Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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この作品は、中国の国立自然科学財団 (81473692) にヨン・マによって支えられました。著者は、南京中国医学大学の臨床医学の最初の大学の医学研究センターのすべてのスタッフに感謝します.

ここに記載されている動物を含むすべての方法は、南京中国医学大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) によって承認します。
1. セットアップ
<ol><li>いくつかの縦方向のカット 1 mL ピペットチップ (1cm) といくつかの 1.5 mL マイクロ遠心チューブを準備します。ピペットの先端およびマイクロ遠心の管を20分の 103 kPa および121° c で置き、生殖不能であることを保障し?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

インビトロで破骨細胞を得、研究する能力は、骨代謝を研究したい研究者にとって重要かつ基礎的な技術であり、骨吸収疾患のメカニズムを理解し、新しい治療薬を開発するのに役立つ可能性がある。本研究は、以前の方法に基づくいくつかの変更を伴うプロトコルについて説明した。
マイクロ遠心を使用することにより、骨髄を取得するためにピペットの先端および?...

骨恒常性は、骨瘢痕破骨細胞および骨形成性骨芽細胞1によって調節される複雑な生理的過程である。骨芽細胞および破骨細胞を介して媒介される骨芽と osteoclastic 活動との間のバランスは、それぞれ、骨の健康と恒常性を維持するために非常に重要であり、このような骨格恒常性の摂動は骨疾患につながる可能性があるため、異常な骨の成長または骨密度の損失として.ユニークな骨吸収細胞としては、骨粗しょう症、歯周炎、periprosthetic 骨溶解2,3などの異常骨折に関連する疾患に重要です。
破骨細胞の培養の開発は、主に2つの段階に分けられる。Boyde et al.4およびチェンバース et al.5によって確立された方法は、1980年代の第一段階を構成した。彼らは急速なリモデリング期間である新生動物の骨から比較的豊富な破骨細胞を得た。破骨細胞は、特殊な培地で骨を攪拌して断片化することによって放出される。しかし、この方法によって得られる細胞は、量および純度が低い。第2段階では、骨髄破骨細胞由来の造血器系統を用いて、細胞骨格形成の長期培養物の開発を行いました。サイトカインは、例えば、1α、25−ジヒドロキシビタミン D3、プロスタグランジン E2 (pge2)、および副甲状腺ホルモン (PTH)、培養培地に添加された、破骨細胞/ストロマセルの系を通じて作用して、細胞芽層形成を刺激する7,8.しかしながら、この方法によって得られた破骨細胞の純度と量は、現代の分子生物学研究のニーズを満たすことができない。次いで、核因子-κ b リガンド (RANKL) のためのマクロファージコロニー刺激因子 (M − csf) および受容体活性化剤の発見は、osteoclastogenesis をより容易にし、そして、M − CSF を使用する方法および破骨細胞の形成を直接刺激する RANKL は、世界中で広く使用されている。しかし、改善する必要がある方法論にはまだいくつかの詳細があります。
現在、最も一般的に使用されている破骨細胞培養法は、マリノ et al.12および Pei et al.13で説明したように、しばしば骨の周りの周囲の組織の除去を必要とし、滅菌された針を使用して骨髄腔をフラッシュする完成したメディア。(1) 骨の周りの周囲の組織の除去が多くの時間と偉大な外科的技術を必要とするという事実を含め、このプロセスにはいくつかの欠点があり、(2) 骨が壊れやすく、骨髄流出につながる可能性がある、(3) 骨髄腔はフラッシュするには小さすぎると、(4) 針のスティック傷害の危険性があります。これらの問題を回避するために、骨髄を針で洗い流す代わりに、骨髄用の骨を含むチューブを遠心分離します。ここでは、従来の手順と比較して、より短時間でより少ない労力で、骨髄を分離する安定した安全な方法を紹介します。遠心分離の密度勾配の使用とともに、我々は、インビトロで大量に分化した破骨細胞を得る。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

破骨細胞は、単球またはマクロファージ前駆体の融合によって形成される単球-マクロファージ系統の大規模、多核、および骨瘢痕である。過度の骨吸収は、骨粗鬆症、歯周炎、periprosthetic 骨溶解を含む溶骨性疾患につながる最も重要な細胞機構である。破骨細胞の主な生理機能は、骨のヒドロキシアパタイトミネラル成分と有機マトリックスの両方を吸収し、骨の表面に特徴的な吸収外観を発生させることである。身体の他の細胞と比較して、特に成人の骨において比較的少数の骨細胞がある。最近の研究では、より短時間でより成熟した破骨細胞を得る方法に着目してきましたが、これは常に問題となっています。分離性および培養技術のいくつかの改善は、より成熟した破骨細胞を得るために実験室で開発した。ここでは、従来の手順と比較して、より少ない時間で、より少ない労力で骨髄を分離する方法を、特別でシンプルな装置を使用して導入します。密度勾配遠心分離の使用により、我々は、古典的方法によって同定されるラット骨髄からの完全に分化した破骨細胞を大量に得る。

このプロトコルの目的は、多数の破骨細胞前駆体を簡便に分離して浄化し、破骨細胞を正常に誘導することであった。M − CSF および RANKL を補うことにより、巨大破骨細胞が 5 ~ 6 日目に見られた。破骨細胞の形成はトラップ染色によって首尾よく同定された (図 1a)。大規模で紫色の細胞は、複数の核 (典型的には≥3つの核) を持つ TRAP 陽性細胞?...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化

破骨細胞は、造血幹細胞の単球-マクロファージ系統に由来する組織特異的なマクロファージ polykaryons である。このプロトコルは、従来の方法で見られる事故のリスクを低減しながら、大量の破骨細胞が得られるように骨髄セルを分離する方法を説明する。

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

この方法は、インビトロで大量の完全に分化された破骨細胞を得るために使用することができるので重要である。この方法の主な利点は、それがより安定して安全であり、従来の進行に比べて少ない時間で、より少ない努力で骨髄を分離することです。この技術は、骨粗鬆症、パロドンティス、骨形成炎を含む骨代謝疾患の重要な目的である破骨細胞の安定した供給源を提供することができる。軽微な改変により、このプロトコルはまた、ラットまたは他の動物の細胞に由来する様々な種類の骨髄を得るために適切であり得る。まず、安楽死させた動物を、麻酔付きのボード上の、サピインの位置に置きます。滅菌はさみを使用して、皮膚を剥がすために近位大腿骨で約1センチメートルの長さの切開を行います。次に、大腿骨と脛骨を解剖する。慎重かつ穏やかに、脛骨と大腿骨を分離するために、股関節、膝関節、足首関節の周りの両側接続部分を切断します。骨の周りの組織の一部を切断し、徹底的であることを確認します。その後、洗浄した骨を5ミリリットルの完全な培養培地で皿に入れます。長い骨を切り落とすために無菌はさみを使用してください。1ミリリットルの注射針を使用して、骨髄腔が白くなるまで10ミリリットルの完全な媒体で慎重に骨髄腔を洗い流します。この細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移し、70マイクロメートルのストレーナーで濾過して残りの組織を取り除きます。5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーを加え、氷上の細胞を8分間インキュベートします。この後、細胞ペレットを得るために5分間Gの250倍のGで細胞を遠心分離する。上清を吸引し、完全な培地の10ミリリットルで細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用してセルをカウントし、このメソッドに対して実行されたアクションに費やした時間を計算します。まず、安楽死させた動物を、麻酔付きの位置に除菌したボードの上に置きます。滅菌はさみを使用して、皮膚を剥がすために近位大腿骨で約1センチメートルの長さの切開を行います。次に、大腿骨と脛骨を解剖する。骨の周りの組織の部分を切断します, 完全に組織を除去する必要はありませんが、.12ミリリットルのPBSでティビアスと大腿骨をすすいでから半分に切ります。切り取ったティビアスと大腿骨を準備した1ミリリットルのピペットチップに入れ、これを準備したマイクロ遠心管に入れる。チューブを1,000倍Gで3回、摂氏4度で45秒間遠心分離します。この後、骨を含むピペットチップをチューブから取り出し、骨髄をチューブに残します。チューブにPBSの200マイクロリットルを追加し、ピペットを繰り返し上下にして骨髄を完全に崩壊します。この細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移し、70マイクロメートルのストレーナーで濾過して残りの組織を取り除きます。次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、このセクションで取ったステップに費やした時間を計算します。滅菌された分離チューブに6ミリリットルの細胞分離溶液を加えます。希釈した細胞懸濁液をチューブに加えます。懸濁液を添加すると、細胞の層と分離溶液の間に明確な制限が現れます。次に、ピペット先端をチューブの内面に45度の角度で付着させる。重層溶液をG500倍で水平遠心分離機で30分間遠心する。この後、ターゲット細胞を含む曇りの第2層を上から下に吸引する。ターゲットセルを新しいチューブに移します。5ミリリットルのPBSを加え、細胞を洗浄し、遠心分離機をGの250倍で5分間加える。PBSと遠心分離機を加えて、この洗浄工程を合計3回洗浄します。骨髄誘導培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。次いで、骨髄誘導培地を5~8ミリリットル加え、1ミリリットル当たり300,000個の細胞の最終的な細胞溶液を得る。24ウェルプレートの各ウェルにこのセル溶液の1ミリリットルを追加します。24時間摂氏37度で細胞をインキュベートした後、培地を軽く吸引し、各ウェルに1ミリリットルの破骨細胞誘導培地を加える。プレートを軽く攪拌し、インキュベーターに戻します。48時間ごとに、各井戸から0.8ミリリットルの破骨細胞誘導培地を取り除き、交換します。プレートを静かに攪拌してから、インキュベーターに戻します。骨のスライスの前処理を開始するには、マイクロ電気ソーを使用して、新鮮な牛の大腿骨骨皮質を縦軸に沿って2センチメートルの厚さのスライスにカットします。スライスを切断して粉砕した後、スライスを脱イオン水のビーカーに浸して洗浄し、100ヘルツで1時間超音波にします。この洗浄工程を3回繰り返します。洗浄したスライスを75%アルコールに2時間浸します。その後、アルコールを吸引し、きれいなプラットフォーム上で1時間紫外線にスライスの各スライドを公開します。トルイジンブルー染色を開始するには、前処理された骨スライスを24ウェルプレートのウェルに入れる。この後、培養液を24ウェルプレートに加え、骨スライスを2時間浸漬する。前に示したように細胞を植え、誘導する。破骨細胞が4〜6日に出現した後、0.25モル水酸化アンモニウムの1ミリリットルでスライスを洗います。スライスを3回5分間超音波処理して、生きている細胞を取り除き、骨スライスの吸収ピットの分析を可能にします。次に、水酸化アンモニウムを取り除き、スライスあたり1%トルイジンブルー溶液1ミリリットルでスライスを2分間染色します。PBSで汚れスライスを洗います。ランダムに5つのビューを選択し、画像解析ソフトウェアを使用して、再吸収領域の半定量的な分析を実行します。まず、骨スライスに1ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒドを室温で2時間付けます。接頭辞を付けたスライスを3回3分間、それぞれ1つの水酸化アンモニウム大臼歯で超音波処理し、細胞を除去する。その後、水酸化アンモニウムを取り出し、PBSで骨スライスを3回洗浄し、各洗浄を12分間持続させます。洗浄した骨スライスを1%オズミック酸で室温で2時間固定します。テキストプロトコルで概説されているように、エタノール勾配脱水を行います。この後、エタノールを酢酸イソアミルに15分間交換します。スライスに金のパラジウムをコーティングし、走査型電子顕微鏡で分析します。本研究では、多数の破骨細胞前駆体が単離され、精製され、破骨細胞になることに成功した。M-CSFとRANKLを補うことによって, 巨大な破骨細胞は、日に見られます 5 から 6.これらの破骨細胞の形成は、トラップ染色によって正常に同定される。大きい紫の細胞は、複数の核を持つTRAP陽性細胞とみなされます。この方法を通して、24ウェルプレートで破骨細胞当たり30個もの核を含む800個の破骨細胞を得ることが典型的である。従来の方法と比較して、この改良された方法は、全体の分離プロセス中に約20分を節約します。骨の吸収の活性を評価するために骨スライスを使用することは、典型的なin vitro方法です。トルイジンブルー染色を通して、再吸収領域はライトグリーンとして視覚化される。骨盤の構造や特性は、走査型電子顕微鏡で明らかに観察することができる。CTRは、破骨細胞の特定の細胞マーカーの1つであり、破骨細胞を同定し、骨の破骨細胞の形成を研究するために重要である。CTRの陽性の発現は、明確に破骨細胞を識別し、マクロファージポリカルリオンとそれらを区別します。CTRは、蛍光免疫アッセイでは緑色で明確に示され、青色は細胞の核を示す。骨髄を失わないように大腿骨と脛骨を骨折しないようにしてください。これまでこの技術を行ったことがない人は、細胞操作溶液を助けるときに苦労する可能性があります。ピペット先端は管の内面に付着し、内面に45度の角度で保たれなければならない。

Research

JoVE Journal

Biology

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