Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단 (81473692)에서 용 마에 의해 지원 되었다. 저자는 중국 의학의 난징 대학에서 임상 의학의 첫 번째 대학의 의료 연구 센터의 모든 직원을 감사 합니다.

여기에 설명 된 동물을 포함 하는 모든 방법은 중국 의학의 난징 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 됩니다.
1. 설정
<ol><li>여러 방향으로 절단 1Ml의 피 펫 팁 (1cm)과 여러 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브를 준비 합니다. 20 분 동안 103 kPa 및 121 ° c에서 파이 펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브를 넣고 멸 균 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>격리 절차 동안 ?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

시험관 내에서 파 골 세포를 얻고 연구 하는 능력은 뼈를 흡수 하는 질병의 메커니즘을 이해 하 고 새로운 치료제를 개발 하는 데 도움이 될 수 있는 골 대사를 연구 하고자 하는 모든 연구자에 게 중요 하 고 근본적인 기술입니다. 본 연구는 이전 방법에 기초 하 여 일부 수정과 프로토콜을 설명 했다.
골 수를 얻기 위해 피 펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브를 사용 함으로써,...

뼈 항상성은 뼈에 의해 조절 되는 복잡 한 생리 적 과정 이다-파 골 세포와 골 형성 조 골 술1. 골 아 세포 및 파 골 세포를 통해 매개 된 조 골 및 파 골의 활성 사이의 균형은 각각 뼈 건강 및 항상성 유지에 매우 중요 하며, 뼈 항상성에서의 섭 동이 뼈 질환으로 이어질 수 있기 때문에 비정상적인 뼈 성장 또는 뼈 밀도의 손실. 독특한 뼈-재흡수 세포로 서, 파 골 균은 골다공증, 치 주 염 및 인공 골 분해2,3을 포함 한 비정상적인 뼈 파괴와 관련 된 질병에 중요 합니다.
파 골 세포 배양의 개발은 주로 두 단계로 나뉜다. 보이 드 외4 와 챔버 스 외5 는 1980 년대 첫 번째 스테이지로 구성 된 방법. 그 (것) 들은 급속 한 개장 기간 인 신생 동물의 뼈에서 상대적으로 풍부한 파 골 세포를 얻었습니다. 파 골 세포는 특별 한 배지에서 뼈를 조각 내 고 교 반하여 방출 됩니다. 그러나,이 방법에 의해 얻어진 세포는 양과 순도가 낮다. 두 번째 단계는 골 수가6에서 유래한 조 혈 계보 세포를 이용 하 여 파 골 균 형성의 장거리 배양을 개발 하는 것 이었다. 1 α, 25-디 하이드 록 시 비타민 D3, 프로 스타 글란 딘 E2 (pge-2) 및 부 갑 상선 호르몬 (PTH)과 같은 배양 배지에 첨가 된 골 아 세포의 시스템을 통해 서 작용 하 여 파 골 형성을 자극 하는,8 . 그러나,이 방법에 의해 얻어진 파 골 세포의 순도 및 양은 현대의 분자 생물학 연구의 요구를 충족 시킬 수 없다. 이어서, 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-csf) 및 핵 인자-κ b 리간드 (rankl)를 위한 수용 체 활성 제를 발견 하 여 골 세포 형성을 용이 하 게 하는9,10,11및 M-csf를 사용 하는 방법 및 파 골 세포 형성을 직접적으로 자극 하는 RANKL은 전 세계적으로 널리 사용 되 고 있다. 그러나, 개선 해야 할 방법론에는 여전히 몇 가지 세부 사항이 있습니다.
현재 가장 일반적으로 사용 되는 파 골 세포 배양 법은 마 리노 외 (12 ) 및 페이 알13에 의해 기술 된 바와 같이, 종종 뼈 주위의 주위 조직을 제거 하 고 살 균 된 바늘을 사용 하 여 골 수를 세척 하는 것이 필요 완료 된 미디어. 이 과정에는 (1) 뼈 주위의 주위 조직을 제거 하는 것이 많은 시간과 훌륭한 외과 기술이 필요 하다는 사실을 포함 하 여, (2) 뼈가 깨지기 쉬우며 골 수 유출을 초래할 수 있다는 사실 (3)이 있습니다. 너무 작은 플러시, 그리고 (4) 바늘 스틱 부상의 위험이 있다. 이러한 문제를 방지 하기 위해 골 수를 바늘로 내뿜는 대신 골 수에 대 한 뼈가 들어 있는 튜브를 원심 분리 합니다. 여기에서는 전통적인 절차에 비해 적은 시간과 노력으로 골 수를 분리 하는 안정적이 고 안전한 방법을 소개 합니다. 밀도 구배 원심 분리의 사용과 함께, 우리는 시험관 내에서 완전히 분화 된 파 골 세포의 다량을 얻습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

파 골 세포는 거 대 하 고, 다 핵 이며, 단 핵 구 또는 대 식 세포 전 구체의 융합에 의해 형성 되는 모노 이트-대 식 세포의 혈통을 뼈-의존 한다. 과도 한 뼈 재흡수는 골 수 질환을 선도 하는 가장 중요 한 세포 메커니즘 중 하나입니다, 골다공증을 포함 하 여, 치 주 염, 그리고 주위 인공 골 분해. 파 골 세포의 주요 생리 적 기능은 하이드 록 시 아파 타이트 미네랄 성분과 뼈의 유기 매트릭스를 모두 흡수 하 여 뼈 표면에 특징적인 재흡수 모양을 생성 하는 것입니다. 본문에 다른 세포에 비해 상대적으로 적은 파 골 균이 있다, 특히 성인 뼈에. 최근 연구는 더 짧은 시간에 더 성숙한 파 골 세포를 얻는 방법에 초점을 맞추고 있다,이는 항상 문제가 있었다. 분리 및 배양 기술의 몇몇 개선은 더 성숙한 파 골 세포를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기에서는 특수 하 고 간단한 장치를 사용 하 여 기존 절차에 비해 적은 시간에 골 수를 분리 하는 방법을 소개 합니다. 밀도 구배 원심 분리를 사용 하 여, 우리는 고전적인 방법으로 확인 되는 쥐 골 수에서 완전히 분화 된 파 골 세포의 다량을 얻습니다.

이 프로토콜의 목적은 다 수의 파 골 세포 전 구체를 편리 하 게 분리 및 정제 하 고 파 골 세포를 성공적으로 유도 하는 것 이었다. M-CSF와 RANKL으로 보충 하 여 5 ~ 6 일에 거 대 한 파 골 세포를 볼 수 있었습니다. 파 골 세포의 형성은 트랩 염색에 의해 성공적으로 규명 되었다 (도 1a). 크고 보라색 세포는 여러 핵 (일반적으로 ≥ 3 개의 핵)을 가진 함정 ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

이 방법은 시험관내에서 완전히 분화된 골세포의 다량을 얻는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 방법의 주요 장점은 더 안정적이고 안전하며 전통적인 절차에 비해 적은 노력으로 적은 시간에 골수를 격리한다는 것입니다. 이 기술은 골다공증, 패러디염 및 periprosthetic 골다정수를 포함하여 뼈 대사 질병의 중요한 객체인 골다락의 안정한 근원을 제공할 수 있습니다.사소한 수정으로, 이 프로토콜은 또한 쥐 또는 그밖 동물에 있는 세포를 파생한 골수의 각종 종류를 얻기에 적합할 수 있습니다. 우선, 안락사된 동물을 소핀 위치에 있는 소독된 보드에 놓습니다. 멸균 가위를 사용하여 근해 대퇴골에서 약 1센티미터 길이의 절개를 만들어 피부를 벗겨냅니다.다음으로, 대퇴골과 티바이어스를 해부한다. 조심스럽게 부드럽게, 고관절 주위 양측 연결 부분을 잘라, 무릎, 발목 관절은 티바이어스와 대퇴골을 분리. 뼈 주위 조직의 일부를 잘라 철저 하 게 있는지 확인.그런 다음 청소된 뼈를 완전한 배양 배지 5밀리리터가 있는 접시에 넣습니다. 멸균 가위를 사용하여 긴 뼈를 잘라냅니다. 1 밀리리터 주사기 바늘을 사용하여 골수 구멍이 흰색으로 변할 때까지 10 밀리리터의 완전한 미디어로 골수 구멍을 조심스럽게 플러시하십시오.이 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 70 마이크로미터 여과기로 필터링하여 나머지 조직을 제거합니다. 적혈구 용해 버퍼 5밀리리터를 넣고 8분 동안 얼음 에 세포를 배양합니다. 그 후, 세포 펠릿을 산출하기 위해 5분 동안 250배 G에서 세포를 원심분리한다.수퍼내티퍼를 흡인하고 완전한 매체의 10 밀리리터에서 세포를 재일시 중단합니다. 혈종계를 사용하여 셀을 계산하고 이 메서드에 대해 취한 작업에 소요된 시간을 계산합니다. 첫째, 소염된 보드에 안락사 된 동물을 척추 위치에 놓습니다.멸균 가위를 사용하여 근해 대퇴골에서 약 1센티미터 길이의 절개를 만들어 피부를 벗겨냅니다. 다음으로, 대퇴골과 티바이어스를 해부한다. 조직을 완전히 제거 할 필요가 없지만 뼈 주위의 조직의 일부를 잘라냅니다.PBS의 12 밀리리터로 티비아와 대퇴골을 헹구고 반으로 자른다. 스네핑된 티에비아와 대퇴골을 준비된 1밀리리터 파이펫 팁에 넣고 준비된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 원심 분리는 튜브를 1, 000 배 G에서 세 번, 45 초 동안 섭씨 4도에서 세 번 분리합니다.그 후, 튜브에서 뼈가 들어 있는 파이펫 팁을 제거하고 골수를 튜브에 둡시합니다. 튜브에 PBS 200 마이크로리터를 추가하고, 골수를 완전히 분해하기 위해 반복적으로 피펫을 위아래로 넣습니다. 이 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 70 마이크로미터 여과기로 필터링하여 남은 조직을 제거합니다.그런 다음 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 이 섹션에서 취한 단계에 소요된 시간을 계산합니다. 멸균 실리코화된 원심 튜브에 세포 분리 용액 6밀리리터를 추가합니다. 희석된 셀 서스펜션을 튜브에 추가합니다.현탁액을 추가하면 셀 층과 분리 용액 사이에 명확한 제한이 나타납니다. 다음으로, 45도 각도로 튜브의 내부 표면에 파이펫 팁을 부착합니다. 30분 동안 500배 G의 수평 원심분리기에서 층화된 용액을 원심분리합니다.그 후 대상 셀을 위쪽에서 아래로 포함하는 흐린 두 번째 층을 흡인합니다. 대상 셀을 새 튜브로 전송합니다. PBS의 5 밀리리터를 추가하여 세포를 씻고 원심분리기를 5분 동안 250배 G로 세척합니다.총 3개의 세척을 위해 PBS와 원심분리기를 추가하여 이 세척 과정을 반복하십시오. 골수 유도 매체로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.그런 다음, 골수 유도 배지의 5~8밀리리터를 추가하여 밀리리터당 300, 000세포의 최종 세포 용액을 얻습니다. 이 셀 용액의 밀리리터 1밀리리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 24시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양한 후, 배지를 부드럽게 흡인시키고 각 웰에 1밀리리터의 골세포 유도 배지를 추가합니다.접시를 부드럽게 교반하고 인큐베이터에 반환합니다. 48시간마다 각 웰에서 0.8 밀리리터의 골세포 유도 배지를 제거하고 교체하십시오. 접시를 부드럽게 조인하여 인큐베이터로 돌려놓습니다.뼈 조각을 미리 치료하기 시작하려면 마이크로 전기 톱을 사용하여 신선한 소 대퇴골 뼈 피질을 세로 축을 따라 2 센티미터 두께의 슬라이스로 자른다. 슬라이스를 자르고 연마한 후, 탈이온화된 물의 비커에 담그고 1시간 동안 100 헤르츠에서 초음파를 적용하여 슬라이스를 씻으셔도 됩니다. 이 세탁 과정을 세 번 반복하십시오.세척된 슬라이스를 75%의 알코올로 2시간 동안 담급드시면 됩니다. 그런 다음, 알코올을 흡입하고 깨끗한 플랫폼에서 1 시간 동안 자외선에 슬라이스의 각 슬라이드를 노출. toluidine 블루 염색을 시작하려면, 24 웰 플레이트의 우물에 미리 처리 된 뼈 조각을 배치합니다.그 후, 24 웰 플레이트에 배양 배지를 추가하여 2시간 동안 뼈 조각을 담그게 한다. 식물 및 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 유도. 골세포가 4~6일 후에 는 0.25 개의 어금니 암모늄 수산화물로 슬라이스를 씻으시면 됩니다.살아있는 세포를 제거하고 뼈 조각에 재흡수 구덩이의 분석을 허용하기 위해 각각 5 분 동안 슬라이스를 세 번 초음파 처리합니다. 그런 다음, 암모늄 수산화를 제거하고 2 분 동안 슬라이스 당 1 %의 toluidine 블루 용액의 1 밀리리터로 슬라이스를 얼룩지게합니다. PBS로 얼룩 조각을 씻으시다.무작위로 5개의 뷰를 선택하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 재흡수 영역의 반정량 분석을 수행합니다. 먼저, 실온에서 2시간 동안 슬라이스당 2.5%의 글루타랄데히드 1밀리리터로 뼈 조각을 접두사합니다. 전세 된 슬라이스를 3 분 동안 3 분 동안 3 번 초음파 처리하여 수산화 암모늄 1 개를 사용하여 세포를 제거합니다.그런 다음 수산화 암모늄을 제거하고 PBS로 뼈 조각을 세 번 씻고 각 세척은 12 분 동안 지속됩니다. 실온에서 2시간 동안 세척된 뼈 조각을 1%의 오스미산으로 수정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 그라데이션 탈수 작업을 수행합니다.그 후, 에탄올을 이소아밀 아세테이트로 15분간 교체하십시오. 슬라이스를 금 팔라듐으로 코팅하고 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석합니다. 이 연구에서는 많은 수의 골세포 전구체가 분리되고 정제되었으며 성공적으로 골세포가 되도록 유도되었습니다.M-CSF와 RANKL을 보완함으로써, 거대한 골막세포는 5일에서 6일 동안 볼 수 있습니다. 이러한 골세포의 형성은 트랩 염색에 의해 성공적으로 확인된다. 크고 보라색 세포는 다중 핵을 가진 TRAP 양성 세포로 간주됩니다.이 방법을 통해, 24웰 플레이트에서 골세포당 30개의 핵을 함유하는 800개의 골세포를 얻는 것이 일반적이다. 기존 방법에 비해 이 향상된 방법은 전체 격리 프로세스 중에 약 20분을 절약합니다. 뼈 조각을 사용하여 뼈 흡수의 활성을 평가하는 것은 일반적인 시험관 내 방법입니다.toluidine 블루 스테인링을 통해 흡수 영역은 밝은 녹색으로 시각화됩니다. 뼈 구덩이의 구조와 특성은 전자 현미경 검사를 스캔하여 명확하게 관찰 할 수 있습니다. CTR, 골세포 특정 세포 마커 중 하나, 골세포를 식별 하 고 뼈에 있는 골세포의 형성을 연구 하는 것이 중요 하다.CTR의 긍정적 인 표현은 명확하게 골을 식별하고 대식세포 폴리 카리온에서 구별. CTR은 녹색색에 의해 면역형광 분석기에서 명확하게 표시되고, 파란색은 세포 핵을 나타낸다. 골수를 잃지 않도록 대퇴골과 티바이어스를 골절하지 않도록하십시오.이전에이 기술을 수행 한 적이없는 개인은 세포 수술 솔루션을 도울 때 어려움을 겪을 수 있습니다. 파이펫 팁은 튜브의 내부 표면에 부착하고 내부 표면에 45도 각도로 유지되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

골수에 조혈 세포의 유도

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...