Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81473692) a Yong ma. Gli autori ringraziano tutto il personale del centro di ricerca medica del primo collegio di medicina clinica presso l'Università di medicina cinese di Nanchino.

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali qui descritti sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di medicina cinese di Nanchino.
1. impostazione del Setup
<ol><li>Preparare diversi puntali per pipette da 1 mL longitudinalmente tagliati (1 cm) e diversi provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere i puntali per pipette e le provette per microcentrifuga a 103 kPa e 121 ° c per 20 minuti e assicurarsi che siano sterili.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

La capacità di ottenere e studiare osteoclasti in vitro è un'abilità critica e fondamentale per qualsiasi ricercatore che desideri studiare il metabolismo osseo, che può aiutare a comprendere i meccanismi delle malattie che assorbono le ossa e sviluppare nuovi agenti terapeutici. Il presente studio ha descritto un protocollo con alcune modifiche basate su metodi precedenti.
Utilizzando puntali per pipette e provette per microcentrifuga per ottenere il midollo osseo, ha ridotto in gran part...

L'omeostasi ossea è un processo fisiologico complesso che è regolato da osteoclasti di riassorbimento osseo e osteoblast che formano ossa1. Un equilibrio tra attività osteoblastica e osteoclastica mediata attraverso osteoblasti e osteoclasti, rispettivamente, è altamente essenziale per mantenere la salute ossea e l'omeostasi, perché le perturbazioni nell'omeostasi ossea possono portare a malattie ossee, come come crescita ossea anormale o perdita di densità ossea. Come cellule di riassorbimento osseo uniche, gli osteoclasti sono importanti nelle malattie legate alla distruzione ossea anormale, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica2,3.
Lo sviluppo di una cultura osteocultima è diviso principalmente in due fasi. I metodi stabiliti da Boyde et al.4 e Chambers et al.5 hanno composto la prima tappa negli anni ottanta. Hanno ottenuto osteoclasti relativamente abbondanti dalle ossa degli animali appena nati, che è il periodo di rimodellamento rapido. Gli osteoclasti vengono rilasciati frammentare e mescolare le ossa in un mezzo speciale. Tuttavia, le cellule ottenute con questo metodo sono a basso contenuto di quantità e purezza. Il secondo stadio è stato lo sviluppo di colture a lungo raggio di formazione di degli osteoclasti, utilizzando cellule di lignaggio ematopoietiche derivate dal midollo osseo6. Le citochines, come 1 α, 25-diidrossiamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), e l'ormone paratiroideo (PTH), che vengono aggiunti nel mezzo di coltura, agiscono attraverso il sistema di osteoblasti/cellule stromali per stimolare la formazione di degli osteoclasti7,8 . Tuttavia, la purezza e la quantità degli osteoclasti ottenuti con questo metodo non possono soddisfare le esigenze della moderna ricerca sulla biologia molecolare. Quindi, la scoperta del fattore stimolante le colonie di macrofage (m-CSF) e dell'attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-κB (RANKL) rende l'osteoclastogenesi più facile9,10,11e il metodo di utilizzo di m-CSF e RANKL per stimolare direttamente la formazione di degli osteoclasti è ampiamente usato in tutto il mondo. Tuttavia, ci sono ancora alcuni dettagli nella metodologia che devono essere migliorate.
Attualmente, il metodo di coltura degli osteoclasti più comunemente usato, come descritto da Marino et al.12 e Pei et al.13, spesso richiede la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso e utilizza un ago sterilizzato per lavare la cavità del midollo con supporti completati. Ci sono alcuni inconvenienti a questo processo, compreso il fatto che (1) la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso richiede molto tempo e grande tecnica chirurgica, (2) le ossa sono fragili e possono portare a deflusso del midollo osseo, (3) la cavità del midollo osseo potrebbe essere troppo piccolo per lavare, e (4) c'è il rischio di lesioni dell'ago. Per evitare questi problemi, centrifugheremo i tubi contenenti le ossa per il midollo osseo invece di lavare l'ago al midollo osseo. Qui, introduciamo un metodo stabile e sicuro che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale. Insieme all'uso della centrifugazione con gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Gli osteoclasti sono cellule grandi, multinucleate e di riassorbimento osseo del lignaggio dei monociti-macrofage che sono formate dalla fusione di monociti o precursori di macrofage. Un eccessivo riassorbimento osseo è uno dei meccanismi cellulari più significativi che portano a malattie osteolitiche, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica. La principale funzione fisiologica degli osteoclasti è quella di assorbire sia la componente minerale di idrossiapatite che la matrice organica dell'osso, generando l'aspetto caratteristico del riassorbimento sulla superficie delle ossa. Ci sono relativamente pochi osteoclasti rispetto ad altre cellule del corpo, soprattutto nelle ossa adulte. Studi recenti si sono concentrati su come ottenere osteoclasti più maturi in meno tempo, che è sempre stato un problema. Diversi miglioramenti nelle tecniche di isolamento e cultura si sono sviluppati nei laboratori al fine di ottenere osteoclasti più maturi. Qui, introduciamo un metodo che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale, utilizzando un dispositivo speciale e semplice. Con l'uso di centrifugazione a gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati dal midollo osseo del ratto, che sono identificati con metodi classici.

Lo scopo del protocollo era quello di isolare e purificare un gran numero di precursori degli osteoclasti convenientemente e indurre osteoclasti con successo. Completando con M-CSF e RANKL, osteoclasti giganti sono stati osservati nei giorni 5 – 6. La formazione di osteoclasti è stata identificata con successo dalla colorazione TRAP (Figura 1a). Le cellule grandi e viola sono state considerate come cellule trappola-positive con nuclei multipli (tipicamente...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Questo metodo è significativo perché può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro. Il vantaggio principale di questo metodo è che è più stabile e sicuro e isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzi rispetto al procedimento tradizionale. Questa tecnica può fornire una fonte stabile di osteoclasti, che sono l'importante oggetto della malattia metabolica ossea, tra cui osteoporosi, parodontite e osteolisi periprotesica.Con piccole modifiche, questo protocollo può anche essere appropriato per ottenere vari tipi di midollo osseo derivato dalle cellule nei ratti o in altri animali. Per iniziare, posizionare gli animali eutanasiati su una tavola disinfettata in posizione supina. Usando forbici sterili, fare un'incisione lunga circa un centimetro al femore prossimale per sbucciare la pelle.Quindi, seziona i femminicidi e le tibia. Con attenzione e delicatezza, tagliare le parti di connessione bilaterali intorno all'anca, al ginocchio e alle articolazioni della caviglia per isolare le tibia e i femminicidi. Tagliare parte dei tessuti intorno all'osso, assicurandosi di essere accurati.Quindi, posizionare le ossa pulite in un piatto con cinque millilitri di mezzo di coltura completo. Usa forbici sterili per tagliare l'osso lungo. Utilizzare un ago per siringhe millilitro per sciacquare con cura la cavità del midollo con 10 millilitri di mezzi completi fino a quando la cavità del midollo diventa bianca.Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e filtrarla con un filtro da 70 micrometri per rimuovere il tessuto rimanente. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi del sangue rosso e incubare le cellule sul ghiaccio per otto minuti. Successivamente, centrifugare le cellule a 250 volte G per cinque minuti per produrre il pellet cellulare.Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzi completi. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e calcolare il tempo dedicato alle azioni intraprese per questo metodo. In primo luogo, posizionare gli animali eutanasiati su una tavola disinfettata in posizione supina.Usando forbici sterili, fare un'incisione lunga circa un centimetro al femore prossimale per sbucciare la pelle. Quindi, seziona i femminicidi e le tibia. Tagliare le parti dei tessuti intorno all'osso, anche se non è necessario rimuovere completamente il tessuto.Risciacquare le tibia e i femori con 12 millilitri di PBS, quindi tagliarli a metà. Posizionare le tibia e i femminicidi stronchiti in una punta di pipetta da millilitro preparata e posizionarlo in un tubo di micro centrifuga preparato. Centrifugare il tubo tre volte a 1.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 45 secondi.Successivamente, rimuovere la punta della pipetta contenente l'osso dal tubo, lasciando il midollo osseo nel tubo. Aggiungere 200 microlitri di PBS al tubo e pipettare ripetutamente su e giù per disintegrare accuratamente il midollo. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e filtrarla con un filtro da 70 micrometri per rimuovere i tessuti rimanenti.Quindi, usa un emocitometro per contare le cellule e calcola il tempo trascorso sui passaggi presi in questa sezione. Aggiungere sei millilitri di soluzione di separazione cellulare a un tubo centrifugo silicificato sterile. Aggiungere la sospensione cellulare diluita al tubo.Dopo aver aggiunto la sospensione, apparirà un chiaro limite tra lo strato di celle e la soluzione di separazione. Quindi, aderire a una punta di pipetta alla superficie interna del tubo con un angolo di 45 gradi. Centrifugare la soluzione stratificata in una centrifuga orizzontale a 500 volte G per 30 minuti.Successivamente, aspirare il secondo livello torbido che contiene le celle di destinazione dall'alto verso il basso. Trasferire le celle di destinazione in un nuovo tubo. Aggiungere cinque millilitri di PBS per lavare le cellule e centrifugare a 250 volte G per cinque minuti.Ripetere questo processo di lavaggio aggiungendo PBS e centrifugando per un totale di tre lavaggi. Rimossare il pellet cellulare con mezzo di induzione del midollo osseo. Usa un emocitometro per contare le cellule.Quindi, aggiungere da cinque a otto millilitri di mezzo di induzione del midollo osseo per ottenere una soluzione di cellule finali di 300.000 cellule per millilitro. Aggiungere un millilitro di questa soluzione cellulare ad ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetto. Dopo aver incubato le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore, aspirare delicatamente il mezzo e aggiungere un millilitro di mezzo di induzione osteoclasta ad ogni pozzo.Agitare delicatamente la piastra e restituirla all'incubatrice. Ogni 48 ore, rimuovere e sostituire 0,8 millilitri di mezzo di induzione osteoclasta da ogni pozzo. Agitare delicatamente la piastra prima di restituirla all'incubatrice.Per iniziare a pretrattare le fette ossee, utilizzare una sega micro elettrica per tagliare la corteccia ossea femorale bovina fresca in fette spesse due centimetri lungo l'asse longitudinale. Dopo aver tagliato e macinato le fette, lavare le fette immergendole in un bicchiere di acqua deionizzata e sottometterli ad ultrasuoni a 100 hertz per un'ora. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte.Immergere le fette lavate con 75% di alcol per due ore. Quindi, aspirare l'alcol ed esporre ogni diapositiva di fette alla luce ultravioletta per un'ora su una piattaforma pulita. Per iniziare la colorazione blu toluidina, posizionare le fette ossee pretrattate nei pozzi della piastra del pozzo 24.Successivamente, aggiungere il mezzo di coltura nel piatto di 24 po 'per immergere le fette ossee per due ore. Piantare e indurre le cellule come dimostrato in precedenza. Dopo che gli osteoclasti sono apparsi a quattro o sei giorni, lavare le fette con un millilitro di idrossido di ammonio molare 0,25.Sonicare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna per rimuovere le cellule viventi e consentire l'analisi delle fosse di riassorbimento sulle fette ossee. Quindi, rimuovere l'idrossido di ammonio e macchiare le fette con un millilitro di soluzione blu di toluidina all'1% per fetta per due minuti. Lavare le fette di macchia con PBS.Selezionare casualmente cinque viste e utilizzare un software di analisi delle immagini per eseguire un'analisi semi-quantitativa dell'area di riassorbimento. In primo luogo, antescere le fette ossee con un millilitro del 2,5% di glutaraldeide per fetta per due ore a temperatura ambiente. Sonicare le fette prefissate tre volte per tre minuti ciascuna con un idrossido di ammonio molare per rimuovere le cellule.Quindi, rimuovere l'idrossido di ammonio e lavare le fette ossee tre volte con PBS, con ogni lavaggio della durata di 12 minuti. Fissare le fette ossee lavate con acido osmico all'1% per due ore a temperatura ambiente. Eseguire la disidratazione del gradiente di etanolo come descritto nel protocollo di testo.Dopo questo, sostituire l'etanolo con acetato di isoamile per 15 minuti. Rivestire le fette con palladio d'oro e analizzarle scansionando la microscopia elettronica. In questo studio, un gran numero di precursori dell'osteoclasta sono stati isolati, purificati e indotti con successo a diventare osteoclasti.Integrandosi con M-CSF e RANKL, gli osteoclasti giganti sono visti nei giorni da cinque a sei. La formazione di questi osteoclasti è identificata con successo dalla colorazione delle trappole. Le cellule grandi e viola sono considerate cellule positive TRAP con nuclei multipli.Attraverso questo metodo, è tipico ottenere 800 osteoclasti contenenti fino a 30 nuclei per osteoclasta in una piastra di 24 pozza. Rispetto al metodo tradizionale, questo metodo migliorato consente di risparmiare circa 20 minuti durante l'intero processo di isolamento. L'uso di fette ossee per valutare l'attività del riassorbimento osseo è un metodo tipico in vitro.Attraverso la colorazione blu toluidina, l'area di riassorbimento viene visualizzato come verde chiaro. La struttura e le caratteristiche delle fosse ossee possono essere chiaramente osservate mediante microscopia elettronica a scansione. Il CTR, uno dei marcatori cellulari specifici degli osteoclasti, è fondamentale per identificare gli osteoclasti e studiare la formazione di osteoclasti nell'osso.L'espressione positiva del CTR identifica chiaramente gli osteoclasti e li distingue dai policariosi macrofagi. Il CTR è chiaramente indicato nei saggi di immunofluorescenza da un colore verde, mentre il blu indica i nuclei cellulari. Assicurarsi di non fratturare i femore e le tibia per evitare di perdere il midollo osseo.Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica prima può avere difficoltà quando aiuta la soluzione operativa delle cellule. La punta della pipetta deve essere aderì alla superficie interna del tubo e mantenuta con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie interna.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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