Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81473692) til Yong ma. Forfatterne takker alle ansatte i Medical Research Center i den første College of Clinical Medicine i Nanjing University of Chinese Medicine.

Alle metodene som involverer dyrene er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Nanjing University of Chinese Medicine.
1. oppsett
<ol><li>Forbered flere lengderetningen klipp 1 mL pipette tips (1 cm) og flere 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Sett pipette tips og mikrosentrifugen rør ved 103 kPa og 121 ° c i 20 min og sikre at de er sterile.</li>
	<li>Forbered en eske med is og flere sterile retter for å bevare det isolerte vevet under isolasjons p...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

Evnen til å skaffe og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grunnleggende ferdighet for enhver forsker som ønsker å studere bein metabolisme, som kan bidra til å forstå mekanismene for Ben-absorberende sykdommer og utvikle romanen terapeutiske midler. Den foreliggende studien beskrev en protokoll med noen modifikasjoner basert på tidligere metoder.
Ved å bruke pipette tips og mikrosentrifugen rør for å få benmarg, det i stor grad redusert operasjonstiden for å skaffe benmar...

Bone homeostase er en kompleks fysiologisk prosess som er regulert av Ben-resorbing osteoklaster og bein-forming osteoblaster1. En balanse mellom osteoblastaktivitet og osteoclastic aktivitet formidlet gjennom osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er svært viktig for å opprettholde bein helse og homeostase, fordi forstyrrelser i bein homeostase kan føre til bein sykdommer, slik som unormal bein vekst eller tap av bentetthet. Som unike Ben-resorpsjon celler, osteoklaster er viktige i sykdommer knyttet til unormal bein ødeleggelse, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis2,3.
Utviklingen av en osteoclast kultur er i hovedsak delt inn i to etapper. Metodene etablert av Boyde et al.4 og Chambers et al.5 komponerte den første etappen på 1980-tallet. De fikk relativt rikelig osteoklaster fra bein av nyfødte dyr, som er den raske remodeling perioden. Osteoklaster er utgitt av fragmentering og stirring beina i et spesielt medium. Men cellene innhentet av denne metoden er lav i kvantitet og renhet. Den andre fasen var utviklingen av langtrekkende kulturer av osteoclast formasjon, bruker blodkreft avstamning celler avledet fra benmarg6. Cytokiner, som 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), og parathyroid hormon (PTH), som er lagt inn i kulturen medium, handle gjennom systemet av osteoblaster/stromal celler for å stimulere osteoclast formasjon7,8 . Imidlertid kan renheten og mengden av osteoklaster innhentet av denne metoden ikke oppfyller behovene til moderne molekylærbiologi forskning. Deretter oppdagelsen av macrophage koloni-stimulerende Factor (M-CSF) og reseptor aktivator for kjernefysisk faktor-KB ligand (RANKL) gjør osteoclastogenesis enklere9,10,11, og metoden for å bruke M-CSF og RANKL å direkte stimulere osteoclast formasjon er mye brukt rundt om i verden. Det er imidlertid fortsatt noen detaljer i metodikken som må forbedres.
Foreløpig den mest brukte osteoclast kultur metoden, som beskrevet av Marino et al.12 og Pei et al.13, ofte krever fjerning av omkringliggende vev rundt benet og bruker en sterilisert nål for å skylle margen hulrom med fullførte medier. Det er noen ulemper med denne prosessen, inkludert det faktum at (1) fjerning av omkringliggende vev rundt benet krever mye tid og stor kirurgisk teknikk, (2) beina er skjøre og kan føre til benmarg utløp, (3) benmargen hulrom kan være for liten til å spyle, og (4) det er en risiko for nål Stick skade. For å unngå disse problemene, sentrifuger vi rørene som inneholder bein for benmarg i stedet for nål-Flushing benmargen. Her introduserer vi en stabil og sikker metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren. Sammen med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteoklaster er store, multinucleated, og Ben-resorbing celler av monocytt-macrophage avstamning som er dannet av fusjon av monocytter eller macrophage forløpere. Overdreven bein resorpsjon er en av de mest betydningsfulle cellulære mekanismer som fører til osteolytiske sykdommer, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis. Den viktigste fysiologiske funksjon av osteoklaster er å absorbere både hydroksyapatitt mineral komponent og organisk matrise av bein, genererer den karakteristiske resorpsjon utseende på overflaten av bein. Det er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, spesielt i voksen bein. Nyere studier har fokusert på hvordan å få mer modne osteoklaster på kortere tid, som alltid har vært et problem. Flere forbedringer i isolasjon og kultur teknikker har utviklet seg i laboratorier for å oppnå mer modne osteoklaster. Her introduserer vi en metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren, ved hjelp av en spesiell og enkel enhet. Med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster fra rotte benmarg, som er identifisert av klassiske metoder.

Formålet med protokollen var å isolere og rense et stort antall osteoclast forløpere bekvemt og indusere osteoklaster vellykket. Ved å supplere med M-CSF og RANKL ble gigantiske osteoklaster sett på dag 5 – 6. Dannelsen av osteoklaster ble vellykket identifisert ved TRAP farging (figur 1a). Store og lilla celler ble betraktet som TRAP-positive celler med flere kjerner (vanligvis ≥ tre kjerner). Gjennom denne metoden var det typisk å skaffe 800 osteo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolasjon, rensing, og differensiering av Osteoclast forløpere fra Rat Bone marg

Osteoklaster er vev-spesifikke macrophage polykaryons avledet fra monocytt-macrophage avstamning av blodkreft stamceller. Denne protokollen beskriver hvordan du isolerer benmargceller slik at store mengder osteoklaster oppnås samtidig redusere risikoen for ulykker som finnes i tradisjonelle metoder.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Denne metoden er betydelig fordi den kan brukes til å skaffe store mengder fullt differensierte osteoklaster in vitro. Den største fordelen med denne metoden er at den er mer stabil og trygg og isolerer benmarg på kortere tid og med mindre innsats i forhold til den tradisjonelle fortsettende. Denne teknikken kan gi en stabil kilde til osteoklaster, som er det viktige objektet for bein metabolsk sykdom, inkludert osteoporose, parodontitt og periprosthetisk osteolyse.Med mindre modifikasjoner kan denne protokollen også være hensiktsmessig for å skaffe ulike typer benmarg avledet cellene hos rotter eller andre dyr. For å begynne, plasser eutaniserte dyr på et desinfisert bord i en liggende stilling. Ved hjelp av steril saks, gjør et snitt omtrent en centimeter i lengde på proksimal lårben for å skrelle huden.Deretter dissekere ut lårben og tibias. Forsiktig og forsiktig, kutt de bilaterale tilkoblingsdelene rundt hofte-, kne- og ankelleddene for å isolere tibias og lårben. Klipp av en del av vevet rundt beinet, og sørg for å være grundig.Deretter legger du de rengjorte beinene i en tallerken med fem milliliter med komplett kulturmedium. Bruk steril saks for å kutte av det lange beinet. Bruk en en milliliter sprøytenål til å skylle marghulen forsiktig med 10 milliliter komplette medier til marghulen blir hvit.Overfør denne cellefjæringen til et 50 milliliter rør og filtrer den med en 70 mikrometersil for å fjerne det gjenværende vevet. Tilsett fem milliliter rødblods lysisbuffer, og inkuber cellene på is i åtte minutter. Etter dette sentrifuger cellene ved 250 ganger G i fem minutter for å gi cellepellet.Aspirer de overnaturante og gjenoppusse cellene i 10 milliliter med komplette medier. Bruk et hemocytometer til å telle cellene, og beregne tiden som brukes på handlingene som er tatt for denne metoden. Først plasserer du eutaniserte dyr på et desinfisert bord i en liggende stilling.Ved hjelp av steril saks, gjør et snitt omtrent en centimeter i lengde på proksimal lårben for å skrelle huden. Deretter dissekere ut lårben og tibias. Klipp av delene av vevet rundt beinet, selv om det ikke er nødvendig å fjerne vevet helt.Skyll tibias og lårben med 12 milliliter PBS, og kutt dem deretter i to. Legg de snipped tibias og lårben i en forberedt en milliliter pipette tips, og legg dette i en forberedt mikro sentrifuge rør. Sentrifuger røret tre ganger ved 1000 ganger G og ved fire grader Celsius i 45 sekunder.Etter dette fjerner du pipettespissen som inneholder beinet fra røret, og etterlater benmargen i røret. Tilsett 200 mikroliter PBS i røret, og pipette opp og ned gjentatte ganger for å gå grundig i oppløsning. Overfør denne cellefjæringen til et 50 milliliter rør, og filtrer den med en 70 mikrometersil for å fjerne eventuelle gjenværende vev.Deretter bruker du et hemocytometer til å telle cellene, og beregne tiden som er brukt på trinnene som er tatt i denne delen. Tilsett seks milliliter celleseparasjonsløsning til et sterilt silicifisert sentrifugalrør. Tilsett fortynnet cellefjæring i røret.Når du har lagt til suspensjonen, vises en klar grense mellom laget av celler og separasjonsløsningen. Deretter fester du en pipettespiss til den indre overflaten av røret i en 45 graders vinkel. Sentrifuger den lagdelte oppløsningen i en horisontal sentrifuge ved 500 ganger G i 30 minutter.Etter dette aspirerer du det overskyede andre laget som inneholder målcellene fra topp til bunn. Overfør målcellene til et nytt rør. Tilsett fem milliliter PBS for å vaske cellene, og sentrifuge ved 250 ganger G i fem minutter.Gjenta denne vaskeprosessen ved å legge til PBS og sentrifugering for totalt tre vasker. Resuspend cellepellet med benmargsinduksjonsmedium. Bruk et hemocytometer for å telle cellene.Deretter legger du til fem til åtte milliliter benmargsinduksjonsmedium for å oppnå en endelig celleløsning på 300 000 celler per milliliter. Tilsett en milliliter av denne celleløsningen til hver brønn av en 24 brønnplate. Etter inkubering av cellene ved 37 grader Celsius i 24 timer, aspirer forsiktig av mediet og tilsett en milliliter osteoklastinduksjonsmedium til hver brønn.Rør platen forsiktig og returner den til inkubatoren. Hver 48 timer, fjerne og erstatte 0,8 milliliter osteoklast induksjon medium fra hver brønn. Sett platen forsiktig om før du returnerer den til inkubatoren.For å begynne å forhåndsbefinne beinskivene, bruk en mikroelektrisk sag til å kutte den friske storfe lårbencortexen i to centimeter tykke skiver langs langsgående akse. Etter å ha kuttet og slipt skivene, vask skivene ved å senke dem ned i et beger av deionisert vann og utsette dem for ultralyd ved 100 hertz i en time. Gjenta denne vaskeprosessen tre ganger.Senk de vasket skiver i 75% alkohol i to timer. Deretter aspirerer du av alkoholen og utsetter hvert lysbilde av skiver for ultrafiolett lys i en time på en ren plattform. For å begynne toluidin blå flekker, plasser de forhåndsbehandlede beinskivene i brønnene på 24-brønnplaten.Etter dette legger du til kulturmedium i 24-brønnplaten for å senke beinskivene i to timer. Plant og indusere cellene som vist tidligere. Etter osteoklaster har dukket opp på fire til seks dager, vask skivene med en milliliter på 0,25 molar ammoniumhydroksid.Sonicate skivene tre ganger i fem minutter hver for å fjerne de levende cellene og for å tillate analyse av resorpsjonsgroper på beinskiver. Fjern deretter ammoniumhydroksid og beis skivene med en milliliter 1% toluidinblå oppløsning per skive i to minutter. Vask flekkskivene med PBS.Velg tilfeldig fem visninger og bruk en bildeanalyseprogramvare til å utføre en semi-kvantitativ analyse av resorpsjonsområdet. Først prefiks bein skiver med en milliliter på 2,5% glutaraldehyd per skive i to timer ved romtemperatur. Sonicate prefiks skiver tre ganger i tre minutter hver med en molar ammoniumhydroksid for å fjerne cellene.Fjern deretter ammoniumhydroksid og vask beinskivene tre ganger med PBS, med hver vask som varer i 12 minutter. Fest de vasket beinskivene med 1% osmisk syre i to timer ved romtemperatur. Utfør etanolgradient dehydrering som beskrevet i tekstprotokollen.Etter dette erstatter du etanol med isoamylacetat i 15 minutter. Coat skiver med gull palladium og analysere dem ved å skanne elektron mikroskopi. I denne studien ble et stort antall osteoklast forløpere isolert, renset og vellykket indusert til å bli osteoklaster.Ved å supplere med M-CSF og RANKL, er gigantiske osteoklaster sett på dag fem til seks. Dannelsen av disse osteoklaster er vellykket identifisert ved fellefarging. Store og lilla celler regnes som TRAP positive celler med flere kjerner.Gjennom denne metoden er det typisk å få 800 osteoklaster som inneholder så mange som 30 kjerner per osteoklalast i en 24 brønnplate. Sammenlignet med den tradisjonelle metoden sparer denne forbedrede metoden ca. 20 minutter under hele isolasjonsprosessen. Bruk av beinskiver for å vurdere aktiviteten til beinresorpsjon er en typisk in vitro-metode.Gjennom toluidinblå flekker visualiseres resorpsjonsområdet som lys grønn. Strukturen og egenskapene til beingroper kan tydelig observeres ved å skanne elektronmikroskopi. CTR, en av osteoklaster spesifikke cellemarkører, er avgjørende for å identifisere osteoklaster og studere dannelsen av osteoklaster i bein.Det positive uttrykket for CTR identifiserer tydelig osteoklaster og skiller dem fra makrofagpolykaryoner. CTR er tydelig angitt i immunofluorescence analysene med en grønn farge, mens den blå indikerer cellekjernene. Pass på å ikke bryte lårbenet og tibias for å unngå å miste benmarg.En person som aldri har utført denne teknikken før, kan slite når de hjelper cellene med å finne en løsning. Pipettespissen må festes til den indre overflaten av røret og holdes i en 45 graders vinkel til den indre overflaten.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av Blood-fartøy-avledet multipotent Forstadier fra Menneskelig Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclast Utledning fra Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering og karakterisering differensiering av Cardiac stamceller fra voksen mus hjertet

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolasjon og differensiering av primærhvite og brune preadipocytter fra nyfødte mus

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...