne metode er betydelig, fordi det kan bruges til at opnå store mængder af fuldt differentierede osteoklaster in vitro. Den største fordel ved denne metode er, at den er mere stabil og sikker og isolerer knoglemarven på kortere tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure. Denne teknik kan give en stabil kilde til osteoklaster, som er det vigtige objekt for knogle metabolisk sygdom, herunder osteoporose, parodontitis, og periprosthetic osteolyse.Med mindre ændringer, denne protokol kan også være hensigtsmæssigt for at opnå forskellige former for knoglemarv afledt cellerne i rotter eller andre dyr. Til at begynde, placere aflivede dyr på et desinficeret bord i en liggende position. Ved hjælp af steril saks, foretage et snit cirka en centimeter i længden på det proksimale lårben til at skrælle huden.Dernæst dissekere lårben og skinneben. Skær forsigtigt og forsigtigt de bilaterale forbindelsesdele omkring hofte-, knæ- og ankelleddene for at isolere skinneben og lårben. Skær en del af vævet omkring knoglen, og sørg for at være grundig.Derefter placeres de rensede knogler i en skål med fem milliliter komplet kulturmedium. Brug steril saks til at afskære den lange knogle. Brug en en milliliter sprøjtenål til omhyggeligt at skylle marvhulen med 10 milliliter komplette medier, indtil marvhulen bliver hvid.Overfør denne celle suspension til en 50 milliliter rør og filtrere det med en 70 mikrometer si for at fjerne det resterende væv. Tilføj fem milliliter rødt blod lysis buffer, og inkubere cellerne på is i otte minutter. Herefter centrifugeres cellerne ved 250 gange G i fem minutter for at give cellepellet.Inspirer supernatanten og resuspend cellerne i 10 milliliter komplette medier. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne, og beregn den tid, der er brugt på de handlinger, der er foretaget for denne metode. Først skal du placere aflivede dyr på et desinficeret bord i en liggende position.Ved hjælp af steril saks, foretage et snit cirka en centimeter i længden på det proksimale lårben til at skrælle huden. Dernæst dissekere lårben og skinneben. Skær dele af væv omkring knoglen, selv om der ikke er behov for at fjerne vævet helt.Skyl skinneben og lårben med 12 milliliter PBS, og skær dem derefter i halve. Placer klippede skinneben og lårben i en forberedt en milliliter pipette spids, og læg dette i en forberedt mikro centrifuge rør. Centrifuge røret tre gange på 1, 000 gange G og ved fire grader Celsius i 45 sekunder.Derefter fjernes pipettespidsen, der indeholder knoglen, fra røret og efterlade knoglemarven i røret. Tilsæt 200 mikroliter AF PBS til røret, og pipette op og ned gentagne gange for at opløse marven grundigt. Overfør denne celle suspension til en 50 milliliter rør, og filtrere det med en 70 mikrometer si til at fjerne eventuelle resterende væv.Brug derefter et hæmocytometer til at tælle cellerne, og beregn den tid, der er brugt på de trin, der er taget i dette afsnit. Der tilsættes seks milliliter celleadskillelsesopløsning til et sterilt silikat centrifugalrør. Tilsæt den fortyndede celle suspension til røret.Efter tilføjelse af suspensionen vises en klar grænse mellem cellelaget og separationsopløsningen. Dernæst klæbe en pipette spids til den indvendige overflade af røret i en 45 graders vinkel. Centrifuge den lagdelte opløsning i en vandret centrifuge ved 500 gange G i 30 minutter.Derefter aspirere det overskyede andet lag, som indeholder målcellerne fra top til bund. Overfør målcellerne til et nyt rør. Tilsæt fem milliliter PBS til at vaske cellerne, og centrifuge ved 250 gange G i fem minutter.Gentag denne vaskeproces ved at tilsætte PBS og centrifugering for i alt tre vaske. Resuspend cell pellet med knoglemarv induktion medium. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne.Derefter tilsættes fem til otte milliliter knoglemarvsinuktionsmedium for at opnå en endelig celleopløsning på 300.000 celler pr. milliliter. Tilføj en milliliter af denne celleopløsning til hver brønd af en 24 brøndplade. Efter inkubering af cellerne ved 37 grader Celsius i 24 timer, let aspirere ud af mediet og tilsæt en milliliter osteoklast induktion medium til hver brønd.Ryst forsigtigt pladen og vend den tilbage til inkubatoren. Hver 48 timer, fjerne og erstatte 0,8 milliliter osteoklast induktion medium fra hver brønd. Ryst pladen forsigtigt, før den returneres til inkubatoren.For at begynde forbeberetning af knogleskiverne skal du bruge en mikro elektrisk sav til at skære den friske niorale knoglebarde i to centimeter tykke skiver langs længdeaksen. Efter skæring og slibning skiverne, vaske skiverne ved nedsænkning dem i et bæger af deioniseret vand og udsætte dem for ultralyd på 100 hertz i en time. Gentag denne vaskeproces tre gange.Nedsænk de vaskede skiver i 75% alkohol i to timer. Derefter aspirere alkoholen af og udsæt hvert dias af skiver til ultraviolet lys i en time på en ren platform. For at begynde toluidin blå farvning, placere forbehandlede knogle skiver i brøndene af de 24 godt plade.Efter dette, tilsæt kultur medium i 24 godt plade til at nedsænke knogleskiv i to timer. Plant og fremkalde cellerne som påvist tidligere. Efter osteoklaster er dukket op på fire til seks dage, vaske skiver med en milliliter 0,25 molar ammoniumhydroxid.Sonikere skiverne tre gange i fem minutter hver for at fjerne de levende celler og for at give mulighed for analyse af resorption gruber på knogleskiv. Derefter fjernes ammoniumhydroxid og plette skiverne med en milliliter 1% toluidin blå opløsning pr skive i to minutter. Vask pletskiverne med PBS.Vælg tilfældigt fem visninger, og brug en billedanalysesoftware til at udføre en semi-kvantitativ analyse af resorptionsområdet. Først præfiks knoglen skiver med en milliliter på 2,5% glutaraldehyd per skive i to timer ved stuetemperatur. Sonikere de præfiks skiver tre gange i tre minutter hver med en kindtand ammoniumhydroxid for at fjerne cellerne.Derefter fjernes ammoniumhydroxid og vaskes knogleskiverne tre gange med PBS, med hver vask, der varer 12 minutter. Fastgør de vaskede knogleskiver med 1%osmic syre i to timer ved stuetemperatur. Udfør ethanolgradientdehydrering som beskrevet i tekstprotokollen.Derefter udskiftes ethanolen med isoamylacetat i 15 minutter. Coat skiverne med guld palladium og analysere dem ved at scanne elektronmikroskopi. I denne undersøgelse blev et stort antal osteoklastprækursorer isoleret, renset og med succes induceret til at blive osteoklaster.Ved at supplere med M-CSF og RANKL, kæmpe osteoklaster ses på dag fem til seks. Dannelsen af disse osteoklaster er med succes identificeret ved fælde farvning. Store og lilla celler betragtes som TRAP-positive celler med flere kerner.Gennem denne metode er det typisk at opnå 800 osteoklaster, der indeholder så mange som 30 kerner pr. osteoklast i en 24 brøndplade. Sammenlignet med den traditionelle metode sparer denne forbedrede metode ca. 20 minutter under hele isolationsprocessen. Brug af knogleskiver til at vurdere aktiviteten af knoglereorption er en typisk in vitro-metode.Gennem toluidin blå farvning visualiseres resorptionsområdet som lysegrønt. Knoglegrudenes struktur og egenskaber kan tydeligt observeres ved at scanne elektronmikroskopi. CTR, en af osteoklasternes specifikke cellemarkører, er afgørende for at identificere osteoklaster og undersøge dannelsen af osteoklaster i knoglerne.Det positive udtryk for CTR identificerer klart osteoklaster og adskiller dem fra makrofagpolykaryoner. CTR er tydeligt angivet i immunfluorescens assays af en grøn farve, mens den blå angiver cellekerner. Sørg for ikke at fraktur lårben og skinneben for at undgå at miste knoglemarv.En person, der aldrig har udført denne teknik før, kan kæmpe, når medvirken cellerne operation løsning. Pipetten spidsen skal holdes på den indvendige overflade af røret og holdes i en 45 graders vinkel til den indre overflade.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og oprensning af kinesin fra Drosophila Embryoner

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclast Derivation fra Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolation, karakterisering og differentiering af Cardiac stamceller fra voksne mus hjerte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolation og differentiering af primære hvide og brune præadipocytter fra nyfødte mus

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...