Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

इस काम को चीन की नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (८१४७३६९२) ने योंग मा को सपोर्ट किया । लेखकों चीनी चिकित्सा के नानजिंग विश्वविद्यालय में नैदानिक चिकित्सा के पहले कॉलेज के चिकित्सा अनुसंधान केंद्र के सभी कर्मचारियों को धंयवाद ।

यहां वर्णित सभी विधियों में पशुओं को शामिल किया गया है, जो चीनी चिकित्सा के नानजिंग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित हैं ।
1. सेटअप
<ol><li>कई लंबाई में 1 मिल?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

प्राप्त करने के लिए और इन विट्रो में अस्थिक्लेस्ट अध्ययन करने की क्षमता हड्डी चयापचय का अध्ययन करने के लिए इच्छुक शोधकर्ता के लिए एक महत्वपूर्ण और मौलिक कौशल है, जो हड्डी को अवशोषित रोगों के तंत्र को स?...

अस्थि समस्थिता एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है जिसे अस्थि-अवशोषण अस्थिप्रसू तथा अस्थि-निर्माण अस्थिविस्फोट1द्वारा विनियमित किया जाता है । अस्थिप्रसू और अस्थिप्रसू के माध्यम से मध्यस्थता के लिए अस्थिब्लास्टिक और अस्थिसंहारक गतिविधि के बीच संतुलन, अस्थि स्वास्थ्य और समस्थिति को बनाए रखने के लिए अत्यंत आवश्यक है, क्योंकि अस्थि समस्तरता में होने वाले रोग हड्डियों के रोगों का कारण बन सकते हैं, जैसे असामान्य अस्थि वृद्धि या अस्थि घनत्व की हानि के रूप में । अद्वितीय अस्थि-अवशोषण कोशिकाओं के रूप में, अस्थिक्लेस्ट्स असामान्य अस्थि विनाश से संबंधित रोगों में महत्वपूर्ण हैं, जिनमें ऑस्टियोपोरोसिस, periodontitis, और पेरिसेस्थेटिक ऑस्टियोलिसिस2,3शामिल हैं ।
अस्थिशोषक संस्कृति के विकास को मुख्यतः दो अवस्थाओं में बांटा गया है । Boyde एट अल.4 और मंडलों एट अल5 द्वारा स्थापित तरीकों 1980 के दशक में पहले चरण की रचना की । वे नवजात पशुओं की हड्डियों से अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त किया, जो तेजी से remodeling अवधि है । अस्थिक्लेस्ट्स को खंडित करके और हड्डियों को विशेष माध्यम में हिलाते हुए ऑस्टियोक्लैस्ट छोड़े जाते हैं । हालांकि इस विधि से प्राप्त कोशिकाओं की मात्रा और शुद्धता कम होती है । दूसरे चरण अस्थिक्लेस्ट गठन की लंबी दूरी की संस्कृतियों का विकास था, अस्थि मज्जा6से व्युत्पंन hematopoietic वंश कोशिकाओं का उपयोग । साइटोकिन्स, जैसे 1α, 25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी3, प्रोस्टाग्लैनडिन E2 (पीजीएच-2), और पैराथिरॉइड हार्मोन (pge), जो संस्कृति माध्यम में जोड़े जाते हैं, अस्थिविस्फोटों/स्ट्रोमल कोशिकाओं की प्रणाली के माध्यम से अधिनियम . तथापि, इस विधि द्वारा प्राप्त अस्थिक्लेस्ट्स की शुद्धता और मात्रा आधुनिक आण्विक जीवविज्ञान अनुसंधान की आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकती । फिर, मैक्रोफेज कॉलोनी की खोज-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के लिए रिसेप्टर उत्प्रेरक-κb लिगामेंट (रानीकेएल) osteoclastogenesis आसान बनाने9,10,11, और एम-सीएसएफ का उपयोग करने की विधि और Rankl सीधे अस्थिशोषक गठन को प्रोत्साहित करने के लिए व्यापक रूप से दुनिया भर में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, अभी भी पद्धति में कुछ विवरण है कि सुधार की जरूरत है ।
वर्तमान में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया अस्थिक्लेस्ट संस्कृति विधि, Marino एट अल12 और पी एट अल.13द्वारा वर्णित के रूप में, अक्सर हड्डी के आसपास के आसपास के ऊतकों को हटाने की आवश्यकता है और एक निष्फल सुई का उपयोग करता है के साथ मज्जा गुहा फ्लश मीडिया को पूरा किया । इस प्रक्रिया के लिए कुछ कमियां हैं, तथ्य यह है कि (1) हड्डी के आसपास के आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए बहुत समय और महान शल्य चिकित्सा तकनीक की आवश्यकता है, (2) हड्डियों नाजुक है और अस्थि मज्जा बहिर्वाह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, (3) अस्थि मज्जा गुहा हो सकता है बहुत छोटे फ्लश करने के लिए, और (4) वहां सुई छड़ी चोट का खतरा है । इन समस्याओं से बचने के लिए, हम सुई के बजाय अस्थि मज्जा के लिए हड्डियों से युक्त ट्यूब केंद्राग्र-अस्थि मज्जा फ्लशिंग । यहां, हम एक स्थिर और सुरक्षित तरीका है जो कम समय में अस्थि मज्जा और कम प्रयास के साथ पारंपरिक प्रक्रिया की तुलना में आइसोलेट्स परिचय । एक साथ घनत्व ढाल केंद्राभियन के उपयोग के साथ, हम विट्रो में पूरी तरह से विभेदित अस्थिकपर्त की बड़ी मात्रा में प्राप्त करतेहैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

अस्थिक्लेस्ट, मोनोसाइट की बड़ी, बहुकेंद्रकी, और अस्थि-अवशोषण कोशिकाएं होती हैं-मैक्रोफेज वंश जो monocyte या मैक्रोफेज पूर्वगामी के संलयन से बनते हैं. अत्यधिक अस्थि अवशोषण एक सबसे महत्वपूर्ण सेलुलर तंत्र है जिसके कारण अस्थिमज्जा रोग होता है, जिसमें ऑस्टियोपोरोसिस, periodontitis, और पेरिस्थेटिक ऑस्टियोलिसिस शामिल हैं । अस्थिभंग का मुख्य शारीरिक कार्य हाइड्रोक्सीएपीटाइट खनिज घटक और अस्थि के कार्बनिक मैट्रिक्स दोनों को अवशोषित करना है, जो हड्डियों की सतह पर विशिष्ट अवशोषण दिखावट उत्पन्न करते हैं । शरीर में अन्य कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत कुछ अस्थिक्लेस्ट्स होते हैं, विशेष रूप से वयस्क हड्डियों में । हाल के अध्ययनों से कैसे कम समय में अधिक परिपक्व अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त करने के लिए है, जो हमेशा एक समस्या रही है पर ध्यान केंद्रित किया है । अलगाव और संस्कृति तकनीकों में कई सुधार प्रयोगशालाओं में विकसित किया है ताकि अधिक परिपक्व अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त करने के लिए । यहां, हम एक तरीका है कि कम समय में और कम प्रयास के साथ पारंपरिक प्रक्रिया की तुलना में, एक विशेष और सरल उपकरण का उपयोग कर अस्थि मज्जा आइसोलेट्स परिचय । घनत्व ढाल अपकेंद्रण के उपयोग के साथ, हम चूहे की अस्थि मज्जा, जो शास्त्रीय तरीकों से पहचान कर रहे हैं से पूरी तरह से विभेदित अस्थिकाठियाँ की बड़ी मात्रा में प्राप्त करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बड़ी संख्या में अस्थिशोषक पूर्वगामी को आसानी से अलग करना और उन्हें शुद्ध करना था और अस्थिक्लेस्ट्स को सफलतापूर्वक प्रेरित करना था । एम-सीएसएफ और रानीकेएल के साथ ?...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

अलगाव, शुद्धि, और चूहा अस्थि मज्जा से Osteoclast पूर्ववर्ती की भिंनता

अस्थिकेलिस्ट्स ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज पॉलीकार्यन्स होते हैं जो मोनोसाइट से व्युत्पन्न होते हैं-हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं की मैक्रोफेज वंशावली । यह प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को अलग करने के तरीके का वर्णन करता है, ताकि पारंपरिक पद्धतियों में पाए जाने वाले दुर्घटनाओं के जोखिम को कम करते हुए ऑस्टियोक्लैस्ट्स की बड़ी मात्रा प्राप्त की जा सके ।

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

अस्थि मज्जा व्यापारियों से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं की संस्कृति

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

प्राथमिक electroporation के लिए murine अस्थि मज्जा से hematopoietic सेल संस्कृतियों की तैयारी

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं के घर वापस आना

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के Oligodendrocyte व्यापारियों में भेदभाव

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

अलगाव और kinesin के शोधन से ड्रोसोफिला भ्रूण

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

मानव कंकाल की मांसपेशी से रक्त वाहिका व्युत्पन्न multipotent व्यापारियों का अलगाव

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से अस्थिशोषक व्युत्पत्ति

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

अलगाव, लक्षण वर्णन, और वयस्क माउस दिल से हृदय स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

नवजात चूहों से प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव और भेदभाव

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...