Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (81473692) aan Yong ma. De auteurs danken alle medewerkers van het medisch onderzoekscentrum van het eerste college van klinische geneeskunde in Nanjing universiteit van de Chinese geneeskunde.

Alle methoden met betrekking tot de dieren hier beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en het gebruik Comite (DEC) van de Nanjing universiteit van de Chinese geneeskunde.
1. Setup
<ol><li>Maak een aantal in de lengte gesneden 1 mL pipet tips (1 cm) en enkele 1,5 mL microcentrifuge tubes. Zet de pipet tips en de microcentrifuge tubes bij 103 kPa en 121 °C gedurende 20 min en zorg ervoor dat ze steriel zijn.</li>
	<li>Bereid een doos ijs en een aantal steriele gerechten...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

De bekwaamheid om osteoclasten in vitro te verkrijgen en te bestuderen is een kritieke en fundamentele vaardigheid voor om het even welke onderzoeker die beenmetabolisme wil bestuderen, die kan helpen de mechanismen van been-absorberende ziekten begrijpen en nieuwe therapeutische agenten ontwikkelen. De huidige studie beschreef een protocol met een aantal wijzigingen op basis van eerdere methoden.
Door het gebruik van pipet tips en microcentrifuge buizen om het beenmerg te verkrijgen, verminde...

De homeostase van het been is een complex fysiologisch proces dat door been-resorbing osteoclasten en been-vormt osteoblasten1wordt geregeld. Een evenwicht tussen osteoblastic en osteoclastic activiteit bemiddeld door osteoblasten en osteoclasten, respectievelijk, is zeer essentieel voor het behoud van gezondheid van de botten en homeostase, omdat verstoringen in het bot homeostase zou kunnen leiden tot bot ziekten, zoals Als abnormale beengroei of verlies van botdichtheid. Als unieke Bone-resorptie cellen, osteoclasten zijn belangrijk in ziekten in verband met abnormale bot vernietiging, met inbegrip van osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse2,3.
De ontwikkeling van een osteoclast cultuur is hoofdzakelijk verdeeld in twee stadia. De methoden opgericht door Boyde et al.4 en Chambers et al.5 componeerde de eerste fase in de jaren 1980. Zij verkregen vrij overvloedige osteoclasten van de beenderen van pasgeboren dieren, die de snelle het remodelleren periode is. Osteoclasten worden vrijgegeven door het versplinteren en roeren de botten in een speciaal medium. Echter, de cellen verkregen door deze methode zijn laag in hoeveelheid en zuiverheid. De tweede fase was de ontwikkeling van lange-afstands culturen van osteoclast vorming, met behulp van hematopoietische Lineage cellen afgeleid van beenmerg6. Cytokines, zoals 1α, 25-dihydroxyvitamine D3, prostaglandine E2 (PGE-2), en bijschildklier hormoon (pth), die worden toegevoegd in de cultuurmedium, handelen via het systeem van osteoblasten/stromale cellen te stimuleren osteoclast vorming7,8 . Echter, de zuiverheid en kwantiteit van osteoclasten verkregen door deze methode niet kan voldoen aan de behoeften van de moderne moleculaire biologie onderzoek. Dan is de ontdekking van de macrofagen Colony-stimulerende factor (M-CSF) en receptor Activator voor nucleaire factor-κB ligand (Rank) maken osteoclastogenesis makkelijker9,10,11, en de methode van het gebruik van M-CSF en RANKe om direct te stimuleren osteoclast vorming wordt veel gebruikt over de hele wereld. Er zijn echter nog enkele details in de methodologie die moeten worden verbeterd.
Momenteel is de meest gebruikte osteoclast cultuurmethode, zoals beschreven door Marino et al.12 en Pei et al.13, vereist vaak de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot en maakt gebruik van een gesteriliseerde naald om de mergholte spoelen met voltooide media. Er zijn een aantal nadelen aan dit proces, met inbegrip van het feit dat (1) de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot vergt veel tijd en grote chirurgische techniek, (2) de botten zijn kwetsbaar en kan leiden tot beenmerg uitstroom, (3) het beenmerg Holte zou kunnen worden te klein om te spoelen, en (4) is er een risico van naald stok letsel. Om deze problemen te voorkomen, centrifugeren we de buizen met de botten voor het beenmerg in plaats van naald-blozen het beenmerg. Hier introduceren we een stabiele en veilige methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure. Samen met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteoclasten zijn grote, multinucleaire, en resorbing cellen van de monocyten-macrofagen lijn die gevormd worden door de fusie van monocyten of macrofagen precursoren. Overmatige been resorptie is een van de meest significante cellulaire mechanismen die leiden tot osteolytic ziekten, waaronder osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse. De belangrijkste fysiologische functie van osteoclasten is het absorberen van zowel de hydroxyapatiet minerale component en de organische matrix van het bot, het genereren van de karakteristieke resorptie verschijning op het oppervlak van de botten. Er zijn betrekkelijk weinig osteoclasten in vergelijking met andere cellen in het lichaam, vooral in volwassen botten. Recente studies hebben zich gericht op hoe meer volwassen osteoclasten te verkrijgen in minder tijd, die altijd al een probleem. Verschillende verbeteringen in de isolatie en cultuurtechnieken hebben ontwikkeld in laboratoria om meer volwassen osteoclasten te verkrijgen. Hier introduceren we een methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure, met behulp van een speciaal en eenvoudig apparaat. Met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten van Rat beenmerg, die worden geïdentificeerd door klassieke methoden.

Het doel van het protocol was om grote aantallen osteoclast precursoren gemakkelijk te isoleren en te zuiveren en osteoclasten met succes te induceren. Door aan te vullen met M-CSF en RANK, werden Giant osteoclasten gezien op dagen 5 – 6. De vorming van osteoclasten werd met succes geïdentificeerd door TRAP kleuring (Figuur 1a). De grote en purpere cellen werden beschouwd als val-positieve cellen met veelvoudige kernen (typisch ≥ drie kernen). Door deze ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Deze methode is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om grote hoeveelheden volledig gedifferentieerde osteoclasten in vitro te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het stabieler en veiliger is en isoleert beenmerg in minder tijd en met minder inspanningen in vergelijking met de traditionele procedure. Deze techniek kan een stabiele bron van osteoclasten, die het belangrijke object van bot metabole ziekte, met inbegrip van osteoporose, parodontitis, en periprosthetische osteolyse.Met kleine wijzigingen kan dit protocol ook geschikt zijn voor het verkrijgen van verschillende soorten beenmerg afgeleid van de cellen bij ratten of andere dieren. Om te beginnen plaatst u geëuthanaseerde dieren op een gedesinfecteerd bord in een supinepositie. Met behulp van steriele schaar, maak een incisie ongeveer een centimeter in lengte op het proximale dijbeen om de huid te schillen.Ontleed vervolgens de femurs en scheenbeen. Snijd voorzichtig en voorzichtig de bilaterale verbindingsdelen rond de heup-, knie- en enkelgewrichten om de scheenbeen en femurs te isoleren. Snijd een deel van de weefsels rond het bot, zorg ervoor dat grondig.Plaats vervolgens de gereinigde botten in een schaal met vijf milliliter van compleet kweekmedium. Gebruik steriele schaar af te snijden van het lange bot. Gebruik een een milliliter spuitnaald om de mergholte zorgvuldig door te spoelen met 10 milliliter complete media totdat de mergholte wit wordt.Breng deze celsuspensie over naar een buis van 50 milliliter en filter deze met een zeef van 70 micrometer om het resterende weefsel te verwijderen. Voeg vijf milliliter rode bloedlyse buffer, en incubeer de cellen op ijs gedurende acht minuten. Daarna, centrifugeren de cellen op 250 keer G gedurende vijf minuten om de cel pellet opleveren.Aspirate de supernatant en resuspend de cellen in 10 milliliter van volledige media. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en bereken de tijd die wordt besteed aan de acties die voor deze methode zijn ondernomen. Plaats eerst geëuthanaseerde dieren op een gedesinfecteerd bord in een supinepositie.Met behulp van steriele schaar, maak een incisie ongeveer een centimeter in lengte op het proximale dijbeen om de huid te schillen. Ontleed vervolgens de femurs en scheenbeen. Snijd de delen van de weefsels rond het bot af, maar het is niet nodig om het weefsel volledig te verwijderen.Spoel de scheenbeen en femurs met 12 milliliter PBS en snijd ze vervolgens doormidden. Plaats de geknipte scheenbeen en femurs in een voorbereide een milliliter pipettip en plaats dit in een bereide microcentrifugebuis. Centrifuge de buis drie keer op 1.000 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 45 seconden.Verwijder hierna de pipettip met het bot uit de buis, waardoor het beenmerg in de buis achterblijft. Voeg 200 microliter PBS aan de buis toe en pipet herhaaldelijk op en neer om het merg grondig te desintegreren. Breng deze celsuspensie over naar een buis van 50 milliliter en filter deze met een zeef van 70 micrometer om de resterende weefsels te verwijderen.Gebruik vervolgens een hemocytometer om de cellen te tellen en de tijd te berekenen die wordt besteed aan de stappen die in deze sectie zijn genomen. Voeg zes milliliter celscheidingsoplossing toe aan een steriele gesilificeerde centrifugaalbuis. Voeg de verdunde celsuspensie toe aan de buis.Na toevoeging van de suspensie verschijnt er een duidelijke limiet tussen de cellaag en de scheidingsoplossing. Vervolgens, hechten een pipet tip aan het binnenoppervlak van de buis in een hoek van 45 graden. Centrifugeren de gelaagde oplossing in een horizontale centrifuge op 500 keer G gedurende 30 minuten.Daarna de troebele tweede laag aanzuigen die de doelcellen van boven naar beneden bevat. Breng de doelcellen over naar een nieuwe buis. Voeg vijf milliliter PBS toe om de cellen te wassen en centrifuge vijf minuten op 250 keer G.Herhaal dit wasproces door PBS en centrifuging toe te voegen voor een totaal van drie wasbeurten. Resuspend de cel pellet met beenmerg inductie medium. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.Voeg vervolgens vijf tot acht milliliter beenmerginductiemedium toe om een definitieve celoplossing van 300.000 cellen per milliliter te verkrijgen. Voeg een milliliter van deze cel oplossing aan elke put van een 24 put plaat. Na het uitbroeden van de cellen op 37 graden Celsius gedurende 24 uur, zachtjes aspirate uit het medium en voeg een milliliter van osteoclast inductie medium aan elke put.Roer de plaat voorzichtig en breng deze terug naar de couveuse. Elke 48 uur, verwijderen en vervangen 0,8 milliliter van osteoclast inductie medium van elke put. Roer de plaat voorzichtig voordat u deze terugplaatst naar de couveuse.Om te beginnen met de voorbehandeling van de botplakken, gebruik een micro-elektrische zaag om de verse boviene femorale botschors te snijden in twee centimeter dikke plakjes langs de lengteas. Na het snijden en malen van de plakjes, was de plakjes door ze onder te dompelen in een beker van gedeïsiseerd water en ze te onderwerpen aan echografie op 100 hertz gedurende een uur. Herhaal dit wasproces drie keer.Dompel de gewassen plakjes twee uur onder in 75%alcohol. Dan, aspirate uit de alcohol en bloot elke dia van plakjes aan ultraviolet licht voor een uur op een schoon platform. Om te beginnen toluidine blauwe vlekken, plaats de voorbehandelde bot plakjes in de putten van de 24 put plaat.Voeg hierna cultuurmedium toe aan de 24 putplaat om de botschijfjes twee uur onder te dompelen. Plant en induceer de cellen zoals eerder aangetoond. Nadat osteoclasten zijn verschenen op vier tot zes dagen, was de plakjes met een milliliter van 0,25 molaire ammoniumhydroxide.Sonicate de plakjes drie keer gedurende vijf minuten elk om de levende cellen te verwijderen en om voor de analyse van de resorptie putten op de bot plakjes mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de ammoniumhydroxide en bevlek de plakjes met een milliliter van 1%toluidine blauwe oplossing per schijf gedurende twee minuten. Was de vlekken plakjes met PBS.Selecteer willekeurig vijf weergaven en gebruik een beeldanalysesoftware om een semi-kwantitatieve analyse van het resorptiegebied uit te voeren. Ten eerste, prefix de botplakken met een milliliter van 2,5%glutaraldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Soniceer de vooraf vastgestelde plakjes drie keer gedurende drie minuten elk met een molaire ammoniumhydroxide om de cellen te verwijderen.Verwijder vervolgens de ammoniumhydroxide en was de botschijfjes drie keer met PBS, waarbij elke was 12 minuten duurt. Bevestig de gewassen botplakjes met 1%osmisch zuur gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voer ethanolgradiënt uitdroging uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Vervang hierna de ethanol gedurende 15 minuten door isoamylacetaat. Bestrijk de plakjes met goudpalladium en analyseer ze door elektronenmicroscopie te scannen. In deze studie werden grote aantallen osteoclast precursoren geïsoleerd, gezuiverd en met succes geïnduceerd tot osteoclasten.Door aan te vullen met M-CSF en RANKL, gigantische osteoclasten worden gezien op dag vijf tot zes. De vorming van deze osteoclasten wordt met succes geïdentificeerd door val vlekken. Grote en paarse cellen worden beschouwd als TRAP positieve cellen met meerdere kernen.Door middel van deze methode, het is typisch voor het verkrijgen van 800 osteoclasten met maar liefst 30 kernen per osteoclast in een 24 goed plaat. In vergelijking met de traditionele methode bespaart deze verbeterde methode ongeveer 20 minuten tijdens het hele isolatieproces. Het gebruik van botsegmenten om de activiteit van botresorptie te beoordelen is een typische in vitro-methode.Door toluidine blauwe vlekken wordt het resorptiegebied gevisualiseerd als lichtgroen. De structuur en kenmerken van de botputten kunnen duidelijk worden waargenomen door elektronenmicroscopie te scannen. CTR, een van de osteoclasten specifieke cel markers, is van cruciaal belang om osteoclasten te identificeren en de studie van de vorming van osteoclasten in het bot.De positieve expressie van CTR identificeert osteoclasten duidelijk en onderscheidt ze van macrofaagpolylekaryons. CTR wordt duidelijk aangegeven in de immunofluorescentietesten door een groene kleur, terwijl het blauw de celkernen aangeeft. Zorg ervoor dat u de femurs en de scheenbeen niet breekt om te voorkomen dat beenmerg verloren gaat.Een persoon die nog nooit heeft uitgevoerd deze techniek voor kan worstelen bij het helpen van de cellen operatie oplossing. De pipetpunt moet aan het binnenoppervlak van de buis worden vastgehouden en in een hoek van 45 graden naar het binnenoppervlak worden gehouden.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Sturen van hematopoietische cellen naar het beenmerg

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...