Name: isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81473692) tarafından Yong ma için desteklenmektedir. Yazarlar Çin tıp Nanjing Üniversitesi Klinik Tıp Ilk Koleji Tıp Araştırma Merkezi tüm personel teşekkür ederiz.

Burada tarif edilen hayvanları içeren tüm yöntemler, Nanjing Çin Tıp Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc) tarafından onaylanmıştır.
1. Kurulum
<ol><li>Birkaç boyuna kesilmiş 1 mL pipet uçları (1 cm) ve birkaç 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpleri hazırlayın. Pipet uçları ve mikrosantrifüjlerin tüplerini 103 kPa ve 121 °C ' de 20 dakika boyunca koyun ve steril olduklarından emin olun.</li>
	<li>Yalıtım prosedürü sırasında izole do...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level.">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption.">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li><li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro.">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li><li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts.">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures.">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li><li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene.">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+osteoclasts.">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).</li><li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression.">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li><li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro.">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li><li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption.">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li><li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+osteoclast+cultures.">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li><li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts.">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li></ol>

Kemik emici hastalıkların mekanizmalarını anlamanıza ve yeni terapötik ajanlar geliştirmesine yardımcı olabilecek kemik metabolizmasını incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için osteocsürer in vitro elde etme ve çalışma becerisi, önemli ve temel bir beceridir. Bu çalışmada, önceki yöntemlere dayalı bazı değişikliklerle ilgili bir protokol tanımlanmıştır.
Kemik iliği elde etmek için pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, büyük ölçüde...

Kemik homeostazisi, kemik-reorbing osteoksürer ve kemik oluşturan osteoblastlar1ile düzenlenmiş karmaşık bir fizyolojik süreçtir. Osteoblastlar ve osteocsürer ile aracılı osteoblastik ve osteoklastik aktivite arasında bir denge, sırasıyla, kemik sağlığı ve homeostaz korumak için son derece önemlidir, çünkü kemik homeostazı perturbations kemik hastalıklarına yol açabilir, böyle anormal kemik büyümesi veya kemik yoğunluğu kaybı olarak. Benzersiz kemik-reorpsiyon hücreleri olarak, osteocsürer anormal kemik imha ile ilgili hastalıklarda önemlidir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz2,3.
Osteoklast kültürünün gelişimi ağırlıklı olarak iki aşamaya ayrılır. Boyde et al.4 ve Chambers ve al.5 tarafından kurulan Yöntemler 1980 ' lerde ilk aşamadan oluşuyor. Hızlı remodeling dönemi olan yenidoğan hayvanların kemiklerinden nispeten bol miktarda osteocsürer elde ettiler. Osteocsürer, özel bir ortamda kemikleri birleştirerek ve karıştırarak serbest bırakılır. Ancak, bu yöntem tarafından elde edilen hücreler miktarı ve saflık düşüktür. İkinci aşama, kemik iliği6' dan elde edilen hematopoetik soy hücrelerini kullanarak, osteoklast oluşumunun uzun menzilli kültürlerinin gelişmedir. Sitokinler, 1α gibi, 25-dihidroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), ve Paratiroid hormonu (PTH), hangi kültür ortamına eklenir, osteoblastlar sistemi aracılığıyla hareket/stromal hücreler osteoklast oluşumu uyarmak için7,8 . Ancak, bu yöntemle elde edilen osteocsürer saflık ve miktarı modern moleküler biyoloji araştırmalarının ihtiyaçlarını karşılamaz. Sonra, makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) ve reseptör aktivatörü nükleer Factor-κB ligand (rankl) keşfi daha kolay osteoclastogenesis yapmak9,10,11, ve M-CSF ve kullanma yöntemi RANKL doğrudan osteoklast oluşumu uyarmak için yaygın olarak dünya çapında kullanılır. Ancak, hala iyileştirilmesi gereken metodoloji bazı detaylar vardır.
Şu anda, en sık kullanılan osteoklast kültür yöntemi, Marino ve al.12 ve Pei et al.13tarafından açıklandığı gibi, genellikle kemik çevresindeki çevreleyen doku kaldırılması gerektirir ve ile iliği boşluğu temizlemek için sterilize iğne kullanır tamamlanmış medya. Bu süreçte bazı dezavantajları vardır, (1) kemik etrafında çevreleyen doku kaldırılması çok zaman ve büyük cerrahi tekniği gerektirir, (2) kemikler kırılgan ve kemik iliği çıkışı yol açabilir, (3) kemik iliği boşluğu olabilir floş için çok küçük ve (4) iğne sopa yaralanma riski vardır. Bu sorunlardan kaçınmak için, kemik iliği yerine kemik iliğinin kemikleri içeren tüpleri santrifüjler. Burada, daha az zamanda ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile kemik iliği yalıtır istikrarlı ve güvenli bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile birlikte, tam farklılaşmış osteocsürer in vitro büyük miktarlarda elde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hard Tissue Slicer</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine femoral bone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchased by ourselves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Heraus</td>
			<td>BB16/BB5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sarana</td>
			<td>s-fbs-au-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard Tissue Grinders</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SP-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque Kit</td>
			<td>TianJing Haoyang</td>
			<td>TBD2013DR</td>
			<td>Silicified centrifugal tube amd cell separation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>DMI-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, no Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Calcitonin receptor</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0124R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat sRANK Ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs47014932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Quanta 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89649</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow

Osteositler, monosit veya makrophaj öncülerinin birleşerek oluşturduğu monoksit-makrophaj sırının büyük, multinükleated ve kemik-resorbing hücrelerdir. Aşırı kemik reorpsiyonu osteolitik hastalıklara yol açan en önemli hücresel mekanizmalardan biridir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz. Osteocsürer ana fizyolojik fonksiyon hem hidroksiatit mineral bileşeni ve kemik organik matris absorbe, kemik yüzeyinde karakteristik reorpsiyon görünümünü üreten. Vücudun diğer hücrelerine kıyasla nispeten az osteocsürer, özellikle yetişkin kemiklerde. Son çalışmalar her zaman bir sorun olmuştur daha az zaman, daha olgun osteocsürer elde etmek için nasıl odaklanmıştır. İzolasyon ve kültür tekniklerinde çeşitli iyileştirmeler daha olgun osteocsürer elde etmek için laboratuvarlarda geliştirdik. Burada, özel ve basit bir cihaz kullanarak, daha az zaman içinde kemik iliği yalıtır ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile, biz klasik yöntemlerle tanımlanır sıçan kemik iliği, tam farklılaşmış osteocsürer büyük miktarda elde.

Protokolün amacı, çok sayıda osteoklast öncülerini rahat bir şekilde izole etmek ve arındırmak ve osteocsürer 'i başarılı bir şekilde teşvik etmektir. M-CSF ve RANKL ile tamamlayıcı olarak, dev osteocsürer gün 5 – 6 görüldü. Osteoksürer oluşumu, TRAP boyama ile başarıyla tespit edilmiştir (Şekil 1a). Büyük ve mor hücreler birden fazla çekirdeklerle TRAP-pozitif hücreler olarak kabul edildi (genellikle ≥ üç çekirdekler)....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow at JoVE.com

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Bu yöntem, tam diferansiye osteoklastlar in vitro büyük miktarlarda elde etmek için kullanılabilir, çünkü önemlidir. Bu yöntemin en büyük avantajı, daha kararlı ve güvenli olması ve kemik iliği izole daha kısa sürede ve daha az çaba ile geleneksel işlem göre. Bu teknik osteoporoz, parodontit ve periprotez osteoliz gibi kemik metabolik hastalığın önemli nesnesi olan osteoklastlar, istikrarlı bir kaynak sağlayabilir.Küçük değişiklikler ile, bu protokol aynı zamanda kemik iliği sıçan veya diğer hayvanlarda hücreleri elde çeşitli elde etmek için uygun olabilir. Başlamak için, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanları yerleştirin. Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak.Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Dikkatle ve nazikçe, tibias ve femurlar izole etmek için kalça, diz ve ayak bileği eklemleri etrafında ikili bağlantı parçaları kesti. Kemik çevresindeki dokuların bir kısmını kesin olarak kesin.Sonra, tam kültür orta beş mililitre ile bir çanak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin. Uzun kemiği kesmek için steril makas kullanın. Ilik boşluğu beyaza dönene kadar 10 mililitre lik tam ortamla ilik boşluğunu dikkatlice yıkamak için bir mililitrelik şırınga iğnesi kullanın.Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuyu çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin. Beş mililitre kırmızı kan lisis tamponu ekleyin ve hücreleri sekiz dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücre pelet verimi için beş dakika boyunca 250 kez G hücreleri santrifüj.Supernatant aspire ve tam medya 10 mililitre hücreleri resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu yöntem için yapılan eylemler için harcanan zamanı hesaplayın. İlk olarak, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanlar yerleştirin.Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak. Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Tamamen doku kaldırmak için gerek olmamasına rağmen, kemik çevresindeki dokuların parçaları kesin.Tibias ve uyluk kemiğini 12 mililitre PBS ile durulayın ve sonra ikiye bölün. Hazırlanan bir mililitre pipet ucu içine snipped tibias ve femurlar yerleştirin ve hazırlanmış bir mikro santrifüj tüp içine yerleştirin. Tüpü 1,000 kez G'de üç kez ve 45 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Bundan sonra, kemik içeren pipet ucunu tüpten çıkarın ve kemik iliğini tüpte bırakın. Tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve iliği iyice parçalamak için tekrar tekrar yukarı pipet ekleyin. Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuları çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin.Ardından, hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu bölümde atılan adımlarda harcanan zamanı hesaplayın. Steril silikize santrifüj tüpüne altı mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüpe seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.Süspansiyon ekledikten sonra, hücre tabakası ve ayırma çözümü arasında net bir sınır görünür. Daha sonra, 45 derecelik bir açıyla tüpün iç yüzeyine bir pipet ucu yapıştırın. Katmanlı çözeltiyi yatay bir santrifüjde 500 kez G'de 30 dakika santrifüj edin.Bundan sonra, yukarıdan aşağıya hedef hücreleri içeren bulutlu ikinci tabaka aspire. Hedef hücreleri yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri yıkamak için beş mililitre PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj.Toplam üç yıkama için PBS ve santrifüj ekleyerek bu yıkama işlemini tekrarlayın. Kemik iliği indüksiyon orta ile hücre pelet resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Daha sonra, mililitre başına 300, 000 hücrelik nihai bir hücre çözümü elde etmek için kemik iliği indüksiyon ortamı beş ila sekiz mililitre ekleyin. 24 kuyu plakaher kuyuya bu hücre çözeltisi bir mililitre ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, hafifçe orta kapalı aspire ve her kuyuya osteoklast indüksiyon ortamı bir mililitre ekleyin.Yavaşça plakayı çalkalayın ve kuvöze geri dönün. Her 48 saatte bir, her kuyudan 0.8 mililitre osteoklast indüksiyon ortamını çıkarın ve değiştirin. Kuvöze geri vermeden önce tabağı hafifçe çalkalayın.Kemik dilimleri nin ön tedavisine başlamak için, taze büyükbaş femoral kemik korteksini uzunlamasına eksen boyunca iki santimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için mikro elektrikli testere kullanın. Dilimleri kesip öğüttükten sonra, dilimleri deiyonize su kabına batırarak ve 100 hertz'de bir saat ultrasona tabi tutarak yıkayın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Yıkanmış dilimleri iki saat boyunca %75 alkole batırın. Daha sonra, alkol kapalı aspire ve temiz bir platformda bir saat boyunca ultraviyole ışığa dilim her slayt maruz. Toluidin mavi boyama başlamak için, 24 kuyu plaka kuyuları içine önceden işlenmiş kemik dilimleri yerleştirin.Bundan sonra, iki saat boyunca kemik dilimleri batırmak için 24 iyi plaka içine kültür ortamı ekleyin. Bitki ve daha önce gösterildiği gibi hücreleri indüklemek. Osteoklastlar dört ila altı gün çıktıktan sonra, 0.25 molar amonyum hidroksit bir mililitre ile dilimleri yıkayın.Yaşayan hücreleri çıkarmak ve kemik dilimleri üzerindeki rezorpsiyon çukurlarının analizine izin vermek için dilimleri beş dakika boyunca üç kez sonicate. Daha sonra, amonyum hidroksit çıkarın ve iki dakika boyunca dilim başına% 1 toluidin mavi çözeltibir mililitre ile dilimleke. Leke dilimlerini PBS ile yıkayın.Rasgele beş görünüm seçin ve rezorpsiyon alanının yarı nicel analizini gerçekleştirmek için bir görüntü analizi yazılımı kullanın. İlk olarak, oda sıcaklığında iki saat boyunca dilim başına%2.5 glutaraldehit bir mililitre ile kemik dilimleri önek. Hücreleri kaldırmak için bir molar amonyum hidroksit ile üç dakika boyunca üç kez önceden sabitlenmiş dilimleri sonicate.Daha sonra amonyum hidroksiti çıkarın ve kemik dilimlerini PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkama 12 dakika sürsin. Yıkanmış kemik dilimlerini oda sıcaklığında iki saat boyunca %1 osmik asitle sabitleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi etanol gradyan dehidratasyon gerçekleştirin.Bundan sonra, 15 dakika boyunca isoamyl asetat ile etanol değiştirin. Altın paladyum ile dilimkat ve elektron mikroskobu tarama ile analiz. Bu çalışmada, osteoklast öncüleri çok sayıda izole edildi, saflaştırılmış ve başarılı osteoklastlar olmak için indüklenen.M-CSF ve RANKL ile takviye ederek, dev osteoklastlar gün beş ila altı görülür. Bu osteoklastların oluşumu tuzak boyama ile başarıyla tanımlanır. Büyük ve mor hücreler birden fazla çekirdekli TRAP pozitif hücreler olarak kabul edilir.Bu yöntem sayesinde, 24 iyi plaka osteoklast başına 30 çekirdek kadar içeren 800 osteoklast elde etmek için tipiktir. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş yöntem tüm yalıtım işlemi sırasında yaklaşık 20 dakika tasarruf sağlar. Kemik rezorpsiyon aktivitesini değerlendirmek için kemik dilimleri kullanarak tipik bir in vitro yöntemdir.Toluidin mavi boyama sayesinde, rezorpsiyon alanı açık yeşil olarak görselleştirilmiş. Kemik çukurlarının yapısı ve özellikleri elektron mikroskobu taranarak açıkça görülebilir. TO, osteoklastlar belirli hücre belirteçleri biri, osteoklastlar tanımlamak ve kemik osteoklastoluşumunu incelemek için önemlidir.TO'nun pozitif ekspresyonu osteoklastları açıkça tanımlar ve makrofaj polikaryonlardan ayırır. TO, immünoforesans tahlillerinde yeşil renkle açıkça gösterilirken, mavi hücre çekirdeğini gösterir. Kemik iliği kaybetmemek için uyluk kemiği ve tibias kırık değil emin olun.Bu tekniği daha önce hiç yapmamış bir birey, hücre operasyon çözümüne yardımcı olurken mücadele edebilir. Pipet ucu tüpün iç yüzeyine yapıştırılmalı ve iç yüzeye 45 derecelik açıyla tutulmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...