Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation de la Chine (81473692) à Yong ma. Les auteurs remercient tout le personnel du centre de recherche médicale du premier collège de médecine clinique à l’Université de la médecine chinoise de Nanjing.

Toutes les méthodes impliquant les animaux décrits ici sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de médecine chinoise de Nanjing.
1. Configuration de l’installation
<ol><li>Préparer plusieurs pointes de pipette de 1 mL (1 cm) et plusieurs tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de façon longitudinale. Mettre les pointes de pipette et les tubes de microcentrifugation à 103 kPa et 121 ° c pendant 20 min et s’assu...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

La capacité d’obtenir et d’étudier les ostéoclastes in vitro est une compétence critique et fondamentale pour tout chercheur souhaitant étudier le métabolisme osseux, qui peut aider à comprendre les mécanismes des maladies absorbant les os et à développer de nouveaux agents thérapeutiques. La présente étude décrivait un protocole avec quelques modifications fondées sur des méthodes antérieures.
En utilisant des pointes de pipette et des tubes de microcentrifugation pour ob...

L’homéostasie osseuse est un processus physiologique complexe qui est régulé par des ostéoblastes de résorbage osseux et des ostéoclastes formant des os1. Un équilibre entre l’activité ostéoblastique et l’ostéoclaste induite par les ostéobenzènes et les ostéoclastes, respectivement, est très essentiel pour maintenir la santé osseuse et l’homéostasie, car les perturbations de l’homéostasie osseuse peuvent entraîner des maladies osseuses, telles comme une croissance osseuse anormale ou une perte de densité osseuse. En tant que cellules uniques de résorption osseuse, les ostéoclastes sont importantes dans les maladies liées à la destruction osseuse anormale, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique2,3.
Le développement d’une culture ostéosclast est principalement divisé en deux étapes. Les méthodes établies par Boyde et coll.4 et Chambers et coll.5 composaient la première étape dans les années 1980. Ils ont obtenu des ostéoclastes relativement abondantes à partir des os des animaux nouveau-nés, qui est la période de remodelage rapide. Les ostéoclastes sont libérés par la fragmentation et l’agitation des os dans un milieu spécial. Cependant, les cellules obtenues par cette méthode sont faibles en quantité et en pureté. La deuxième étape a été le développement de cultures à longue distance de formation d’ostéoclast, utilisant des cellules de lignée hématopoïétique dérivées de la moelle osseuse6. Les cytokines, telles que la 1 α, la 25-dihydroxyvitamine D3, la prostaglandine E2 (PGE-2) et l’hormone parathyroïde (PTH), qui sont ajoutées dans le milieu de culture, agissent par l’intermédiaire du système des cellules ostéoblastes/stromales pour stimuler la formation d’ostéoclast7,8 . Cependant, la pureté et la quantité d’ostéoclastes obtenues par cette méthode ne peuvent pas répondre aux besoins de la recherche moderne en biologie moléculaire. Ensuite, la découverte du facteur stimulant des colonies de macrophages (M-CSF) et de l’activateur du récepteur pour le ligand nucléaire de facteur-κB (RANKL) rend l’ostéoclastogenèse plus facile9,10,11, et la méthode d’utilisation de m-CSF et RANKL pour stimuler directement la formation d’ostéosclast est largement utilisé dans le monde entier. Cependant, il y a encore quelques détails dans la méthodologie qui doivent être améliorés.
Actuellement, la méthode de culture d’ostéoclast la plus couramment utilisée, telle que décrite par Marino et al.12 et PEI et al.13, nécessite souvent l’enlèvement du tissu environnant autour de l’os et utilise une aiguille stérilisée pour rincer la cavité médullaire avec les médias complétés. Il y a quelques inconvénients à ce processus, y compris le fait que (1) l’enlèvement du tissu environnant autour de l’OS nécessite beaucoup de temps et une grande technique chirurgicale, (2) les os sont fragiles et peuvent conduire à l’écoulement de la moelle osseuse, (3) la cavité de la moelle osseuse pourrait être trop petit pour rincer, et (4) il y a un risque de blessure de bâton d’aiguille. Pour éviter ces problèmes, nous centrifuger les tubes contenant les os pour la moelle osseuse au lieu de l’aiguille-rinçage de la moelle osseuse. Ici, nous introduisons une méthode stable et sûre qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort comparé à la procédure traditionnelle. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Les ostéoclastes sont de grandes cellules multinucléées et de résorbage osseux de la lignée monocyte-macrophages qui sont formées par la fusion de monocytes ou de précurseurs de macrophages. La résorption osseuse excessive est l’un des mécanismes cellulaires les plus significatifs conduisant à des maladies ostéolytiques, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique. La principale fonction physiologique des ostéoclastes est d’absorber à la fois la composante minérale de l’hydroxyapatite et la matrice organique de l’OS, générant l’aspect de la résorption caractéristique sur la surface des os. Il ya relativement peu d’ostéoclastes par rapport à d’autres cellules dans le corps, en particulier dans les os adultes. Des études récentes ont porté sur la façon d’obtenir des ostéoclastes plus matures en moins de temps, ce qui a toujours été un problème. Plusieurs améliorations dans les techniques d’isolement et de culture se sont développées dans les laboratoires afin d’obtenir des ostéoclastes plus matures. Ici, nous introduisons une méthode qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort par rapport à la procédure traditionnelle, à l’aide d’un dispositif spécial et simple. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés de la moelle osseuse de rat, qui sont identifiés par des méthodes classiques.

Le but du protocole était d’isoler et de purifier un grand nombre de précurseurs d’ostéoclast commodément et d’induire les ostéoclastes avec succès. En complétant avec M-CSF et RANKL, des ostéoclastes géants ont été observés les jours 5 à 6. La formation d’ostéoclastes a été identifiée avec succès par la coloration TRAP (figure 1a). Les cellules grandes et violettes ont été considérées comme des cellules à piège positif avec pl...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Cette méthode est significative parce qu’elle peut être utilisée pour obtenir de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés in vitro. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est plus stable et sûre et isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’efforts par rapport à la procédure traditionnelle. Cette technique peut fournir une source stable d’ostéoclastes, qui sont l’objet important de la maladie métabolique osseuse, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprothétique.Avec des modifications mineures, ce protocole peut également être approprié pour obtenir divers types de moelle osseuse dérivée des cellules chez les rats ou d’autres animaux. Pour commencer, placez les animaux euthanasiés sur une planche désinfectée dans une position de supination. À l’aide de ciseaux stériles, faire une incision d’environ un centimètre de longueur au fémur proximal pour peler la peau.Ensuite, disséquez les fémurs et les tibias. Coupez soigneusement et doucement les parties bilatérales de la connexion autour des articulations de la hanche, du genou et de la cheville pour isoler les tibias et les fémurs. Couper une partie des tissus autour de l’os, en s’assurant d’être complet.Ensuite, placez les os nettoyés dans un plat avec cinq millilitres de milieu de culture complet. Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’os long. Utilisez une aiguille de seringue d’un millilitre pour rincer soigneusement la cavité de la moelle avec 10 millilitres de médias complets jusqu’à ce que la cavité de la moelle soit blanchie.Transférez cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et filtrez-la à l’aide d’une passoire de 70 micromètres pour enlever le tissu restant. Ajouter cinq millilitres de tampon de lyse de sang rouge et incuber les cellules sur la glace pendant huit minutes. Après cela, centrifuger les cellules à 250 fois G pendant cinq minutes pour donner la pastille cellulaire.Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en 10 millilitres de médias complets. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et calculez le temps consacré aux actions prises pour cette méthode. Tout d’abord, placer les animaux euthanasiés sur une planche désinfectée dans une position supine.À l’aide de ciseaux stériles, faire une incision d’environ un centimètre de longueur au fémur proximal pour peler la peau. Ensuite, disséquez les fémurs et les tibias. Couper les parties des tissus autour de l’os, mais il n’est pas nécessaire d’enlever le tissu complètement.Rincer les tibias et les fémurs avec 12 millilitres de PBS, puis les couper en deux. Placez les tibias et les fémurs coupés en deux dans une pointe de pipette préparée d’un millilitre, et placez-la dans un tube de micro centrifugeuse préparé. Centrifugeuse le tube trois fois à 1000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 45 secondes.Après cela, retirez la pointe pipette contenant l’os du tube, en laissant la moelle osseuse dans le tube. Ajouter 200 microlitres de PBS au tube, et pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour désintégrer la moelle à fond. Transférez cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et filtrez-la à l’aide d’une passoire de 70 micromètres pour enlever les tissus restants.Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules, et calculer le temps passé sur les étapes prises dans cette section. Ajouter six millilitres de solution de séparation cellulaire à un tube centrifuge silicifié stérile. Ajouter la suspension cellulaire diluée au tube.Après l’ajout de la suspension, une limite claire apparaîtra entre la couche de cellules et la solution de séparation. Ensuite, adhérez une pointe de pipette à la surface intérieure du tube à un angle de 45 degrés. Centrifugeuse la solution superposée dans une centrifugeuse horizontale à 500 fois G pendant 30 minutes.Après cela, aspirez la deuxième couche nuageuse qui contient les cellules cibles de haut en bas. Transférer les cellules cibles dans un nouveau tube. Ajouter cinq millilitres de PBS pour laver les cellules, et centrifugeuse à 250 fois G pendant cinq minutes.Répétez ce processus de lavage en ajoutant pbs et centrifugeuse pour un total de trois lavages. Resuspendez la pastille cellulaire avec le milieu d’induction de moelle osseuse. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.Ensuite, ajoutez cinq à huit millilitres de milieu d’induction de moelle osseuse pour obtenir une solution finale de cellules de 300 000 cellules par millilitre. Ajouter un millilitre de cette solution cellulaire à chaque puits d’une plaque de puits de 24 puits. Après avoir incubé les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, aspirez doucement le milieu et ajoutez un millilitre de milieu d’induction ostéoclaste à chaque puits.Agitez doucement la plaque et retournez-la à l’incubateur. Toutes les 48 heures, retirer et remplacer 0,8 millilitres de milieu d’induction ostéoclaste de chaque puits. Agiter délicatement la plaque avant de la retourner à l’incubateur.Pour commencer à pré-traiter les tranches osseuses, utilisez une scie micro électrique pour couper le cortex osseux fémoral bovin frais en tranches de deux centimètres d’épaisseur le long de l’axe longitudinal. Après avoir coupé et broyé les tranches, lavez les tranches en les immergeant dans un bécher d’eau déionisée et en les soumettant à l’échographie à 100 hertz pendant une heure. Répétez ce processus de lavage trois fois.Plonger les tranches lavées dans 75% d’alcool pendant deux heures. Ensuite, aspirez l’alcool et exposez chaque diapositive de tranches à la lumière ultraviolette pendant une heure sur une plate-forme propre. Pour commencer à colorer le bleu toluidine, placez les tranches osseuses prétentiées dans les puits de la plaque de 24 puits.Après cela, ajouter le milieu de culture dans la plaque de 24 puits pour immerger les tranches osseuses pendant deux heures. Plantez et induisez les cellules comme démontré précédemment. Après que les ostéoclastes sont apparus à quatre à six jours, lavez les tranches avec un millilitre d’hydroxyde molaire d’ammonium de 0,25.Sonicate les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune pour enlever les cellules vivantes et pour permettre l’analyse des fosses de résorption sur les tranches osseuses. Ensuite, retirer l’hydroxyde d’ammonium et tacher les tranches avec un millilitre de 1% de solution bleue toluidine par tranche pendant deux minutes. Laver les tranches de tache avec du PBS.Sélectionnez au hasard cinq vues et utilisez un logiciel d’analyse d’image pour effectuer une analyse semi-quantitative de la zone de résorption. Tout d’abord, préfixez les tranches d’os avec un millilitre de 2,5% de glutaraldehyde par tranche pendant deux heures à température ambiante. Sonicate les tranches préfixées trois fois pendant trois minutes chacune avec un hydroxyde d’ammonium molaire pour enlever les cellules.Ensuite, retirez l’hydroxyde d’ammonium et lavez les tranches d’os trois fois avec du PBS, chaque lavage d’une durée de 12 minutes. Fixer les tranches d’os lavées avec 1% d’acide osmique pendant deux heures à température ambiante. Effectuer la déshydratation du gradient d’éthanol tel que décrit dans le protocole textuel.Après cela, remplacer l’éthanol par de l’acétate d’isoamyle pendant 15 minutes. Enduire les tranches de palladium doré et les analyser en scannant la microscopie électronique. Dans cette étude, un grand nombre de précurseurs ostéoclastes ont été isolés, purifiés et induits avec succès pour devenir ostéoclastes.En complétant avec M-CSF et RANKL, ostéoclastes géants sont vus les jours cinq à six. La formation de ces ostéoclastes est identifiée avec succès par la coloration des pièges. Les cellules grandes et violettes sont considérées comme des cellules positives TRAP avec plusieurs noyaux.Grâce à cette méthode, il est typique d’obtenir 800 ostéoclastes contenant jusqu’à 30 noyaux par ostéoclaste dans une plaque de puits 24. Par rapport à la méthode traditionnelle, cette méthode améliorée permet d’économiser environ 20 minutes pendant tout le processus d’isolement. L’utilisation de tranches osseuses pour évaluer l’activité de la résorption osseuse est une méthode in vitro typique.Grâce à la coloration bleue toluidine, la zone de résorption est visualisée comme vert clair. La structure et les caractéristiques des fosses osseuses peuvent être clairement observées en scannant la microscopie électronique. CTR, l’un des marqueurs cellulaires spécifiques aux ostéoclastes, est essentiel pour identifier les ostéoclastes et étudier la formation d’ostéoclastes dans les os.L’expression positive du CTR identifie clairement les ostéoclastes et les distingue des polycaryons macrophages. CTR est clairement indiqué dans les analyses d’immunofluorescence par une couleur verte, tandis que le bleu indique les noyaux cellulaires. Assurez-vous de ne pas fracturer les fémurs et les tibias pour éviter de perdre la moelle osseuse.Une personne qui n’a jamais effectué cette technique avant peut lutter lors de l’aide à la solution de fonctionnement des cellules. La pointe de la pipette doit être adhérente à la surface intérieure du tube et maintenue à un angle de 45 degrés par rapport à la surface intérieure.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

Biologie

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