Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81473692) till Yong ma. Författarna tackar alla anställda vid Medical Research Center i den första hög skolan för klinisk medicin i Nanjing University of Chinese Medicine.

Alla metoder som omfattar de djur som beskrivs här är godkända av den institutionella djur omsorg och användning kommittén (IACUC) av Nanjing University of Chinese Medicine.
1. inställning av
<ol><li>Förbered flera longitudinellt skurna 1 mL pipettspetsar (1 cm) och flera 1,5 mL mikrocentrifugrör. Sätt pipettspetsarna och mikrocentrifugrör vid 103 kPa och 121 ° c i 20 minuter och se till att de är sterila.</li>
	<li>Förbered en låda med is och flera sterila rätter för att bev...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

Förmågan att få och studera Osteoklasterna in vitro-är en kritisk och grundläggande färdighet för alla forskare som vill studera benmetabolism, som kan bidra till att förstå mekanismerna för benabsorberande sjukdomar och utveckla nya terapeutiska medel. I den här studien beskrevs ett protokoll med vissa modifieringar baserade på tidigare metoder.
Genom att använda pipettspetsar och mikrocentrifugrör för att få benmärg minskade det till stor del Operations tiden för att få be...

Ben homeostas är en komplex fysiologisk process som regleras av benresorbering Osteoklasterna och benbildande osteoblaster1. En balans mellan osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet medierad genom osteoblaster och osteoklaster, respektive, är mycket viktigt för att upprätthålla benhälsa och homeostas, eftersom störningar i ben homeostas kan leda till skelett sjukdomar, såsom onormal ben tillväxt eller förlust av ben täthet. Som unika ben-resorption celler, Osteoklasterna är viktiga vid sjukdomar relaterade till onormal ben förstörelse, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys2,3.
Utvecklingen av en osteoklast kultur är huvudsakligen uppdelad i två steg. De metoder som fastställdes av Boyde et al.4 och Chambers et al.5 bestod av den första etappen på 1980-talet. De erhöll relativt riklig Osteoklasterna från benen på nyfödda djur, vilket är den snabba remodeling period. Osteoclasts frigörs genom att fragmentera och omrörning benen i ett speciellt medium. De celler som erhålls med denna metod är dock låga i kvantitet och renhet. Den andra etappen var utvecklingen av långväga kulturer av osteoklast bildning, med hjälp av hematopoetiska härstamning celler som härrör från benmärg6. Cytokiner, såsom 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), och parathormon (pth), som tillsätts i odlings mediet, verkar genom systemet med osteoblaster/stromaceller för att stimulera osteoklastbildningen7,8 . Den renhet och mängd osteoklaster som erhålls genom denna metod kan dock inte tillgodose behoven hos modern molekylär biologisk forskning. Sedan, upptäckten av makrofag Colony-stimulerande faktor (M-CSF) och receptor Activator för nukleär faktor-κb ligand (Rankl) gör osteoclastogenesis lättare9,10,11, och metoden för att använda M-CSF och RANKL att direkt stimulera osteoklast formation används i stor utsträckning runt om i världen. Det finns dock fortfarande vissa detaljer i den metod som behöver förbättras.
För närvarande, den vanligaste osteoklast kulturen metod, som beskrivs av Marino et al.12 och Pei et al.13, ofta kräver avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet och använder en steriliserad nål för att spola benmärg hålighet med färdigställda medier. Det finns vissa nack delar med denna process, inklusive det faktum att (1) avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet kräver mycket tid och stor kirurgisk teknik, (2) benen är sköra och kan leda till benmärg utflöde, (3) benmärg hålighet kan vara för liten för att spola, och (4) det finns en risk för nålstick skada. För att undvika dessa problem, vi Centrifugera rören som innehåller benen för benmärg i stället för nål-spolning benmärgen. Här introducerar vi en stabil och säker metod som isolerar benmärgen på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet. Tillsammans med användning av densitetsgradient centrifugering, vi erhåller stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna in vitro-.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteoclasts är stora, multinukleerade, och benresorbering celler av monocyt-makrofaghärstamning som bildas av fusion av monocyter eller makrofagprekursorer. Överdriven benresorption är en av de mest signifikanta cellulära mekanismer som leder till osteolytiska sjukdomar, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys. Den huvudsakliga fysiologiska funktionen av Osteoklasterna är att absorbera både hydroxyapatit mineral komponenten och den organiska matrisen av ben, generera den karakteristiska benresorption utseende på ytan av ben. Det finns relativt få Osteoklasterna jämfört med andra celler i kroppen, särskilt i vuxna ben. Nyligen genomförda studier har fokuserat på hur man kan få mer mogna Osteoklasterna på kortare tid, vilket alltid har varit ett problem. Flera förbättringar av isolerings-och odlings teknikerna har utvecklats i laboratorier för att få mer mogna osteoklaster. Här introducerar vi en metod som isolerar benmärg på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet, med hjälp av en speciell och enkel enhet. Med hjälp av densitetsgradient centrifugering, vi får stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna från råtta benmärg, som identifieras med klassiska metoder.

Syftet med protokollet var att isolera och rena ett stort antal osteoklast prekursorer bekvämt och inducera Osteoklasterna framgångs rikt. Genom att komplettera med M-CSF och RANKL sågs jätte osteoklaster på dag 5 – 6. Bildandet av Osteoklasterna identifierades med lyckat resultat av trap-färgning (figur 1a). Stora och lila celler betraktades som TRAP-positiva celler med flera kärnor (typiskt ≥ tre kärnor). Genom denna metod, det var typiskt att f...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolering, rening och differentiering av Osteoklast prekursorer från råtta benmärg

Osteoclasts är vävnadsspecifika makrofagpolykaryoner härledda från monocyt-makrofaghärstamning av hematopoetiska stamceller. Detta protokoll beskriver hur man isolerar benmärgs celler så att stora mängder osteoklaster erhålls samtidigt som risken för olyckor som påträffas i traditionella metoder minskas.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Denna metod är betydande eftersom det kan användas för att få stora mängder helt differentierade osteoklaster in vitro. Den största fördelen med denna metod är att den är stabilare och mer säker och isolerar benmärg på kortare tid och med mindre ansträngningar jämfört med det traditionella förfarandet. Denna teknik kan ge en stabil källa till osteoklaster, som är det viktiga objektet för ben metabolisk sjukdom, inklusive benskörhet, parodontitis, och periprosthetic osteolys.Med mindre ändringar kan detta protokoll också vara lämpligt för att erhålla olika sorters benmärg som härrör cellerna i råttor eller andra djur. Till att börja placera avlivade djur på en desinficerad bräda i ryggläge. Använd steril sax, gör ett snitt ungefär en centimeter i längd vid proximala lårbenet att skala huden.Därefter dissekera ut lårben och skenben. Försiktigt och försiktigt, skär de bilaterala anslutningsdelarna runt höften, knä, och fotled lederna att isolera skenben och lårben. Skär av en del av vävnaderna runt benet, se till att vara noggrann.Placera sedan de rengjorda benen i en skål med fem milliliter komplett odlingsmedium. Använd steril sax för att skära av det långa benet. Använd en milliliterspruta för att försiktigt spola märghålan med 10 milliliter komplett media tills märghålan blir vit.Överför denna cellupphängning till ett 50 milliliterrör och filtrera den med en 70 mikrometersil för att avlägsna den återstående vävnaden. Tillsätt fem milliliter röd blodlysbuffert och inkubera cellerna på is i åtta minuter. Efter detta centrifugera cellerna vid 250 gånger G i fem minuter för att ge cellpelletsen.Aspirera supernatanten och resuspend cellerna i 10 milliliter av färdiga massmedia. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna, och beräkna den tid som lagts ned på de åtgärder som vidtagits för den här metoden. Först, placera avlivade djur på en desinficerad bräda i ryggläge.Använd steril sax, gör ett snitt ungefär en centimeter i längd vid proximala lårbenet att skala huden. Därefter dissekera ut lårben och skenben. Skär av delarna av vävnaderna runt benet, men det finns ingen anledning att ta bort vävnaden helt.Skölj skenbenen och lårbenen med 12 milliliter PBS, och skär dem sedan i hälften. Placera snipped skenben och lårben i en beredd en milliliter pipett spets, och placera detta i en förberedd mikro centrifugrör. Centrifugera röret tre gånger vid 1, 000 gånger G och vid fyra grader Celsius i 45 sekunder.Efter detta, ta bort pipetten spets som innehåller benet från röret, lämnar benmärgen i röret. Tillsätt 200 mikroliter PBS till röret, och pipetten upp och ner upprepade gånger för att upplösa märgen ordentligt. Överför denna cell suspension till en 50 milliliter rör, och filtrera den med en 70 mikrometer sil för att ta bort eventuella kvarvarande vävnader.Sedan använder du en hemocytometer för att räkna cellerna, och beräkna den tid som lagts ned på de steg som tas i det här avsnittet. Tillsätt sex milliliter cellseparationslösning till ett sterilt silicifierat centrifugalrör. Tillsätt den utspädda cellupphängningen i röret.Efter att ha lagt till suspensionen kommer en tydlig gräns att visas mellan lagret av celler och separationslösningen. Därefter följ en pipett spets till den inre ytan av röret i en 45 graders vinkel. Centrifugera den skiktade lösningen i en horisontell centrifug vid 500 gånger G i 30 minuter.Efter detta aspirera det grumliga andra lagret som innehåller målcellerna uppifrån och ned. Överför målcellerna till ett nytt rör. Tillsätt fem milliliter PBS för att tvätta cellerna och centrifug vid 250 gånger G i fem minuter.Upprepa denna tvättprocess genom att lägga till PBS och centrifugering för totalt tre tvättar. Resuspend cell pelleten med benmärg induktion medium. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna.Tillsätt sedan fem till åtta milliliter benmärgsinduktionsmedium för att få en slutcellerslösning på 300, 000 celler per milliliter. Tillsätt en milliliter av denna celllösning till varje brunn av en 24 brunnsplatta. Efter inkubering av cellerna vid 37 grader Celsius i 24 timmar, försiktigt aspirera av mediet och tillsätt en milliliter osteoklast induktion medium till varje brunn.Agitera försiktigt plattan och returnera den till inkubatorn. Varje 48 timmar, ta bort och ersätta 0,8 milliliter osteoklast induktionsmedium från varje brunn. Agitera plattan försiktigt innan du returnerar den till inkubatorn.För att börja förbehandling av benskivor, använd en mikro elektrisk såg för att skära den färska nötkreatur femorala ben cortex i två centimeter tjocka skivor längs längsgående axeln. Efter styckning och slipning av skivor, tvätta skivorna genom att fördjupa dem i en bägare av avjoniserat vatten och utsätta dem för ultraljud på 100 hertz i en timme. Upprepa denna tvättprocess tre gånger.Sänk ner de tvättade skivorna i 75%alkohol i två timmar. Sedan aspirera bort alkoholen och exponera varje bild av skivor till ultraviolett ljus i en timme på en ren plattform. För att börja toluidin blå färgning, placera de förbehandlade benskivorna i brunnarna på 24 brunnsplattan.Efter detta, tillsätt odlingsmedium i 24 brunnsplattan för att sänka ner benskivorna i två timmar. Plantera och inducera cellerna som visat tidigare. Efter osteoklaster har dykt upp vid fyra till sex dagar, tvätta skivorna med en milliliter av 0,25 molar ammoniumhydroxid.Sonikera skivorna tre gånger i fem minuter vardera för att ta bort de levande cellerna och för att möjliggöra analys av resorption gropar på benskivor. Ta sedan bort ammoniumhydroxiden och fläcka skivorna med en milliliter på 1%toluidinblått lösning per skiva i två minuter. Tvätta fläckskivorna med PBS.Välj fem vyer slumpmässigt och använd en bildanalysprogramvara för att utföra en semikvantitativ analys av området resorption. Först prefix benskivorna med en milliliter på 2,5%glutaraldehyd per skiva i två timmar vid rumstemperatur. Sonikera de prefixed skivor tre gånger i tre minuter vardera med en molar ammoniumhydroxid för att ta bort cellerna.Ta sedan bort ammoniumhydroxid och tvätta benskivorna tre gånger med PBS, med varje tvätt som varar 12 minuter. Fixera de tvättade benskivorna med 1%osmic syra i två timmar i rumstemperatur. Utför etanolgradientuttorm som skisseras i textprotokollet.Efter detta, byt ut etanolen med isoamylacetat i 15 minuter. Coat skivorna med guld palladium och analysera dem genom att skanna elektronmikroskopi. I denna studie var ett stort antal osteoklast prekursorer isolerade, renas och framgångsrikt induceras att bli osteoklaster.Genom att komplettera med M-CSF och RANKL, jätte osteoklaster ses på dag fem till sex. Bildandet av dessa osteoklaster identifieras framgångsrikt genom fälla färgning. Stora och lila celler betraktas som TRAP positiva celler med flera kärnor.Genom denna metod är det typiskt att erhålla 800 osteoklaster som innehåller så många som 30 kärnor per osteoklast i en 24 brunnsplatta. Jämfört med den traditionella metoden sparar denna förbättrade metod cirka 20 minuter under hela isoleringsprocessen. Att använda benskivor för att bedöma aktiviteten hos benresorption är en typisk in vitro-metod.Genom toluidin blå färgning, är arbetskostnaden området visualiseras som ljusgrön. Bengropens struktur och egenskaper kan tydligt observeras genom svepelektronmikroskopi. CTR, en av osteoklasterna specifika cellmarkörer, är kritisk för att identifiera osteoklaster och studera bildandet av osteoklaster i ben.Det positiva uttrycket av CTR identifierar tydligt osteoklaster och skiljer dem från makrofagpolykaryoner. CTR anges tydligt i immunofluorescensanalyserna med en grön färg, medan den blå anger cellkärnorna. Se till att inte bryta lårbenen och skenbenen för att undvika att förlora benmärg.En individ som aldrig har utfört denna teknik tidigare får kämpa när medhjälp cellerna drift lösning. Pipettens spets måste följas till den inre ytan av röret och hållas i 45 graders vinkel mot den inre ytan.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing av hematopoetiska celler i benmärgen

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklast Härledning från benmärg från mus

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller från vuxna mus hjärtat

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Isolering och differentiering av primära vita och bruna preadipocyter från nyfödda möss

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...