Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
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Esta obra fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81473692) a Yong MA. Los autores agradecen a todo el personal del centro de investigación médica del primer Colegio de medicina clínica de la Universidad de Medicina China de Nanjing.

Todos los métodos que involucran a los animales descritos aquí son aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Medicina China de Nanjing.
1. Setup
<ol><li>Prepare varias puntas de pipetas longitudinalmente cortadas de 1 mL (1 cm) y varios tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Poner las puntas de las pipetas y los tubos de microcentrífuga a 103 kPa y 121 ° c durante 20 min y asegurarse de que son estériles.</li>
	<li>Prepare una caja de...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

La capacidad de obtener y estudiar osteoclastos in vitro es una habilidad crítica y fundamental para cualquier investigador que desee estudiar el metabolismo óseo, lo que puede ayudar a comprender los mecanismos de las enfermedades que absorben los huesos y desarrollar nuevos agentes terapéuticos. El presente estudio describió un protocolo con algunas modificaciones basadas en métodos anteriores.
Mediante el uso de puntas de pipetas y tubos de microcentrífuga para obtener médula ósea, ...

La la homeostasis ósea es un proceso fisiológico complejo que está regulado por osteoclastos de resorto óseo y osteoblastos de formación ósea1. Un equilibrio entre la actividad osteoblástica y osteoclástica mediada a través de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente, es muy esencial para mantener la salud ósea y la la homeostasis, porque las perturbaciones en la la homeostasis ósea pueden conducir a enfermedades óseas, tales como crecimiento óseo anormal o pérdida de densidad ósea. Como células únicas de resorción ósea, los osteoclastos son importantes en enfermedades relacionadas con la destrucción ósea anormal, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica2,3.
El desarrollo de un cultivo de los osteoclastos se divide principalmente en dos etapas. Los métodos establecidos por Boyde et al.4 y Chambers et al.5 componían la primera etapa de la década de 1980. Obtuvieron osteoclastos relativamente abundantes de los huesos de los animales recién nacidos, que es el período de remodelación rápida. Los osteoclastos se liberan al fragmentar y agitar los huesos en un medio especial. Sin embargo, las células obtenidas por este método son bajas en cantidad y pureza. La segunda etapa fue el desarrollo de cultivos de largo alcance de formación de osteoclastos, utilizando células de linaje hematopoyético derivadas de la médula ósea6. Citoquinas, tales como 1 α, 25-dihidroxivitamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), y la hormona paratiroidea (PTH), que se añaden en el medio de cultivo, actúan a través del sistema de osteoblastos/células del stromal para estimular la formación de los osteoclastos7,8 . Sin embargo, la pureza y la cantidad de osteoclastos obtenidos por este método no pueden satisfacer las necesidades de la investigación moderna de biología molecular. Luego, el descubrimiento del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador de receptores para el ligando de factor nuclear-κB (RANKL) hacen que la osteoclastogénesis sea más fácil9,10,11, y el método de uso de M-CSF y RANKL para estimular directamente la formación de los osteoclastos es ampliamente utilizado en todo el mundo. Sin embargo, todavía hay algunos detalles en la metodología que deben mejorarse.
En la actualidad, el método de cultivo de los osteoclastos más utilizado, según lo descrito por marino et al.12 y PEI et al.13, a menudo requiere la extirpación del tejido circundante alrededor del hueso y utiliza una aguja esterilizada para vaciar la cavidad de la médula con medios completados. Hay algunos inconvenientes en este proceso, incluyendo el hecho de que (1) la eliminación del tejido circundante alrededor del hueso requiere mucho tiempo y gran técnica quirúrgica, (2) los huesos son frágiles y pueden conducir a la salida de la médula ósea, (3) la cavidad de la médula ósea podría ser demasiado pequeño para vaciar, y (4) hay un riesgo de lesión de pinchazo de aguja. Para evitar estos problemas, centrifugamos los tubos que contienen los huesos para la médula ósea en lugar de lavar la médula ósea con la aguja. Aquí, introducimos un método estable y seguro que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional. Junto con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Los osteoclastos son células grandes, multinucleadas y que recurren al hueso del linaje de monocitos y macrófagos que se forman mediante la fusión de monocitos o precursores de macrófagos. La resorción ósea excesiva es uno de los mecanismos celulares más significativos que conducen a enfermedades osteolíticas, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica. La principal función fisiológica de los osteoclastos es absorber tanto el componente mineral de hidroxiapatita como la matriz orgánica de hueso, generando la apariencia de resorción característica en la superficie de los huesos. Hay relativamente pocos osteoclastos en comparación con otras células en el cuerpo, especialmente en los huesos adultos. Estudios recientes se han centrado en cómo obtener osteoclastos más maduros en menos tiempo, lo que siempre ha sido un problema. En los laboratorios se han desarrollado varias mejoras en las técnicas de aislamiento y cultivo para obtener osteoclastos más maduros. Aquí, introducimos un método que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional, utilizando un dispositivo especial y simple. Con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados de la médula ósea de rata, que se identifican mediante métodos clásicos.

El propósito del protocolo era aislar y purificar un gran número de precursores de los osteoclastos convenientemente e inducir a los osteoclastos con éxito. Complementando con M-CSF y RANKL, se observaron osteoclastos gigantes en los días 5 – 6. La formación de osteoclastos se identificó con éxito mediante la tinción TRAP (figura 1A). Las células grandes y púrpuras fueron consideradas como células trampa-positivas con múltiples núcleos (típica...

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Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Este método es significativo porque se puede utilizar para obtener grandes cantidades de osteoclastos totalmente diferenciados in vitro. La principal ventaja de este método es que es más estable y seguro y aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzos en comparación con el procedimiento tradicional. Esta técnica puede proporcionar una fuente estable de osteoclastos, que son el objeto importante de la enfermedad metabólica ósea, incluyendo osteoporosis, parodontitis, y osteolisis periprotésica.Con modificaciones menores, este protocolo también puede ser apropiado para obtener varios tipos de médula ósea derivadas de las células en ratas u otros animales. Para empezar, coloque animales eutanizados en una tabla desinfectada en una posición supina. Usando tijeras estériles, haga una incisión de aproximadamente un centímetro de longitud en el fémur proximal para pelar la piel.A continuación, disecciona los fémures y tibias. Con cuidado y suavemente, corte las partes de conexión bilaterales alrededor de las articulaciones de la cadera, la rodilla y el tobillo para aislar las tibias y los fémures. Corta parte de los tejidos alrededor del hueso, asegurándote de ser minucioso.A continuación, coloque los huesos limpios en un plato con cinco mililitros de medio de cultivo completo. Use tijeras estériles para cortar el hueso largo. Utilice una aguja de jeringa de un mililitro para lavar cuidadosamente la cavidad de la médula con 10 mililitros de medios completos hasta que la cavidad de la médula se vuelva blanca.Transfiera esta suspensión celular a un tubo de 50 mililitros y filtre con un colador de 70 micrómetros para eliminar el tejido restante. Agregue cinco mililitros de tampón de lelisis de sangre roja e incubar las células sobre hielo durante ocho minutos. Después de esto, centrifugar las células a 250 veces G durante cinco minutos para producir el pellet celular.Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de medios completos. Utilice un hemocitociómetro para contar las celdas y calcule el tiempo dedicado a las acciones realizadas para este método. En primer lugar, coloque a los animales eutanizados en una tabla desinfectada en una posición supina.Usando tijeras estériles, haga una incisión de aproximadamente un centímetro de longitud en el fémur proximal para pelar la piel. A continuación, disecciona los fémures y tibias. Cortar las partes de los tejidos alrededor del hueso, aunque no hay necesidad de extraer el tejido por completo.Enjuague las tibias y los fémures con 12 mililitros de PBS, y luego córtelos por la mitad. Coloque las tibias y fémures cortados en una punta de pipeta preparada de un mililitro, y colóquela en un tubo de micro centrífuga preparado. Centrifugar el tubo tres veces a 1.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 45 segundos.Después de esto, retire la punta de la pipeta que contiene el hueso del tubo, dejando la médula ósea en el tubo. Añadir 200 microlitros de PBS al tubo, y pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente para desintegrar la médula a fondo. Transfiera esta suspensión celular a un tubo de 50 mililitros y filtre con un colador de 70 micrómetros para eliminar los tejidos restantes.A continuación, utilice un hemocitociómetro para contar las celdas y calcule el tiempo dedicado a los pasos dados en esta sección. Añadir seis mililitros de solución de separación celular a un tubo centrífugo silicificado estéril. Agregue la suspensión celular diluida al tubo.Después de agregar la suspensión, aparecerá un límite claro entre la capa de celdas y la solución de separación. A continuación, adhera una punta de pipeta a la superficie interior del tubo en un ángulo de 45 grados. Centrifugar la solución en capas en una centrífuga horizontal a 500 veces G durante 30 minutos.Después de esto, aspirar la segunda capa turbia que contiene las celdas de destino de arriba a abajo. Transfiera las células de destino a un tubo nuevo. Agregue cinco mililitros de PBS para lavar las células, y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos.Repita este proceso de lavado añadiendo PBS y centrifugando para un total de tres lavados. Resuspender el gránulo celular con medio de inducción de médula ósea. Usa un hemocitoómetro para contar las células.Luego, agregue de cinco a ocho mililitros de medio de inducción de médula ósea para obtener una solución final de células de 300.000 células por mililitro. Agregue un mililitro de esta solución celular a cada pozo de una placa de 24 pozos. Después de incubar las células a 37 grados celsius durante 24 horas, aspira suavemente el medio y añade un mililitro de medio de inducción osteoclasal a cada pozo.Agitar suavemente la placa y devolverla a la incubadora. Cada 48 horas, retirar y reemplazar 0,8 mililitros de medio de inducción osteoclasto de cada pozo. Agitar suavemente la placa antes de devolverla a la incubadora.Para comenzar a pretratar las rodajas óseas, utilice una sierra microeléctrica para cortar la corteza ósea femoral bovina fresca en rodajas de dos centímetros de espesor a lo largo del eje longitudinal. Después de cortar y moler las rodajas, lave las rodajas sumergiéndolas en un vaso de agua desionizada y sometiéndolas a ultrasonido a 100 hercios durante una hora. Repita este proceso de lavado tres veces.Sumerja las rodajas lavadas en 75% de alcohol durante dos horas. Luego, aspirar el alcohol y exponer cada diapositiva de rodajas a la luz ultravioleta durante una hora en una plataforma limpia. Para comenzar la tinción azul de toluidina, coloque las rodajas óseas pretratados en los pozos de la placa de 24 pozos.Después de esto, agregue el medio de cultivo en la placa de 24 pozos para sumergir las rodajas óseas durante dos horas. Plantar e inducir las células como se demostró anteriormente. Después de que los osteoclastos hayan aparecido a los cuatro a seis días, lave las rodajas con un mililitro de hidróxido de amonio molar.Sonicar las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una para eliminar las células vivas y para permitir el análisis de los pozos de resorción en las rodajas óseas. A continuación, retire el hidróxido de amonio y manche las rodajas con un mililitro de 1% de solución azul de toluidina por rodaja durante dos minutos. Lave las rodajas de manchas con PBS.Seleccione aleatoriamente cinco vistas y utilice un software de análisis de imágenes para realizar un análisis semicuantitativo del área de resorción. En primer lugar, prefije las rodajas óseas con un mililitro de 2,5% de glutaraldehído por rebanada durante dos horas a temperatura ambiente. Sonicar las rodajas prefijadas tres veces durante tres minutos cada una con un hidróxido de amonio molar para eliminar las células.A continuación, retire el hidróxido de amonio y lave las rodajas óseas tres veces con PBS, con cada lavado que dure 12 minutos. Fije las rodajas óseas lavadas con 1%ácido osmico durante dos horas a temperatura ambiente. Realice la deshidratación de degradado de etanol como se describe en el protocolo de texto.Después de esto, reemplace el etanol con acetato de isoamilo durante 15 minutos. Recubrir las rodajas con paladio dorado y analizarlas mediante microscopía electrónica de barrido. En este estudio, un gran número de precursores osteoclastos fueron aislados, purificados y con éxito inducidos a convertirse en osteoclastos.Al complementar con M-CSF y RANKL, los osteoclastos gigantes se ven en los días cinco a seis. La formación de estos osteoclastos se identifica con éxito mediante la tinción de trampas. Las células grandes y púrpuras se consideran células positivas TRAP con múltiples núcleos.A través de este método, es típico obtener 800 osteoclastos que contienen hasta 30 núcleos por osteoclasto en un plato de 24 pozos. En comparación con el método tradicional, este método mejorado ahorra aproximadamente 20 minutos durante todo el proceso de aislamiento. El uso de rodajas óseas para evaluar la actividad de la resorción ósea es un método in vitro típico.A través de la tinción azul toluidina, el área de resorción se visualiza como verde claro. La estructura y las características de los pozos óseos se pueden observar claramente mediante microscopía electrónica de barrido. CTR, uno de los marcadores celulares específicos de osteoclastos, es fundamental para identificar osteoclastos y estudiar la formación de osteoclastos en el hueso.La expresión positiva de CTR identifica claramente los osteoclastos y los distingue de los poliárarios macrófagos. El CTR está claramente indicado en los ensayos de inmunofluorescencia por un color verde, mientras que el azul indica los núcleos celulares. Asegúrese de no fracturar los fémures y las tibias para evitar la pérdida de médula ósea.Un individuo que nunca ha realizado esta técnica antes puede tener problemas al ayudar a la solución de operación de las células. La punta de la pipeta debe adherirse a la superficie interior del tubo y mantenerse en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie interior.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

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Investigación

Biología

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