Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81473692) an Yong Ma unterstützt. Die Autoren danken allen Mitarbeitern des Medical Research Center des Ersten College of Clinical Medicine an der Nanjing University of Chinese Medicine.

Alle Methoden, die die hier beschriebenen Tiere betreffen, werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Nanjing University of Chinese Medicine genehmigt.
1. Einrichtung
<ol><li>Bereiten Sie mehrere längs geschnittene 1 ML-Pipettenspitzen (1 cm) und mehrere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren vor. Die Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren auf 103 kPa und 121 ° C 20 min anbraten und für ihre sterile Sorte sorgen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Schachtel mit Eis und mehre...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

Die Fähigkeit, Osteoklasten in vitro zu erhalten und zu studieren, ist eine entscheidende und grundlegende Fähigkeit für jeden Forscher, der den Knochenstoffwechsel untersuchen möchte, was helfen kann, die Mechanismen von knochenabsorbierenden Krankheiten zu verstehen und neue therapeutische Wirkstoffe zu entwickeln. Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll mit einigen Änderungen, die auf früheren Methoden basieren.
Durch den Einsatz von Pipette-Spitzen und Mikrozentrifugenröhren ...

Knochen-Haffinase ist ein komplexer physiologischer Prozess, der durch knochenförmige Osteoklasten und knochenbildende Osteoblasten 1reguliert wird. Ein Gleichgewicht zwischen osteoblastischer und osteolastischer Aktivität, die durch Osteoblasten bzw. Osteoklasten vermittelt wird, ist für die Erhaltung der Knochengesundheit und der Homöostase von entscheidender Bedeutung, da Störungen in der Knochenhomöose zu Knochenkrankheiten führen können, wie Als abnormales Knochenwachstum oder Verlust der Knochendichte. Als einzigartige Knochenresorptionszellen sind Osteoklasten wichtig bei Krankheiten, die mit abnormer Knochenzerstörung zusammenhängen, darunter Osteoporose, Parodontitis und periprothetische Osteolyse2,3.
Die Entwicklung einer Osteoclast-Lunst-Kultur ist vor allem in zwei Stufen unterteilt. Die von Boyde et al. 4 und Chambers et al. 5 errichteten Methoden komponierten die erste Etappe in den 1980er Jahren. Sie erhielten relativ reichlich Osteoklasten aus den Knochen von neugeborenen Tieren, was die schnelle Umbauzeit ist. Osteoklasten werden freigesetzt, indem sie die Knochen in einem speziellen Medium zersplittern und rühren. Die Zellen, die durch diese Methode gewonnen werden, sind jedoch in der Menge und Reinheit niedrig. Die zweite Stufe war die Entwicklung von Langstreckenkulturen der Osteoklute-Bildung, wobei hämatopoetische Abstammungszellenaus dem Knochenmark 6 verwendet wurden. Zytokine, wie 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3, Prostaglandin E2 (PGE-2) und Parathyroid-Hormon (PTH), die in das Kulturmedium aufgenommen werden, wirken durch das System von Osteoblasts/Stromzellen, um Osteoklastbildung zu stimulieren7,8 . Die Reinheit und Menge der durch diese Methode gewonnenen Osteoklasten kann jedoch nicht den Anforderungen der modernen molekularbiologischen Forschung entsprechen. Dann, die Entdeckung der Makrophage Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Rezeptor-Aktivator für Kernfaktor--B-Ligand (RANKL) machen die Osteoclastogenese einfacher9,10,11, unddie Methode der Verwendung M-CSF und RANKL, um die Osteoklute-Formation direkt zu stimulieren, ist auf der ganzen Welt weit verbreitet. Allerdings gibt es noch einige Details in der Methodik, die verbessert werden müssen.
Derzeit ist die am häufigsten verwendete Osteoclast-Kultur-Methode, wie sie von Marino et al. 12 und Pei et al.13beschrieben wird, oft die Entfernung des umgebenden Gewebes um den Knochen erfordert und verwendet eine sterilisierte Nadel, um die Markenhöhle mit Abgeschlossene Medien. Es gibt einige Nachteile dieses Prozesses, einschließlich der Tatsache, dass (1) die Entfernung des umgebenden Gewebes um den Knochen erfordert viel Zeit und große chirurgische Technik, (2) die Knochen sind zerbrechlich und kann zu Knochenmarkabfluss führen, (3) die Knochenmarkhöhle könnte Zu klein, um zu spülen, und (4) es besteht die Gefahr einer Nadelstichverletzung. Um diese Probleme zu vermeiden, zentrifugen wir die Rohre, die die Knochen enthalten, für Knochenmark, anstatt das Knochenmark zu spülen. Hier führen wir eine stabile und sichere Methode ein, die das Knochenmark in kürzerer Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert. Zusammen mit der Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation erhaltenwir große Mengen voll differenzierter Osteoklasten in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteoklasten sind große, multinuclevere und knochresorbierende Zellen der Monozyten-Mrophage-Linie, die durch die Verschmelzung von Monozyten oder Makrophagen gebildet werden. Exzessiver Knochenabbau ist einer der wichtigsten zellulären Mechanismen, die zu osteolytischen Erkrankungen führen, darunter Osteoporose, Parodontitis und periprothetische Osteolyse. Die wichtigste physiologische Funktion von Osteoklasten besteht darin, sowohl die hydroxyapatite Mineralkomponente als auch die organische Matrix des Knochens zu absorbieren und so das charakteristische Resorptionsbild auf der Knochenoberfläche zu erzeugen. Es gibt relativ wenige Osteoklasten im Vergleich zu anderen Zellen im Körper, vor allem in erwachsenen Knochen. Neuere Studien konzentrierten sich darauf, wie man reifere Osteoklasten in weniger Zeit erhält, was schon immer ein Problem war. In Laboren haben sich mehrere Verbesserungen der Isolations-und Kulturtechniken entwickelt, um reifere Osteoklasten zu erhalten. Hier führen wir eine Methode ein, die das Knochenmark in kürzerer Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert, mit einem speziellen und einfachen Gerät. Durch den Einsatz der Dichte-Gradientenzentrifugation erhalten wir große Mengen voll differenzierter Osteoklasten aus dem Rattenknochenmark, die durch klassische Methoden gekennzeichnet sind.

Der Zweck des Protokolls war es, eine große Anzahl von Osteoklastvorläufern bequem zu isolieren und zu reinigen und Osteoklasten erfolgreich zu induzieren. Ergänzend mit M-CSF und RANKL wurden an den Tagen 5 – 6 riesige Osteoklasten zu sehen sein. Die Bildung von Osteoklasten wurde durch die TRAP-Färbung(Abbildung 1A) erfolgreich identifiziert. Große und violette Zellen galten als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise drei Kerne). Du...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Diese Methode ist wichtig, weil sie verwendet werden kann, um große Mengen vollständig differenzierter Osteoklasten in vitro zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie stabiler und sicherer ist und das Knochenmark in weniger Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert. Diese Technik kann eine stabile Quelle von Osteoklasten bieten, die das wichtige Objekt der Knochenstoffwechselerkrankungen sind, einschließlich Osteoporose, Parodontitis und periprosthetische Osteolyse.Bei geringfügigen Modifikationen kann dieses Protokoll auch geeignet sein, um verschiedene Arten von Knochenmark zu erhalten, die von den Zellen bei Ratten oder anderen Tieren abgeleitet wurden. Zunächst sollten eingeschläferte Tiere auf ein desinfiziertes Brett in eine Supine-Position gebracht werden. Mit steriler Schere, machen Sie einen Schnitt etwa einen Zentimeter lang am proximalen Oberschenkelknochen, um die Haut zu schälen.Als nächstes sezieren Sie die Oberschenkelknochen und Tibias. Sorgfältig und sanft, schneiden Sie die bilateralen Verbindungsteile um die Hüfte, Knie und Knöchelgelenke, um die Tibias und Oberschenkelknochen zu isolieren. Schneiden Sie einen Teil des Gewebes um den Knochen herum ab, um sicherzustellen, dass sie gründlich sind.Dann legen Sie die gereinigten Knochen in ein Gericht mit fünf Milliliter neines kompletten Kulturmedium. Verwenden Sie eine sterile Schere, um den langen Knochen abzuschneiden. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Markhöhle vorsichtig mit 10 Millilitern kompletter Medien zu spülen, bis die Markhöhle weiß wird.Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr und filtern Sie sie mit einem 70-Mikrometer-Sieb, um das restliche Gewebe zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter roter BlutlysePuffer, und inkubieren sie die Zellen auf Eis für acht Minuten. Danach zentrieren Sie die Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten, um das Zellpellet zu erhalten.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständiger Medien wieder aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und berechnen Sie die Zeit, die für die für diese Methode ausgeführten Aktionen aufgewendet wurde. Erstens, legen Sie eingeschläferte Tiere auf ein desinfiziertes Brett in einer Supine-Position.Mit steriler Schere, machen Sie einen Schnitt etwa einen Zentimeter lang am proximalen Oberschenkelknochen, um die Haut zu schälen. Als nächstes sezieren Sie die Oberschenkelknochen und Tibias. Schneiden Sie die Teile des Gewebes um den Knochen, obwohl es keine Notwendigkeit, das Gewebe vollständig zu entfernen.Spülen Sie die Tibias und Oberschenkelknochen mit 12 Milliliter PBS, und schneiden Sie sie dann in die Hälfte. Die geschnipste Tibias und Oberschenkelknochen in eine vorbereitete Ein-Milliliter-Pipettenspitze geben und in ein vorbereitetes Mikrozentrifugenrohr geben. Zentrifugieren Sie das Rohr dreimal bei 1 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 45 Sekunden.Entfernen Sie danach die Pipettenspitze, die den Knochen enthält, aus dem Rohr und lassen Sie das Knochenmark im Rohr zurück. Fügen Sie 200 Mikroliter PBS in das Rohr und Pipette immer wieder nach oben und unten, um das Mark gründlich zu zerlegen. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr und filtern Sie sie mit einem 70-Mikrometer-Sieb, um alle verbleibenden Gewebe zu entfernen.Verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und berechnen Sie die Zeit, die für die schritteinin in diesem Abschnitt aufgewendet wurde. Fügen Sie sechs Milliliter Zelltrennlösung in ein steriles silifiziertes Zentrifugalrohr. Fügen Sie die verdünnte Zellsuspension in das Rohr.Nach dem Hinzufügen der Suspension wird eine klare Grenze zwischen der Zellschicht und der Trennlösung angezeigt. Als nächstes halten Sie eine Pipettenspitze in einem 45-Grad-Winkel an der Innenfläche des Rohres fest. Zentrifugieren Sie die geschichtete Lösung in einer horizontalen Zentrifuge bei 500 mal G für 30 Minuten.Danach können Sie die trübe zweite Ebene ansaugen, die die Zielzellen von oben nach unten enthält. Übertragen Sie die Zielzellen in eine neue Röhre. Fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, und Zentrifuge bei 250 mal G für fünf Minuten.Wiederholen Sie diesen Waschvorgang, indem Sie PBS und Zentrifugieren für insgesamt drei Waschungen hinzufügen. Setzen Sie das Zellpellet mit Knochenmarkinduktionsmedium wieder auf. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.Fügen Sie dann fünf bis acht Milliliter Knochenmark-Induktionsmedium hinzu, um eine endgültige Zellenlösung von 300.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Fügen Sie einen Milliliter dieser Zelllösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Nach der Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden, vorsichtig absaugen sie das Medium und fügen Sie jeweils einen Milliliter Osteoklast-Induktionsmedium zu jedem Brunnen hinzu.Rühren Sie die Platte vorsichtig auf und bringen Sie sie zum Inkubator zurück. Entfernen und ersetzen Sie alle 48 Stunden 0,8 Milliliter Osteoklast-Induktionsmedium aus jedem Brunnen. Rühren Sie die Platte sanft, bevor Sie sie zum Inkubator zurückbringen.Um mit der Vorbehandlung der Knochenscheiben zu beginnen, verwenden Sie eine mikroelektrische Säge, um den frischen Rinderfemoralknochenkortex in zwei Zentimeter dicke Scheiben entlang der Längsachse zu schneiden. Nach dem Schneiden und Schleifen der Scheiben, waschen Sie die Scheiben, indem Sie sie in einen Becher mit entionisiertem Wasser eintauchen und sie mit 100 Hertz für eine Stunde Ultraschall machen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal.Die gewaschenen Scheiben zwei Stunden lang in 75% Alkohol eintauchen. Dann, aspirieren Sie den Alkohol und setzen Sie jede Folie von Scheiben ultraviolettem Licht für eine Stunde auf einer sauberen Plattform. Um mit der blauen Färbung zu beginnen, legen Sie die vorbehandelten Knochenscheiben in die Brunnen der 24 Brunnenplatte.Danach fügen Sie Kulturmedium in die 24 Brunnenplatte ein, um die Knochenscheiben für zwei Stunden einzutauchen. Pflanzen und induzieren Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt. Nachdem Osteoklasten an vier bis sechs Tagen aufgetreten sind, waschen Sie die Scheiben mit einem Milliliter 0,25 Molar Ammoniumhydroxid.Beschallen Sie die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten, um die lebenden Zellen zu entfernen und die Analyse der Resorptionsgruben auf den Knochenscheiben zu ermöglichen. Dann entfernen Sie das Ammoniumhydroxid und färben Sie die Scheiben mit einem Milliliter 1%toluidinblauer Lösung pro Scheibe für zwei Minuten. Waschen Sie die Fleckenscheiben mit PBS.Wählen Sie zufällig fünf Ansichten aus, und verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um eine semiquantitative Analyse des Resorptionsbereichs durchzuführen. Präfixieren Sie zunächst die Knochenscheiben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter 2,5% Glutaraldehyd pro Scheibe. Beschallen Sie die voreingestellten Scheiben dreimal für jeweils drei Minuten mit einem molaren Ammoniumhydroxid, um die Zellen zu entfernen.Dann entfernen Sie das Ammoniumhydroxid und waschen Sie die Knochenscheiben dreimal mit PBS, wobei jede Wäsche 12 Minuten dauert. Fixieren Sie die gewaschenen Knochenscheiben mit 1%Osmsäure für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Führen Sie die Ethanolgradientendehydrierung wie im Textprotokoll beschrieben durch.Danach das Ethanol für 15 Minuten durch Isoamylacetat ersetzen. Beschichten Sie die Scheiben mit Goldpalladium und analysieren Sie sie durch Rasterelektronenmikroskopie. In dieser Studie wurden eine große Anzahl von Osteoklast-Vorstufen isoliert, gereinigt und erfolgreich zu Osteoklasten induziert.Durch die Ergänzung mit M-CSF und RANKL, Riesen-Osteoklasten werden an den Tagen fünf bis sechs gesehen. Die Bildung dieser Osteoklasten wird durch Fallenfärbung erfolgreich identifiziert. Große und violette Zellen gelten als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen.Durch diese Methode ist es typisch, 800 Osteoklasten mit bis zu 30 Kernen pro Osteoklast in einer 24-Well-Platte zu erhalten. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode spart diese verbesserte Methode während des gesamten Isolationsprozesses ca. 20 Minuten. Die Verwendung von Knochenscheiben zur Beurteilung der Aktivität der Knochenresorption ist eine typische In-vitro-Methode.Durch Toluidin-Blaufärbung wird der Resorptionsbereich als hellgrün visualisiert. Die Struktur und die Eigenschaften der Knochengruben können durch Rasterelektronenmikroskopie deutlich beobachtet werden. CTR, einer der Osteoklasten spezifischen Zellmarker, ist entscheidend, um Osteoklasten zu identifizieren und die Bildung von Osteoklasten im Knochen zu untersuchen.Die positive Expression von CTR identifiziert eindeutig Osteoklasten und unterscheidet sie von Makrophagenpolykaryonen. CTR ist in den Immunfluoreszenz-Assays durch eine grüne Farbe deutlich angegeben, während das Blau die Zellkerne anzeigt. Achten Sie darauf, die Oberschenkelknochen und die Tibias nicht zu brechen, um knochenmarkzuvermeiden.Eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, wenn sie die Zellen Operation Lösung zu helfen. Die Pipettenspitze muss an der Innenfläche des Rohres befestigt und in einem 45-Grad-Winkel zur Innenfläche gehalten werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

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Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

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The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

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