Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

يعترف الكتاب BBSRC (BB/P005454/1) للدعم المالي. NH مولت "البرنامج محقق الشباب مؤسسة فيلوم".

1-إعداد مزيج دهني/UQ-10/فضل
ملاحظة: يجب أن تكون هاء القولونية الدهون المستخدمة لإعداد الدهنية الكوتيد ودقة مختلطة مع أوبيكوينوني-10 (إنزيم الركازة) والطول الموجي الطويل الفلورسنت المسمى صبغ الدهون (لتحديد حجم الدهنية) قبل إعادة تشكيل.
<ol><li>استخدام المحاقن زجاجية، است...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

الطريقة الموصوفة هي مناسبة لدراسة بروتون ضخ بروتينات الغشاء الرئوي التي يمكن أن يعاد تشكيلها في الدهنية وقادرون على تبادل الإلكترونات مع تجمع كينون. يمكن رصد بروتون ضخ النشاط على مستوى إنزيم واحد استخدام الأصباغ حساسة لدرجة الحموضة (راتيوميتريك) مغلفة في التجويف الحويصلية (ال...

يتم عادة الحصول على معلومات حول آليات الإنزيم وحركية على مستوى الفرقة أو ماكروسكالي مع السكان الإنزيم بالآلاف إلى ملايين جزيئات، التي تمثل فيها القياسات متوسط الإحصائي. ومن المعروف، بيد أن الجزيئات المعقدة مثل الإنزيمات قد تثبت عدم التجانس في سلوكهم والآليات الجزيئية التي لوحظ على مستوى فرقة ليست بالضرورة صالحة لكل جزيء. قد تأكدت هذه الانحرافات بمقياس جزيء الفردية على نطاق واسع بدراسات للإنزيمات واحد مع مجموعة متنوعة من أساليب الناشئة خلال العقدين الماضيين الماضي1. جدير بالذكر أن الأسفار الكشف عن نشاط إنزيم الفردية قد استخدمت للتحقيق في عدم تجانس الإنزيمات النشاط2،3 أو اكتشاف تأثير ما يسمى الذاكرة (فترات من نشاط الإنزيمات عالية نجح خلال فترات انخفاض النشاط و العكس)4،5.
تتطلب العديد من الدراسات إنزيم واحد أن الإنزيمات هي معطلة على السطح أو ثابت مكانياً في طريقة أخرى للبقاء طويلاً بما فيه الكفاية في مجال الرؤية للمراقبة المستمرة. لقد ثبت تغليف الإنزيم في الدهنية لتمكين التثبيت الإنزيم مع منع أي تأثير سلبي الواجب السطح-إنزيم أو بروتين-بروتين تفاعلات6،7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم الدهنية إمكانية فريدة لدراسة البروتينات غشاء مفرد في بهم الدهن الطبيعية البيئة bilayer8،،من910.
فئة من بروتينات الغشاء، الناقلين، يمارس إزفاء اتجاهي للمواد عبر غشاء الخلية، سلوك الذي يمكن دراستها إلا عندما يتم تشكيل البروتينات في دهن بليرس (مثلاً، الدهنية)11، ،من 1213. على سبيل المثال، إزفاء بروتون، تعرض بواسطة إنزيمات عدة سلاسل النقل الإلكترون بدائية وحقيقية النواة، دوراً هاما في التنفس الخلوي إنشاء قوة الدافع البروتون المستخدمة لتركيب ATP. وفي هذه الحالة، يقترن البروتون ضخ نشاط لنقل الإلكترون، على الرغم من أن إليه مفصلة لهذه العملية غالباً ما زال بعيد المنال.
في الآونة الأخيرة، أثبتنا إمكانية الكشف الفلورسنت زوجين مع كهربية لدراسة بروتون ضخ نشاط الإنزيمات واحد من أوكسيديز أوبيكوينول المحطة الطرفية من الإشريكيّة القولونية (الفسفرة بو3) أعيد تشكيلها في الدهنية14. وقد تحقق ذلك بتغليف صبغة الفلورسنت غشاء كتيمة حساسة لدرجة الحموضة في التجويف الدهنية أعدت من هاء القولونية القطبية الدهون (الشكل 1A). وكان الأمثل كمية البروتين حيث أن معظم الدهنية الواردة أما جزيء الإنزيم المعاد تشكيلها لا أو واحد فقط (حسب توزيع Poisson). وقدمت ركائز اثنين من الفسفرة بو3 بإضافة أوبيكوينوني إلى المزيج المادة الدهنية التي تشكلت في الدهنية والأكسجين (المحيط) في حل. ثم هي تمتز الدهنية قليلة على مسرى الذهب فائقة على نحو سلس شبه شفافة، مغطاة تجميعها ذاتيا أحادي الطبقة من 6-ميركابتوهيكسانول. وأخيراً، شنت مسرى على الجزء السفلي من الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال بسيطة (الشكل 1B). يسمح التحكم الكهروكيميائية الدولة الأكسدة تجمع كينون أحد مرونة تحريك أو إيقاف التفاعل الأنزيمي في أي لحظة، بينما يستخدم لرصد تغيرات درجة الحموضة داخل التجويف الدهنية نتيجة إزفاء بروتون بصبغة حساسة لدرجة الحموضة الإنزيمات. قبل استخدام يمكن تحديد كثافة fluorescence صبغة الفلورسنت وثانيا، ربط دهني، حجم وحجم الدهنية الفردية وبالتالي التحديد الكمي للبروتون الإنزيم ضخ النشاط. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا لا سيما أن الفسفرة بو3 جزيئات قادرون على الدخول في حالة تسرب عفوية سرعة تبدد القوة الدافعة بروتون. والهدف من هذه المادة إدخال تقنية القياسات الحويصلية واحد بالتفصيل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

ضخ البروتون الإنزيمات من إلكترون نقل سلاسل تفاعلات الأكسدة والاختزال الزوجان إلى إزفاء بروتون عبر الغشاء، إنشاء قوة الدافع البروتون المستخدمة لإنتاج ATP. الطابع amphiphilic للبروتينات الغشاء يتطلب إيلاء اهتمام خاص للمعالجة وإعادة تشكيل في البيئة الطبيعية في الدهون أمر لا غنى عنه عند دراسة عمليات النقل الغشاء مثل إزفاء بروتون. هنا، نحن بالتفصيل أسلوب الذي تم استخدامه لتحقيق إليه ضخ البروتون غشاء إنزيمات الأكسدة والاختزال، أخذ الفسفرة بو3 من الإشريكيّة القولونية كمثال. هو استخدام مزيج من الفحص المجهري كهربية والأسفار للتحكم في حالة الأكسدة كينون تجمع ورصد التغيرات درجة الحموضة في التجويف. مئات الدهنية بسبب القرار المكانية للفحص المجهري نيون، يمكن أن يقاس في وقت واحد بينما يمكن تقليص محتوى إنزيم إنزيم واحد أو الناقل الواحد الحويصلية. تحليل إنزيم واحد منها يمكن أن تكشف عن أنماط في ديناميات إنزيم الوظيفية التي قد تكون مخفية وإلا بسلوك السكان ككل. نقوم بتضمين وصف نصي لتحليل الصورة الآلي.

يتم التحقق من نوعية بكشف غطاء الذهب تعديل (مسرى) مع سام 6MH قبل كل تجربة مع التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية. ويبين الشكل 2 ألف الممثل كول-كول المؤامرات يتم قياسها باستخدام التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية قبل وبعد هي تمتز الدهنية. إذا كانت نوع?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لدراسة الآلية الجزيئية لبروتون إزفاء عبر الأغشية الدهنية الدهنية واحد، استخدام الفسفرة بو3 كمثال. يمكن الكشف عن الجمع بين كهربية والفحص المجهري الأسفار، تغييرات درجة الحموضة في التجويف حويصلات وحيد، والتي تحتوي على واحد أو إنزيم متعددة، وتحليلها على حدة.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

هذه الطريقة تسمح لدراسة نشاط نقل البروتون من إنزيمات غشاء الجهاز التنفسي مثل السيتوكروم BO3 في بيئة الدهون الطبيعية ثنائية الطبقة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية انزيم واحد هو إمكانية بدء ووقف ردود الفعل الأنزيمية في أي لحظة باستخدام الكيمياء الكهربائية. باستخدام نقل حقنة الزجاج 200 ميكرولترات من مخزون الكلوروفورم من استخراج القطبية الدهون من القولونية Escherichia في قوارير الزجاج لجعل 5 aliquots مليغرام.إضافة 50 ميكرولترات من مليغرام واحد لكل المليلتر أوبيكينون 10 إلى الدهون لجعل النسبة النهائية من واحد إلى 100 أوبيكينون 10 إلى الدهون. إلى الخليط إضافة 20 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر طول موجة طويلة صبغة الفلورسنت المسمى الدهون المختصرة FDLL. التجانس حل الكلوروفورم عن طريق دوامة قصيرة وتتبخر معظم الكلوروفورم تحت تدفق النيتروجين أو الأرجون لطيف.إزالة آثار الكلوروفورم تماما عن طريق مزيد من التبخر تحت فراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل. إضافة 312.5 ميكرولترات من 40 ملليمولار موبمس 7.4 العازلة إلى aliquot واحد من الدهون أوبيكينون 10 المزيج الجاف FDLL. مزيج دوامة سمسم يتم تماما إعادة تعليق الفيلم الدهون تليها دقيقتين من العلاج في حمام بالموجات فوق الصوتية.أضف التالي 125 ميكرولترات من 25 ملليمولار HPTS، صبغة فلورية حساسة من نوع PH سيتم تغليفها داخل الليبوسومات. الآن إضافة 137.5 ميكرولترات من 250 ميليمولار OGP السطحي. بعد خلط باستخدام دوامة، سونيكات الخليط في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لضمان أن تكون سولوبيليد جميع الدهون في micelles السطحي.ثم نقل التشتت إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 ملليلتر. إضافة الكمية المطلوبة من cytochrome BO3 وإضافة المياه النقية جدا لجعل حجم إجمالي 50 ميكرولترات. احتضان خليط إعادة تشكيل في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق على خلاط الأسطوانة.المقبل تزن 50 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في كل من اثنين من قبعات أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم تزن 100 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في اثنين آخرين 1.5 ملليلتر قبعات أنبوب. أغلق القبعات باستخدام فيلم البارافين لمنع التجفيف.أضف أول 50 ملليغرام من الميكروبات البوليسترين في خليط إعادة تشكيل عن طريق وضع الغطاء مع الميكروبات البوليسترين على أنبوب البلاستيك 1.5 ملليلتر مع التشتت المعدة. ثم قم بإجراء دورة قصيرة لبضع ثوانٍ لجلب الميكروبات إلى الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان التعليق عند أربع درجات مئوية على خلاط الأسطوانة للسماح للميكروبات البوليسترين لامتصاص السطح لمدة 30 دقيقة.كرر إضافات الميكروبات البوليسترين واحتضان على النحو التالي. أضف 50 ملليغرام من الميكروبات لمدة 60 دقيقة من الحضانة. ثم إضافة 100 ملليغرام من الميكروبات لمدة 60 دقيقة من الحضانة.وأخيرا، إضافة 100 ملليغرام من الميكروبات لمدة 120 دقيقة من الحضانة. فصل محلول البروتيوليبوم من الميكروبات البوليسترين باستخدام ميكرويبيت مع طرف رقيقة. تخفيف التشتت في 90 ملليلتر من المخزن المؤقت MOPS في TI 45 أنبوب فائقة التركيز.فائقة التركيز التشتت باستخدام نوع 45 TI الدوار في 125، 000 مرات G لمدة ساعة واحدة إلى بيليه proteoliposomes. بعد الطرد الفائق، والتخلص من سوبرنات وشطف الكريات مع العازلة MOPS دون resuspending بيليه. بعد التخلص من العازلة الشطف, إعادة تعليق proteoliposomes في 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت MOPS عن طريق الأنابيب ذهابا وإيابا مع ميكروبيبيت رقيقة يميل قبل نقل التعليق إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 ملليلتر.بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 12، 000 مرات G لإزالة الحطام، ونقل الماحتة الذي هو proteoliposomes المعاد تشكيلها في قارورة جديدة. الغراء ما يصل إلى تسعة غطاء زجاجي ينزلق على سطح الذهب المتبخر باستخدام ثنائي مكون منخفض الفلورة الايبوكسي. علاج الغراء في 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.قبل التعديل مع طبقة أحادية ذاتية التجميع ، افصل الغطاء الزجاجي من رقائق السيليكون بشفرة. نظرا لرقم من زلات الغطاء، والعناية عند فصل زلات الغطاء لا الكراك أو كسر الشرائح الزجاجية. تراجع الغطاء المغلف بالذهب منفصلة حديثا ينزلق إلى حل 6-marcaptohexanol وترك في 20 إلى 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتشكيل طبقة أحادية تجميعها ذاتيا.في اليوم التالي، إزالة زلات الغطاء المغلفة بالذهب من المحلول وغسل لفترة وجيزة بالماء أو الميثانول ومن ثم مع ايزوبروبانول. جفف الغطاء المغلف بالذهب تحت تدفق الغاز اللطيف. قم بتجميع زلة الغطاء المغلفة بالذهب في خلية كهربية الطيفية كما هو مخطط في بروتوكول النص.جعل الاتصال بالذهب مع سلك مسطح خارج منطقة محددة من قبل المطاط O-حلقة وبرغي بإحكام أسفل الخلية الكهروكيميائية على الجزء العلوي منه. إضافة ملليلترين من الحل العازل المنحل بالكهرباء ووضع المرجعية والأقطاب الكهربائية المساعدة في الخلية. تابع للتحقق من جودة الطبقة الأحادية ذاتية التجميع وتشغيل الفراغات كما هو موضح في بروتوكول النص.إضافة proteoliposomes إلى الخلية الكهروكيميائية في 0.5 ملليغرام في المليلتر التركيز الدهون النهائية ومزيج قليلا مع ماصة. انتظر 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم الانتهاء من امتصاص proteoliposomes على سطح القطب. اغسل الخلية عن طريق تغيير محلول العازلة 10 مرات على الأقل، ولكن تجنب ترك سطح القطب جاف تمامًا.الآن، تشغيل مطياف المعاوقة الكهروكيميائية في خلية مفتوحة المحتملة لتأكيد الذاتي تجميعها أحادية الطبقة على القطب الذهبي لا تزال دون تغيير. تشغيل فولتاموجرامس دوري مع معدلات المسح 10 و 100 millivolts في الثانية لمراقبة أكسدة أوبيكينول catalatic والحد من الأكسجين عن طريق cytochrome BO3 في بداية إمكانات الحد من الكتروكيماويات. تعديل القطب الذهب كما كان من قبل ولكن باستخدام خمسة ميكروغرام لكل المليلتر proteoliposomes.دراسات انزيم واحد تقليل cytochrome BO3 نسبة الدهون إلى ما بين 0.1 و 0.2٪ ضع قطرة من زيت الغمر ومن ثم الخلية الكهروكيميائية على الهدف 60 مرة النفط من المجهر المقلوب الفلورية. باستخدام المرشحات المناسبة لفلوريسنسي FDLL، والتركيز على سطح القطب. وينبغي أن تظهر الدهنيات واحدة كما البقع المضيئة عند حد الحيود الهدف المجهر.التقاط صورة من الفلوركنس القوات الديمقراطية لتحرير رواندا. التبديل إلى واحد من مجموعات مرشح فلوريسكنس HPTS على المجهر للتحقق من أن HTPS florescence واضح للعيان ويمكن تمييزه عن الخلفية. زيادة شدة الضوء إذا لم يكن الأمر كذلك.برنامج برنامج المجهر لتنفيذ الحصول على صورة توقيت بالتناوب اثنين من مجموعات تصفية HTPS. للقيام بذلك، تعيين التعرض ثانية واحدة ثم انتقل إلى تطبيقات القائمة. ثم تعريف / تشغيل ND اقتناء وحدد اثنين من القنوات HTPS.تعيين التأخير بين عمليات الحصول على الصور في الحد الأدنى. في هذه التجربة استخدام 0.3 ثاني تأخير وخمسة دقيقة المدة الإجمالية. ضبط إعدادات قويوستات لتغيير المحتملة أثناء الحصول على الصورة كما هو مبين في بروتوكول النص.الآن ، في وقت واحد تشغيل الحصول على صورة في الوقت المناسب على المجهر والتسلسل المحتمل على potentiostat من خلال بدء يدويا كل من القياسات في نفس الوقت. تظهر هنا صور الفلوريسنس للليبوسومات الممتصة على الأقطاب الكهربائية في ثلاث تغطية مختلفة. الصبغة التي تحتوي على ليبوسومات مرئية على الصور والبقع المضيئة.وكان الجزء المركزي من الصورة مبيض الصورة للكشف عن مستوى الفلوركنس الخلفية. الصور على قناتين HTPS هي السوبر imposable حيث النسبة بين القناتين يتوافق مع 7.4 pH المستخدمة في هذه التجربة. وهناك عدد أكبر من الليبوزومات مرئية مع قناة القوات الديمقراطية لتحرير رواندا، مما يدل على وجود الليبوزومات التي لا تحتوي على HPTS مغلفة.والفرق بين قنوات HPTS وقنوات القوات الديمقراطية لتحرير رواندا أكثر وضوحا في التغطية الأعلى. ربما لأنه في تغطية عالية liposome، liposomes هي أكثر عرضة للانفجار أو الصمامات على السطح. هنا، يتم عرض تغيير فلورسيومات الليبوسوم على قناتين HTPS كمؤامرة سطحية ثلاثية الأبعاد للمنطقة المقابلة خلال 300 ثانية من التجربة.وقد طبقت الإمكانات الاختزالية بين 60 ثانية و 180 ثانية. يتم عرض الرسم المقابل لنسبة كثافة الحجم المترية للقنوتين HPTS مقابل الوقت. يظهر هنا متوسطات جميع التغيرات في vesicle pH داخل صورة واحدة عندما يكون محتوى cytochrome BO3 1.3٪ تظهر الزيادة في نسبة الوضوح بوضوح عند تطبيق إمكانية بين 0.1 و 0.3 فولت.عندما محتوى cytochrome BO3 هو قيمة أقل بكثير من 0.1 ٪المنحنيات المتوسطة تصبح لا يمكن تقريبا لا يمكن تحديدها من تلك التي liposomes فارغة. من المهم ضمان الإزالة الكاملة للمسطحات من الاستغناءات liposome لأن المخلفات قد تزيد من نفاذية liposomes إلى البروتونات. هذه الطرق تسمح لنا بطرح أسئلة محددة على الركيزة الكينيون الدهنية الطبيعية على النقيض من نظائرها الكينون للذوبان في الماء في كثير من الأحيان.وعلاوة على ذلك، حددت تجارب الإنزيم الواحد حالة تسرب غير معروفة من قبل حيث يعمل البروتين كقناة بروتون حيث تتدفق البروتونات بحرية إلى الوراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...