Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Forfatterne anerkender BBSRC (BB/P005454/1) for økonomisk støtte. NH blev finansieret af VILLUM FONDEN Young Investigator Program.

1. forberedelse af et Lipid/UQ-10/FDLL Mix
Bemærk: E. coli lipider bruges til Liposomer forberedelse skal være aliquoted og grundigt blandet med ubikinon-10 (enzym substrat) og lang bølgelængde fluorescerende farvestof-mærket lipider (til Liposomer størrelsesbestemmelse) forud for den rekonstituering.
<ol><li>Bruger et glas sprøjte, overføre 200 µL chloroform bestand af lipid polar uddrag fra Escherichia coli (25 mg/mL) i hætteglas til at gøre 5 mg delpr...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Metoden er velegnet til at studere proton pumpe af respiratorisk Membranproteiner, der kan være rekonstitueret ind i Liposomer og er i stand til at udveksle elektroner med Quinon pool. Proton pumpe aktivitet kan overvåges på single-enzym niveau ved hjælp af pH-følsomme (ratiometric) farvestoffer indkapslet i Liposom lumen (figur 1A).
Metoden bygger på ubikinon (eller andre kinoner), indarbejdet i lipid tolagede, evne til at udveksle elektroner med elektroder...

Oplysninger om enzym mekanismer og kinetik er normalt fremstillet på ensemble eller overordnet niveauet med enzym indbyggertal i tusinder til millioner af molekyler, hvor målinger repræsenterer en statistiske gennemsnit. Det vides dog, at komplekse makromolekyler såsom enzymer kan demonstrere heterogenitet i deres adfærd og molekylære mekanismer observeret på niveauet ensemble er ikke nødvendigvis gyldig for hvert molekyle. Sådanne afvigelser på enkelte molekyle-skalaen er blevet udførligt bekræftet ved studier af enkelt enzymer med en række forskellige metoder ved at opstå i løbet af de sidste to årtier1. Navnlig, har fluorescens påvisning af individuelle enzymaktivitet været anvendt til undersøge heterogenitet af enzymer aktivitet2,3 eller oplev såkaldte memory-effekt (perioder med høj enzymer aktivitet efterfulgt af perioder med lav aktivitet og omvendt)4,5.
Mange enkelt enzym undersøgelser kræver, at enzymerne, der er immobiliseret på overfladen eller rumligt fast på en anden måde at forblive tilstrækkelig lang i synsfelt for kontinuerlig observation. Enzym indkapsling i Liposomer har vist sig at aktiverer enzymet immobilisering samtidig forhindre eventuelle negative virkninger skyldes den overflade-enzym eller protein-protein interaktioner6,7. Derudover tilbyder Liposomer en unik mulighed for at studere enkelt Membranproteiner i deres naturlige lipid tolagede miljø8,9,10.
En klasse af membranproteiner, transportører, udøver en retningsbestemt translokation af stoffer over cellemembranen, en opførsel, som kun kan studeres, når proteiner er fremstillet i lipid dobbeltlag (fx, Liposomer)11, 12,13. For eksempel, spiller proton translokation, udstillet af flere enzymer af prokaryote og eukaryote elektron transportkæder, en vigtig rolle i cellulære respiration ved at oprette en proton-motiv magtanvendelse for ATPsyntesen. I dette tilfælde er proton pumpe aktivitet koblet til elektron overførslen, selv om de nærmere regler for denne proces ofte er fortsat undvigende.
For nylig har påvist vi muligheden for at par fluorescerende detection med elektrokemi at studere proton pumpe aktivitet af enkelt enzymer i terminal ubiquinol oxidase af Escherichia coli (cytokrom bo3) rekonstitueres i Liposomer14. Dette blev opnået ved indkapsling af en pH-følsom membran-vandtætte fluorescerende farvestof i lumen af Liposomer forberedt fra E. coli polar lipider (figur 1A). Protein beløb var optimeret, så de fleste Liposomer enten indeholdt ingen eller kun én rekonstitueret enzym molekyle (ifølge Poisson-fordelingen). De to substrater af cytokrom bo3 blev fastsat ved at tilføje ubikinon til lipid mix, der dannede Liposomer og (ambient) ilt i løsning. Liposomer er så tyndt adsorberet til et semi-transparent ultra-glat guld elektrode dækket med en selvsamlede éncellelag af 6-mercaptohexanol. Endelig er elektroden monteret i bunden af et simpelt spectroelectrochemical celle (figur 1B). Elektrokemiske kontrol af Quinon pool redox tilstand tillader sig at fleksibelt udløse eller stoppe den enzymatiske reaktion på ethvert tidspunkt, mens pH-følsom farvestof bruges til at overvåge pH ændringer inde i Liposomer som følge af proton translokation af lumen af enzymer. Ved hjælp af fluorescens-intensiteten af en anden, lipid-bundet fluorescerende farvestof, størrelsen og omfanget af individuelle Liposomer kan bestemmes og dermed kvantificering af enzymet proton pumpe aktivitet. Brug af denne teknik, fandt vi især, at cytokrom bo3 molekyler er i stand til at indgå i en spontan læk tilstand, der hurtigt forsvinder proton drivkraft. Målet med denne artikel er at introducere teknikken med enkelt Liposom målinger i detaljer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Proton-pumpe enzymer af elektron overføre kæder par redox reaktioner på proton translokation på tværs af membranen, oprettelse af proton-drivkraft til ATP produktion. Amphiphilic karakteren af membranproteiner kræver særlig opmærksomhed på deres håndtering og rekonstituering i naturlige lipid miljøet er uundværlig, når man studerer membran transport processer som proton translokation. Vi detalje her, en metode, der har været brugt i efterforskningen af den proton-pumpe mekanisme af membran redox enzymer, tager cytokrom bo3 fra Escherichia coli , som et eksempel. En kombination af elektrokemi og Fluorescens mikroskopi bruges til at styre redox delstaten Quinon pool og overvåge pH ændringer i lumen. På grund af den rumlige opløsning af fluorescerende mikroskopi, kan hundredvis af Liposomer måles samtidigt mens enzym indhold kan skaleres til en enkelt enzym eller transporter pr. Liposom. Respektive enkelt enzym-analyse kan afsløre mønstre i enzym funktionelle dynamik, der ellers kan være skjult af funktionsmåden for hele befolkningen. Vi omfatter en beskrivelse af et script til automatisk billedanalyse.

Kvaliteten af guld-modificeret dække slip (elektrode) med en SAM af 6MH kontrolleres før hver eksperiment med elektrokemisk impedans spektroskopi. Figur 2A viser repræsentative Cole Cole parceller målt ved hjælp af elektrokemiske impedans spektroskopi, før og efter Liposomer er adsorberet. Hvis kvaliteten af SAM er tilstrækkelig, bør impedans spektroskopi viser en næsten ren kapacitiv opførsel der resulterer i en semi-cirkel Cole Cole plot. Diameter...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Vi præsenterer her, en protokol for at studere den molekylære mekanisme af proton translokation over lipid membraner af enkelt Liposomer, ved hjælp af cytokrom bo3 som et eksempel. Kombinere elektrokemi og Fluorescens mikroskopi, pH-ændringer i lumen af enkelt blærer, der indeholder én eller flere enzym, kan registreres og analyseres individuelt.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Denne metode gør det muligt at studere proton transport aktivitet af respiratoriske membran enzymer som cytokrom BO3 i en naturlig lipid bi-lag miljø. De vigtigste fordele ved denne enzym teknik er muligheden for at starte og stoppe enzymatiske reaktioner på ethvert tidspunkt ved hjælp af elektrokemi. Ved hjælp af en glassprøjte overførsel 200 mikroliter af chloroform bestand af lipid polar ekstrakt fra Escherichia coli i glas hætteglas til at gøre fem milligram aliquots.Tilføj 50 mikroliter af en milligram per milliliter ubiquinon 10 til lipider at gøre det endelige forhold på en til 100 ubiquinon 10 til lipider. Til blandingen tilsættes 20 mikroliter af en milligram pr. milliliter lang bølgelængde fluorescerende farvestof mærket lipid forkortet FDLL. Homogeniser kloroformopløsningen ved kort vortexing og fordamp det meste af kloroformen under en blid nitrogen- eller argonstrøm.Kloroformsporingerne fjernes helt ved yderligere fordampning under vakuum i mindst en time. Der tilsættes 312,5 mikroliter på 40 millimolar MOPS pH 7,4 buffer til en aliquot lipider ubiquinon 10 FDLL tørblanding. Bland vortex til lipid filmen er fuldt re-suspenderet efterfulgt af to minutters behandling i et ultralydsbad.Næste tilføje 125 mikroliter af 25 millimolar HPTS, en pH følsom fluorescerende farvestof, der vil blive indkapslet inde i liposomer. Nu tilsættes 137,5 mikroliter af 250 millimolar OGP overfladeaktivt stof. Efter blanding ved hjælp af vortex, sonikere blandingen i en ultralyd vandbad i 10 minutter for at sikre, at alle lipider er opløses i overfladeaktive micelles.Overfør derefter dispersionen til et 1,5 milliliter plastrør. Tilsæt den nødvendige mængde cytokrom BO3 og tilsæt ultra rent vand for at lave et samlet volumen på 50 mikroliter. Inkuber rekonstitutionsblandingen ved fire grader celsius i 10 minutter på en rulleblander.Næste vejer 50 milligram polystyren mikroperler i hver af de to 1,5 milliliter rør hætter. Derefter vejes 100 milligram polystyren mikroperler i yderligere to 1,5 milliliter rør hætter. Luk hætterne med paraffinfilm for at undgå tørring.Der tilsættes de første 50 mg polystyrenmikroper i rekonstitutionsblandingen ved at sætte hætten med polystyrenmikroper på 1,5 milliliterplastrør med den forberedte dispersion. Derefter udføre et kort spin i et par sekunder for at bringe mikroperler til bunden af røret. Suspensionen inkuberes ved fire grader celsius på en rulleblander, så polystyrenmikroperne kan absorbere overfladeaktive stoffer i 30 minutter.Tilsætning af polystyrenmikroper og inkubationer gentages som følger. Tilføj 50 milligram mikroperler i 60 minutters inkubation. Derefter tilsættes 100 milligram mikroperler i 60 minutters inkubation.Og endelig, tilføje 100 milligram mikroperler i 120 minutters inkubation. Adskære proteoliposomopløsningen fra polystyrenmikroperene ved hjælp af en mikropipette med en tynd spids. Dispersionen fortyndes i 90 milliliter MOPS-buffer i TI 45 ultracentrifugerør.Ultracentrifuge spredningen ved hjælp af en type 45 TI rotor ved 125, 000 gange G i en time for at pellet proteoliposomerne. Efter ultracentrifugering kasseres supernatanten og pellets med MOPS buffer uden at tilbageholde pellet. Efter at skyllebufferen er kasseret, skal proteoliposomerne igen suspenderes i 500 mikroliter MOPS-buffer ved at pipette den frem og tilbage med en tynd spids mikropipette, før suspensionen overføres til et 1,5 milliliter plastrør.Efter centrifugering i fem minutter ved 12,000 gange G for at fjerne snavs, overføre supernatant, som er de rekonstituerede proteoliposomer i et nyt hætteglas. Lim op til ni glasdæksel glider på en fordampet guldoverflade ved hjælp af bi-komponent lav-fluorescens epoxy. Hærd limen ved 80 grader celsius i fire timer.Lige før modifikation med en selvsamlet mono-lag, løsrive glasdækslet glider fra silikone vafler med en klinge. På grund af dækslets tynde sedler skal du passe på, når du afmonterer dækslet for ikke at knække eller knække glasdiasene. Dyp den frisk fritliggende guld-belagt dække glider ind i en 6-marcaptohexanol løsning og lad ved 20 til 25 grader celsius natten til at danne selvsamlede mono-lag.Den næste dag fjernes guldbelagte dækselssedler fra opløsningen og vaskes kortvarigt med vand eller methanol og derefter med isopropanol. Tør guldbelagte dæksel glider under en blid gasstrøm. Saml den guldbelagte dækselseddel i en spektroelektrokemisk celle som diagrammet i tekstprotokollen.Kom i kontakt med guldet med en flad ledning uden for et område defineret af en gummi O-ring og stramt skrue ned den elektrokemiske celle på toppen af det. Der tilsættes to milliliter elektrolytbufferopløsningen, og reference- og hjælpeelektroderne i cellen. Fortsæt med at kontrollere kvaliteten af det selvsamlede monolag, og kør emner som beskrevet i tekstprotokollen.Tilsæt proteoliposomer til den elektrokemiske celle ved 0,5 milligram pr. milliliter endelige lipiderkoncentration og bland lidt med en pipette. Vent 30 til 60 minutter ved stuetemperatur, indtil optagelsen af proteoliposomer på elektrodeoverfladen er færdig. Vask cellen ved at ændre bufferopløsningen mindst 10 gange, men undgå at lade elektrodeoverfladen være helt tør.Kør nu elektrokemisk impedansspektroskopi ved åben cellepotentiale for at bekræfte, at det selvsamlede monolag på guldelektroden forbliver uændret. Kør cyklisk voltammogram med scanningshastigheder 10 og 100 millivolt per sekund for at observere katastatisk ubiquinoloxidation og iltreduktion ved cytokrom BO3 ved debutpotentialer for elektrokemisk quinonreduktion. Ændre guldelektroden som før, men ved hjælp af fem mikrogram pr. milliliter proteoliposomer.For enkeltenzymundersøgelser reduceres det cytokromske BO3 til lipidforhold til mellem 0,1 og 0,2 %Placer en dråbe nedsænkningsolie og derefter den elektrokemiske celle på 60 gange oliemålet for et omvendt fluorescensmikroskop. Brug passende filtre til FDLL fluorescens, fokusere på elektrodeoverfladen. Enkelt liposomer skal fremstå som lyse pletter på diffraktionsgrænsen for mikroskopmålet.Tag et billede af FDLL florescence. Skift til et af HPTS-lysslysfiltersætene på mikroskopet for at kontrollere, at HTPS-lyssensen er klart synlig og kan skelnes fra baggrunden. Forøg lysintensiteten, hvis det ikke er tilfældet.Programmer mikroskopsoftwaren til at udføre en tidsstypisk billedopkøb ved at skifte to HTPS-filtersæt. Det gør du ved at indstille en eksponering på et sekund og derefter navigere til menuprogrammer. Definer/kør derefter ND-anskaffelse, og vælg to HTPS-kanaler.Indstil forsinkelsen mellem billedane anskaffelser som minimum. I dette eksperiment bruger 0,3 sekunders forsinkelse og fem minutters samlet varighed. Juster indstillingerne for potentiostaten for at ændre potentialet under billedopeelsen som angivet i tekstprotokollen.Nu kører samtidig den tidsinddet billede erhvervelse på mikroskopet og den potentielle sekvens på potentiostat ved manuelt at starte begge målinger på samme tid. Vist her er fluorescens billeder af liposomer absorberes på elektroderne på tre forskellige dækninger. Farvestoffet, der indeholder liposomer, er synlige på billederne som lyse pletter.Den centrale del af billedet var foto-bleget for at afsløre baggrunden florescence niveau. Billederne på to HTPS-kanaler er super uigennemtrængelige, hvor forholdet mellem de to kanaler svarer til en pH-værdi på 7,4, der anvendes i dette eksperiment. Et større antal liposomer er synlige med FDLL-kanalen, hvilket indikerer tilstedeværelsen af liposomer, der ikke har nogen HPTS indkapslet.Forskellen mellem HPTS- og FDLL-kanalerne er mere udtalt ved højere dækninger. Muligvis fordi ved høj liposom dækning, liposomer er mere tilbøjelige til at briste eller sikring på overfladen. Her er ændringen af en liposom florescence på to HTPS kanaler vist som en 3D overflade plot af det tilsvarende område i løbet af 300 sekunder af forsøget.Det reduktive potentiale blev anvendt mellem 60 sekunder og 180 sekunder. Det tilsvarende plot af volumenmetyrenintensitetsforhold for to HPTS-kanaler i forhold til tiden vises. Vist her er medianerne for alle vesicle pH ændringer i et enkelt billede, når cytokrom BO3 indhold er 1,3%En stigning i pH er klart synlig, når et potentiale mellem 0,1 og 0,3 volt anvendes.Når cytokrom BO3 indhold er en meget lavere værdi på 0,1%medianen kurver bliver næsten umulig at skelne fra de tomme liposomer. Det er vigtigt at sikre fuldstændig fjernelse af overfladeaktive stoffer fra liposom dispensationer, da resterne kan øge permeabilitet af liposomer til protoner. Disse metoder giver os mulighed for at stille specifikke spørgsmål om den naturlige lipofile quinon substrat i modsætning til de ofte anvendte vandopløselige quinon analoger.Yderligere mere, de enkelte enzym eksperimenter identificeret en hidtil ukendt lækage tilstand, hvor proteinet fungerer som en proton kanal, hvor protoner frit flyde baglæns.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H2 Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...