Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81473692) para Yong ma. Os autores agradecem a todos os funcionários do centro de investigação médica da primeira faculdade de medicina clínica na Universidade de Nanjing de medicina chinesa.

Todos os métodos que envolvem os animais aqui descritos são aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de medicina chinesa de Nanjing.
1. configuração
<ol><li>Prepare várias pontas de pipeta de 1 mL longitudinalmente cortadas (1 cm) e vários tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Põr as pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador em 103 kPa e em 121 ° c por 20 minutos e assegure-se de que estejam estéreis.</li>
	<li>Prepare uma caix...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

A capacidade de obter e estudar osteoclastos in vitro é uma habilidade crítica e fundamental para qualquer pesquisador que deseje estudar o metabolismo ósseo, o que pode ajudar a compreender os mecanismos de doenças absorventes de ossos e desenvolver novos agentes terapêuticos. O presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.
Usando pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador para obter a medula, reduziu pela maior parte o tempo da...

A homeostase óssea é um processo fisiológico complexo que é regulado por osteoclastos de reabsorção óssea e osteoblastos de formação óssea1. Um equilíbrio entre a atividade osteoblástica e osteoclástica mediada por osteoblastos e osteoclastos, respectivamente, é altamente essencial para manter a saúde óssea e a homeostase, pois as perturbações na homeostase óssea podem levar a doenças ósseas, tais como crescimento ósseo anormal ou perda da densidade óssea. Como células únicas de reabsorção óssea, os osteoclastos são importantes em doenças relacionadas à destruição óssea anormal, incluindo osteoporose, periodontite e osteólise periprotética2,3.
O desenvolvimento de uma cultura osteoclast é dividido principalmente em dois estágios. Os métodos estabelecidos por Boyde et al.4 e Chambers et al.5 compuseram a primeira etapa na década de 1980. Obtiveram osteoclastos relativamente abundantes dos ossos de animais recém-nascidos, que é o período de remodelação rápido. Os osteoclastos são liberados fragmentando e agitando os ossos em um meio especial. No entanto, as células obtidas por este método são baixas em quantidade e pureza. O segundo estágio foi o desenvolvimento de culturas de longa distância de formação de osteoclast, utilizando células de linhagem hematopoiéticas derivadas da medula óssea6. Citocinas, como 1α, 25-dihidroxivitamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2) e hormônio paratireóide (PTH), que são adicionadas ao meio de cultura, atuam através do sistema de osteoblastos/células estromais para estimular a formação de osteoclast7,8 . Entretanto, a pureza e a quantidade de osteoclastos obtidos por este método não podem encontrar as necessidades da pesquisa moderna da biologia molecular. Então, a descoberta do fator deestimulação do macrófago (M-CSF) e do activador do receptor para o ligante do fator-κB nuclear (RANKL) faz a osteoclastogênese mais fácil9,10,11, e o método de usar M-CSF e RANKL para estimular diretamente osteoclast formação é amplamente utilizado em todo o mundo. No entanto, ainda existem alguns detalhes na metodologia que precisam ser melhoradas.
Atualmente, o método de cultura osteoclast mais comumente utilizado, como descrito por Marino et al.12 e Pei et al.13, muitas vezes requer a remoção do tecido circundante ao redor do osso e usa uma agulha esterilizada para liberar a cavidade da medula com mídia concluída. Há algumas desvantagens para este processo, incluindo o fato de que (1) a remoção do tecido circundante ao redor do osso requer muito tempo e grande técnica cirúrgica, (2) os ossos são frágeis e podem levar à saída da medula óssea, (3) a cavidade da medula óssea pode ser demasiado minúsculo para nivelar, e (4) há um risco de ferimento da vara da agulha. Para evitar estes problemas, nós centrifugamos os tubos contendo os ossos para a medula óssea em vez de agulha-liberando a medula óssea. Aqui, apresentamos um método estável e seguro que isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforço em comparação com o procedimento tradicional. Juntamente com o uso da centrifugação de gradiente de densidade, obtemos grandes quantidades de osteoclastos totalmente diferenciados in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Os osteoclastos são grandes, multinucleados, e células de reabsorção óssea da linhagem monócitos-macrófago que são formadas pela fusão de monócitos ou precursores de macrófago. O reabsorção excessivo do osso é um os mecanismos celulares os mais significativos que conduzem às doenças osteolytic, incluindo a osteoporose, o periodontitis, e o osteolysis periprotético. A principal função fisiológica dos osteoclastos é absorver tanto o componente mineral de hidroxiapatita quanto a matriz orgânica do osso, gerando a aparência característica de reabsorção na superfície dos ossos. Existem relativamente poucos osteoclastos em comparação com outras células do corpo, especialmente em ossos adultos. Estudos recentes têm se concentrado em como obter mais osteoclastos maduros em menos tempo, o que sempre foi um problema. Várias melhorias nas técnicas de isolamento e cultura desenvolveram-se em laboratórios, a fim de obter mais osteoclastos maduros. Aqui, apresentamos um método que isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforço em comparação com o procedimento tradicional, utilizando um dispositivo especial e simples. Com o uso da centrifugação do inclinação da densidade, nós obtemos grandes quantidades de osteoclastos inteiramente diferenciados da medula do osso do rato, que são identificados por métodos clássicos.

A finalidade do protocolo era isolar e purificar grandes números de precursores do osteoclast convenientemente e induzir osteoclastos com sucesso. Suplementando com o M-CSF e o RANKL, os osteoclastos gigantes foram vistos nos dias 5 – 6. A formação de osteoclastos foi identificada com sucesso pela coloração TRAP (Figura 1a). As pilhas grandes e roxas foram consideradas como pilhas armadilha-positivas com núcleos múltiplos (tipicamente ≥ três núcl...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Este método é significativo porque pode ser usado para obter grandes quantidades de osteoclastas totalmente diferenciadas in vitro. A principal vantagem deste método é que ele é mais estável e seguro e isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforços em comparação com o processo tradicional. Esta técnica pode fornecer uma fonte estável de osteoclatos, que são o objeto importante da doença metabólica óssea, incluindo osteoporose, parodonte e osteolise periprotética.Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser apropriado para a obtenção de vários tipos de medula óssea derivadas das células em ratos ou outros animais. Para começar, coloque animais eutanizados em uma tábua desinfetada em uma posição supina. Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão de aproximadamente um centímetro de comprimento no fêmur proximal para descascar a pele.Em seguida, disseque os fêmures e tíbias. Com cuidado e cuidado, corte as partes de conexão bilaterais ao redor das articulações do quadril, joelho e tornozelo para isolar as tíbias e os fêmures. Corte parte dos tecidos ao redor do osso, certificando-se de ser minucioso.Em seguida, coloque os ossos limpos em um prato com cinco mililitros de meio de cultura completa. Use uma tesoura estéril para cortar o osso longo. Use uma agulha de seringa de um mililitro para lavar cuidadosamente a cavidade da medula com 10 mililitros de mídia completa até que a cavidade da medula fique branca.Transfira esta suspensão celular para um tubo de 50 mililitros e filtre-a com um coador de 70 micrômetros para remover o tecido restante. Adicione cinco mililitros de tampão de sangue vermelho e incuba as células no gelo por oito minutos. Depois disso, centrifugar as células a 250 vezes G por cinco minutos para produzir a pelota celular.Aspire o supernasce e resuspenda as células em 10 mililitros de mídia completa. Use um hemótmetro para contar as células e calcular o tempo gasto nas ações tomadas para este método. Primeiro, coloque animais eutanizados em uma tábua desinfetada em uma posição supina.Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão de aproximadamente um centímetro de comprimento no fêmur proximal para descascar a pele. Em seguida, disseque os fêmures e tíbias. Corte as partes dos tecidos ao redor do osso, embora não haja necessidade de remover o tecido completamente.Enxágüe as tíbias e os fêmures com 12 mililitros de PBS, e depois corte-os ao meio. Coloque as tíbias e os fêmures cortados em uma ponta de pipeta de um mililitro preparado, e coloque-a em um tubo de micro centrífuga preparado. Centrifugar o tubo três vezes a 1.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 45 segundos.Depois disso, remova a ponta da pipeta contendo o osso do tubo, deixando a medula óssea no tubo. Adicione 200 microliters de PBS ao tubo, e pipeta para cima e para baixo repetidamente para desintegrar a medula completamente. Transfira esta suspensão celular para um tubo de 50 mililitros e filtre-a com um coador de 70 micrômetros para remover os tecidos restantes.Em seguida, use um hemócito para contar as células e calcular o tempo gasto nas etapas tomadas nesta seção. Adicione seis mililitros de solução de separação celular a um tubo centrífugo silicificado estéril. Adicione a suspensão da célula diluída ao tubo.Após a adição da suspensão, aparecerá um limite claro entre a camada das células e a solução de separação. Em seguida, adere uma ponta de pipeta à superfície interna do tubo em um ângulo de 45 graus. Centrifugar a solução em camadas em uma centrífuga horizontal a 500 vezes G por 30 minutos.Depois disso, aspire a segunda camada nublada que contém as células-alvo de cima para baixo. Transfira as células-alvo para um novo tubo. Adicione cinco mililitros de PBS para lavar as células, e centrífuga a 250 vezes G por cinco minutos.Repita este processo de lavagem adicionando PBS e centrifugando para um total de três lavagens. Resuspenque a pelota celular com meio de indução de medula óssea. Use um hemótmetro para contar as células.Em seguida, adicione cinco a oito mililitros de meio de indução de medula óssea para obter uma solução de células finais de 300.000 células por mililitro. Adicione um mililitro desta solução celular a cada poço de uma placa de 24 poços. Depois de incubar as células a 37 graus Celsius por 24 horas, aspire suavemente o meio e adicione um mililitro de meio de indução de osteoclato para cada poço.Agitar suavemente a placa e devolvê-la à incubadora. A cada 48 horas, remova e substitua 0,8 mililitros de meio de indução osteoclasta de cada poço. Agitar a placa suavemente antes de devolvê-la à incubadora.Para começar a pré-tratar as fatias ósseas, use uma micro serra elétrica para cortar o córtex ósseo femoral bovino fresco em fatias de dois centímetros de espessura ao longo do eixo longitudinal. Depois de cortar e moer as fatias, lave as fatias imergindo-as em um béquer de água desionizada e submetendo-as ao ultrassom a 100 hertz por uma hora. Repita este processo de lavagem três vezes.Mergulhe as fatias lavadas em 75% de álcool por duas horas. Em seguida, aspire o álcool e exponha cada slide de fatias à luz ultravioleta por uma hora em uma plataforma limpa. Para começar a coloração azul de toluidina, coloque as fatias ósseas pré-tratadas nos poços da placa de 24 poços.Depois disso, adicione o meio cultura na placa de 24 poços para imergir as fatias ósseas por duas horas. Plante e induza as células como demonstrado anteriormente. Depois que os osteoclatos aparecerem em quatro a seis dias, lave as fatias com um mililitro de 0,25 hidróxido de amônio molar.Sonicar as fatias três vezes por cinco minutos cada para remover as células vivas e permitir a análise das fossas de resorção nas fatias ósseas. Em seguida, remova o hidróxido de amônio e manche as fatias com um mililitro de solução azul toluidina de 1%toluidina por fatia por dois minutos. Lave as fatias de manchas com PBS.Selecione aleatoriamente cinco visualizações e use um software de análise de imagem para realizar uma análise semi-quantitativa da área de reabsorção. Primeiro, prefixe as fatias ósseas com um mililitro de 2,5% glutaraldeído por fatia por duas horas em temperatura ambiente. Sonicar as fatias prefixadas três vezes por três minutos cada com um hidróxido de amônio molar para remover as células.Em seguida, retire o hidróxido de amônio e lave as fatias ósseas três vezes com PBS, com cada lavagem com duração de 12 minutos. Fixar as fatias ósseas lavadas com ácido 1%osmímico por duas horas em temperatura ambiente. Realize a desidratação do gradiente de etanol conforme descrito no protocolo de texto.Depois disso, substitua o etanol por acetato isoamyl por 15 minutos. Cubra as fatias com paládio de ouro e analise-as escaneando microscopia eletrônica. Neste estudo, um grande número de precursores osteoclatos foram isolados, purificados e induzidos com sucesso para se tornarem osteoclartos.Ao suplementar com M-CSF e RANKL, os osteoclartos gigantes são vistos nos dias cinco a seis. A formação desses osteoclastos é identificada com sucesso pela coloração da armadilha. Células grandes e roxas são consideradas células trap positivas com múltiplos núcleos.Através deste método, é típico obter 800 osteoclartos contendo até 30 núcleos por osteoclato em uma placa de 24 poços. Em comparação com o método tradicional, este método aprimorado economiza aproximadamente 20 minutos durante todo o processo de isolamento. O uso de fatias ósseas para avaliar a atividade da resorção óssea é um método in vitro típico.Através da coloração azul toluidina, a área de resorção é visualizada como verde claro. A estrutura e características dos poços ósseos podem ser claramente observadas pela microscopia eletrônica de varredura. A CTR, um dos marcadores celulares específicos dos osteoclatos, é fundamental para identificar os osteoclatos e estudar a formação de osteoclatos no osso.A expressão positiva da CTR identifica claramente os osteoclatos e os distingue dos policaons macrófagos. A CTR é claramente indicada nos ensaios de imunofluorescência por uma cor verde, enquanto o azul indica os núcleos celulares. Certifique-se de não fraturar os fêmures e as tíbias para evitar perder medula óssea.Um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes pode ter dificuldades ao auxiliar na solução de operação das células. A ponta da pipeta deve ser aderida à superfície interna do tubo e mantida em um ângulo de 45 graus à superfície interna.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

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It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

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Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

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