Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
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Die Autoren erkennen die BBSRC (BB/P005454/1) für die finanzielle Unterstützung. NH wurde durch VILLUM Foundation Young Investigator Programm finanziert.

1. Vorbereitung der Lipid/UQ-10/FDLL Mischung
Hinweis: E. coli Lipide die Liposomen Vorbereitung soll regelmÄÑig und gründlich gemischt mit Ubichinon-10 (Enzym-Substrat) und langwellige fluoreszierenden Farbstoff-markierten Lipide (für Liposomen Größenbestimmung) vor der Rekonstitution.
<ol><li>Mit einer Glasspritze, Transfer 200 µL Chloroform Bestand an Lipid polar extrahiert aus Escherichia coli (25 mg/mL) in Glasfläschchen, 5 mg Aliquote zu machen.</li>
...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Die beschriebene Methode eignet sich studieren Proton Pumpen durch respiratorische Membranproteine, die in Liposomen wiederhergestellt werden können und sind in der Lage, Elektronen mit dem Quinone Pool austauschen. Protonen-Pumpen-Aktivität kann auf der Single-Enzym-Ebene mit pH-Sensitive (ratiometrischen) Farbstoffe in den Liposomen Lumen (Abbildung 1A) gekapselt überwacht werden.
Die Methode beruht auf der Fähigkeit von Ubichinon (oder andere Quinones), in ...

Informationen über Enzym Mechanismen und Kinetik ist in der Regel auf das Ensemble oder makroskopischen Ebene mit Enzym Bevölkerung in die Tausende bis Millionen von Molekülen, erhalten wo Messungen einen statistischen Durchschnitt darstellen. Es ist jedoch bekannt, dass komplexe Makromoleküle wie Enzyme Heterogenität in ihrem Verhalten zeigen können und molekulare Mechanismen beobachtet auf der Ensemble-Ebene nicht unbedingt für jedes Molekül gelten. Solche Abweichungen der einzelnen Molekül-Skala wurden weitgehend durch Studien der einzelnen Enzyme mit einer Vielzahl von Methoden, die in den letzten zwei Jahrzehnten1bestätigt. Vor allem, wurde Fluoreszenz-Detektion von einzelnen Enzymaktivität zur Heterogenität der Enzyme Aktivität2,3 zu untersuchen oder entdecken den sogenannten Memory-Effekt (Perioden der hohen Enzyme Tätigkeit ist es gelungen, durch Zeiten der niedrigen Aktivität und umgekehrt)4,5.
Viele einzelne Enzymstudien erfordern, dass die Enzyme auf der Oberfläche oder räumlich feste auf andere Weise ausreichend lange in das Sichtfeld für kontinuierliche Beobachtung bleiben immobilisiert sind. Enzym-Kapselung in Liposomen nachweislich Enzym Immobilisierung und verhindern, dass mögliche negative Auswirkungen aufgrund der Oberfläche-Enzym oder Protein-Protein Interaktionen6,7zu aktivieren. Darüber hinaus bieten die Liposomen eine einzigartige Möglichkeit einzelne Membranproteine in ihrer natürlichen Lipid Bilayer Umwelt8,9,10zu studieren.
Eine Klasse von Membranproteinen, Transporter, übt eine direktionale Translokation von Stoffen über die Zellmembran, ein Verhalten, das nur untersucht werden kann, wenn Proteine in der Lipid Bilayer (z.B. Liposome)11wieder hergestellt werden, 12,13. Zum Beispiel spielt Protonen-Translokation, ausgestellt durch mehrere Enzyme von prokaryotischen und eukaryotischen Elektronentransport Ketten, eine wichtige Rolle in der Zellatmung durch die Schaffung einer Proton-treibende Kraft für die ATP-Synthese verwendet. In diesem Fall ist das Proton Pumpen Aktivität an den Elektronentransfer gekoppelt, obwohl der genaue Mechanismus dieses Prozesses oft schwer fassbar bleibt.
Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, paar Fluoreszenz-Detektion mit Elektrochemie, Proton, die Aktivität der einzelnen Enzyme von der Klemme Ubiquinol-Oxidase von Escherichia coli (Cytochrom Bo3) Pumpen zu studieren die Liposomen14wieder hergestellt. Dies wurde erreicht durch Verkapselung von einer pH-Sensitive Membran undurchlässig Leuchtstofffärbung in das Lumen der Liposome aus E. vorbereitet coli polaren Lipide (Abbildung 1A). Die Protein-Menge wurde optimiert, so dass die meisten Liposomen entweder keinen oder nur einen rekonstituierte Enzym-Molekül (nach Poisson-Verteilung) enthalten. Die beiden Substrate von Cytochrom Bo3 wurden zur Verfügung gestellt, indem Sie die Lipid-Mischung, die die Liposomen und (ambient) Sauerstoff in Lösung gebildet Ubiquinon hinzufügen. Die Liposomen sind dann dünn auf einer halbtransparenten ultrasanfte gold Elektrode, bedeckt mit einer selbst-zusammengebauten monomolekularen Film des 6-Mercaptohexanol adsorbiert. Zu guter Letzt wird die Elektrode an der Unterseite einer einfachen Spectroelectrochemical Zelle (Abbildung 1 b) montiert. Elektrochemische Quinone Pool Redox staatlicher Kontrolle erlaubt es flexibel auslösen oder die enzymatische Reaktion jederzeit zu stoppen, während der pH-Sensitive Farbstoff zur pH-Wert-Änderungen in das Lumen der Liposomen durch Protonen-Translokation durch Überwachung dient der Enzyme. Durch die Verwendung der Fluoreszenzintensität von einem zweiten und Lipid gebundener Fluoreszenzfarbstoff, die Größe und das Volumen der einzelnen Liposomen kann ermittelt werden und somit die Quantifizierung des Enzyms Proton Pumpen Aktivität. Mit dieser Technik fanden wir vor allem, dass Cytochrom Bo3 Moleküle in der Lage sind, einen spontanen Leck Zustand zu schließen, die schnell verflüchtigt sich die Protonen treibende Kraft. Das Ziel dieses Artikels ist es, die Technik der einzelnen Liposomen Messungen im Detail vorstellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Protonen-Pumpen Enzyme des Elektrons übertragen Ketten paar Redoxreaktionen an Protonen-Translokation durch die Membran, erstellen eine Proton-treibende Kraft für die ATP-Produktion verwendet. Der amphiphilen Charakter der Membranproteine erfordert besonderes Augenmerk auf deren Handhabung und Rekonstitution in die natürliche Lipid-Umwelt ist unverzichtbar, wenn Transport Membranverfahren wie Protonen-Translokation zu studieren. Hier zeigen wir eine Methode, die für die Untersuchung des Protonen-Pumpen-Mechanismus der Membran Redox Enzyme verwendet worden ist, Cytochrom Bo3 aus Escherichia coli als Vorbild nehmen. Eine Kombination der Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie dient zur Steuerung der Redox-Status des Quinone Pool und Monitor pH-Wert ändert sich in das Lumen. Durch die räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie können Hunderte von Liposomen gleichzeitig gemessen werden, während die Enzym-Inhalt auf ein einziges Enzym oder Transporter pro Liposomen verkleinert werden kann. Die jeweiligen einziges Enzym Analyse kann Muster in der Enzym-funktionale Dynamik zeigen, die sonst durch das Verhalten der gesamten Bevölkerung verborgen sein könnte. Wir fügen Sie eine Beschreibung eines Skripts zur automatischen Bildanalyse.

Die Qualität des Gold-modifizierte Deckglases (Elektrode) mit einem SAM 6MH wird vor jedem Experiment mit elektrochemische Impedanz Spektroskopie überprüft. Abbildung 2A zeigt repräsentative Cole-Cole-Grundstücke mit elektrochemische Impedanz Spektroskopie vor und nach der Liposomen adsorbiert werden gemessen. Wenn die Qualität der SAM ausreicht, sollte Impedanz Spektroskopie ein fast reines kapazitives Verhalten, was zu einem Halbkreis Cole-Cole-Grunds...

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3 als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Protonentransportaktivität von Atmungsmembranenzymen wie Cytochrom BO3 in einer natürlichen Lipid-Zweischichtumgebung. Der Hauptvorteil dieser Einzelenzymtechnik ist die Möglichkeit, enzymatische Reaktionen jederzeit mit Hilfe der Elektrochemie zu beginnen und zu stoppen. Mit einer Glasspritze transferieren Sie 200 Mikroliter Chloroform-Lager aus Lipidpolarextrakt aus Escherichia coli in Glasfläschchen, um fünf Milligramm Aliquots zu machen.Fügen Sie 50 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Ubiquinon 10 zu den Lipiden, um das endgültige Verhältnis von eins zu 100 Ubichinon 10 zu Lipiden zu machen. Zur Mischung fügen Sie 20 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter lange Wellenlänge Fluoreszenzfarbstoff mit der Bezeichnung Lipid abgekürzt FDLL. Homogenisieren Sie die Chloroform-Lösung durch kurzes Wirbeln und verdampfen Sie den größten Teil der Chloroform unter einem schonenden Stickstoff- oder Argonfluss.Entfernen Sie die Chloroformspuren durch weitere Verdunstung unter Vakuum für mindestens eine Stunde vollständig. Fügen Sie 312,5 Mikroliter 40 Millimolar MOPS pH 7.4 Puffer zu einem Aliquot von Lipiden Ubiquinon 10 FDLL Trockenmischung. Mischen Sie den Wirbel, bis der Lipidfilm vollständig wieder aufgehängt wird, gefolgt von zwei Minuten Behandlung in einem Ultraschallbad.Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter von 25 Millimolar HPTS hinzu, einem pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff, der in den Liposomen eingekapselt wird. Fügen Sie nun 137,5 Mikroliter 250 Millimolar OGP Tensid hinzu. Nach dem Mischen mit Wirbel, beschallen Sie die Mischung in einem Ultraschall-Wasserbad für 10 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Lipide in Tensid-Mizellen löslich sind.Dann die Dispersion in ein 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr geben. Fügen Sie die erforderliche Menge an Cytochrom BO3 hinzu und fügen Sie ultrareines Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu machen. Die Rekonstitutionsmischung bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang auf einem Walzenmischer inkubieren.Als nächstes wiegen 50 Milligramm Polystyrol Mikroperlen in jeder der beiden 1,5 Milliliter Rohrkappen. Dann wiegen 100 Milligramm Polystyrol Mikroperlen in zwei weitere 1,5 Milliliter Rohrkappen. Schließen Sie die Kappen mit Paraffinfolie, um ein Trocknen zu verhindern.Fügen Sie die ersten 50 Milligramm Polystyrol-Mikroperlen in die Rekonstitutionsmischung ein, indem Sie die Kappe mit Polystyrol-Mikroperlen auf das 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr mit der vorbereiteten Dispersion legen. Führen Sie dann einen kurzen Spin für ein paar Sekunden durch, um Mikroperlen an den Boden des Rohres zu bringen. Inkubieren Sie die Suspension bei vier Grad Celsius auf einem Walzenmischer, damit die Polystyrol-Mikroperlen das Tensid 30 Minuten lang aufnehmen können.Wiederholen Sie die Zusätze von Polystyrol-Mikroperlen und Inkubationen wie folgt. Fügen Sie 50 Milligramm Mikroperlen für 60 Minuten Inkubation. Dann fügen Sie 100 Milligramm Mikroperlen für 60 Minuten inkubation.Und schließlich, fügen Sie 100 Milligramm Mikroperlen für 120 Minuten inkubation. Trennen Sie die Proteoliposomlösung von den Polystyrol-Mikroperlen mit einer Mikropipette mit einer dünnen Spitze. Verdünnen Sie die Dispersion in 90 Milliliter MOPS-Puffer in TI 45 Ultrazentrifugenrohr.Ultrazentrifugieren Sie die Dispersion mit einem Typ 45 TI Rotor bei 125. 000 mal G für eine Stunde, um die Proteoliposomen zu pellet. Nach der Ultrazentrifugation den Überstand entsorgen und die Pellets mit MOPS-Puffer ausspülen, ohne das Pellet wieder aufzuhängen. Nachdem Sie den Spülpuffer verworfen haben, setzen Sie die Proteoliposomen in 500 Mikroliter MOPS-Puffer wieder auf, indem Sie ihn mit einer dünnen mikropipette hin und her pfeifen, bevor Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr übertragen.Nach zentrifugieren für fünf Minuten bei 12.000 mal G, um die Trümmer zu entfernen, übertragen Sie den Überstand, der die rekonstituierten Proteoliposomen ist, in eine neue Durchstechflasche. Mit zweikomponenten fluoreszierendem Epoxid werden bis zu neun Glasabdeckungen auf eine verdampfte Goldoberfläche geklebt. Den Kleber vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius aushärten.Kurz vor der Modifikation mit einer selbstmontierten Monoschicht die Glasabdeckung von den Silikonwafern mit einer Klinge lösen. Aufgrund der Dünnen der Abdeckung rutscht, achten Sie beim Lösen der Abdeckung rutscht nicht zu knacken oder brechen die Glasrutschen. Tauchen Sie die frisch abgetrennte goldbeschichtete Abdeckung schlüpft in eine 6-Marcaptohexanol-Lösung und lassen Sie bei 20 bis 25 Grad Celsius über Nacht die selbst montierte Mono-Schicht bilden.Am nächsten Tag die vergoldeten Deckelschlupf von der Lösung nehmen und kurz mit Wasser oder Methanol und dann mit Isopropanol waschen. Trocknen Sie die vergoldete Abdeckung rutscht unter einem sanften Gasstrom. Montieren Sie den goldbeschichteten Deckelschlupf in einer spektro-elektrochemischen Zelle, wie im Textprotokoll dargestellt.Nehmen Sie kontaktiere das Gold mit einem flachen Draht außerhalb eines durch einen Gummi-O-Ring definierten Bereichs und schrauben Sie die elektrochemische Zelle darauf fest. Fügen Sie zwei Milliliter der Elektrolytpufferlösung hinzu und legen Sie die Referenz- und Hilfselektroden in die Zelle. Überprüfen Sie die Qualität der selbst zusammengesetzten Mono-Layer, und führen Sie Leerzeichen aus, wie im Textprotokoll beschrieben.Proteoliposomen bei 0,5 Milligramm pro Milliliter Endfettkonzentration in die elektrochemische Zelle geben und leicht mit einer Pipette vermischen. Warten Sie 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur, bis die Absorption von Proteoliposomen auf der Elektrodenoberfläche abgeschlossen ist. Waschen Sie die Zelle, indem Sie die Pufferlösung mindestens 10 Mal wechseln, aber vermeiden Sie, die Elektrodenoberfläche vollständig trocken zu lassen.Führen Sie nun die elektrochemische Impedanzspektroskopie an offenem Zellpotenzial aus, um die selbstzusammengesetzte Monoschicht auf der Goldelektrode zu bestätigen, unverändert. Führen Sie zyklische Voltammogramme mit Scanraten von 10 und 100 Millivolt pro Sekunde aus, um die katalatische Ubiquinoloxidation und Sauerstoffreduktion durch Cytochrom BO3 bei Beginn der elektrochemischen Chinonreduktion zu beobachten. Ändern Sie die Goldelektrode wie zuvor, aber mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Proteoliposomen.Reduzieren Sie bei Einzelenzymstudien das Cytochrom-BO3-Lipid-Verhältnis auf 0,1 bis 0,2%Platzieren Sie einen Tropfen Tauchöl und dann die elektrochemische Zelle auf das 60-fache Ölobjektiv eines invertierten Fluoreszenzmikroskops. Mit geeigneten Filtern für die FDLL-Fluoreszenz konzentrieren Sie sich auf die Elektrodenoberfläche. Einzelne Liposomen sollten als helle Flecken an der Beugungsgrenze des Mikroskopobjektivs erscheinen.Nehmen Sie ein Bild von FDLL Blütenstand. Wechseln Sie zu einem der HPTS-Blütenfiltersätze am Mikroskop, um zu überprüfen, ob HTPS-Blütenstand deutlich sichtbar und vom Hintergrund zu unterscheiden ist. Erhöhen Sie die Lichtintensität, wenn dies nicht der Fall ist.Programmieren Sie die Mikroskopsoftware, um eine zeitgezeitieinige Bildaufnahme durchzuführen, indem Sie zwei HTPS-Filtersätze wechseln. Legen Sie dazu eine Belichtungszeit von einer Sekunde fest und navigieren Sie dann zu Menüanwendungen. Definieren/Ausführen der ND-Erfassung und wählen Sie zwei HTPS-Kanäle aus.Legen Sie die Verzögerung zwischen den Bildabsicherungen mindestens fest. Verwenden Sie in diesem Experiment 0,3 Sekunden Verzögerung und eine Gesamtdauer von fünf Minuten. Passen Sie die Einstellungen des Potentiostats an, um das Potenzial während der Bildaufnahme zu ändern, wie im Textprotokoll angegeben.Führen Sie nun gleichzeitig die zeitgenaue Bildaufnahme auf dem Mikroskop und die potenzielle Sequenz auf dem Potentiostat aus, indem Sie beide Messungen gleichzeitig manuell starten. Hier sind Fluoreszenzbilder von Liposomen zu sehen, die bei drei verschiedenen Abdeckungen auf die Elektroden absorbiert werden. Der Farbstoff, der Liposomen enthält, ist auf den Bildern als helle Flecken sichtbar.Der zentrale Teil des Bildes wurde fotogebleicht, um die Hintergrundblütenzuflaute zu enthüllen. Die Bilder auf zwei HTPS-Kanälen sind super unverstwirslich, wenn das Verhältnis zwischen den beiden Kanälen einem in diesem Experiment verwendeten pH-Wert von 7,4 entspricht. Eine größere Anzahl von Liposomen sind mit dem FDLL-Kanal sichtbar, was auf das Vorhandensein von Liposomen hinweist, die keine HPTS-verkapselt haben.Der Unterschied zwischen den HPTS- und FDLL-Kanälen ist bei höheren Abdeckungen stärker ausgeprägt. Möglicherweise, weil bei hoher Liposomenabdeckung, Liposomen sind eher platzen oder Sicherung auf der Oberfläche. Hierwird wird die Veränderung einer Liposomenblüten auf zwei HTPS-Kanälen als 3D-Oberflächendiagramm des entsprechenden Bereichs während 300 Sekunden des Experiments dargestellt.Das reduktive Potenzial wurde zwischen 60 Sekunden und 180 Sekunden angewendet. Das entsprechende Diagramm des Volumenmetrikintensitätsverhältnisses von zwei HPTS-Kanälen im Vergleich zur Zeit wird angezeigt. Hier sind die Mediane aller vesikeligen pH-Änderungen innerhalb eines einzelnen Bildes dargestellt, wenn der Cytochrom-BO3-Gehalt 1,3% beträgt.Wenn Cytochrom-BO3-Gehalt einen viel niedrigeren Wert von 0,1% hat, werden die Mediankurven fast nicht mehr von denen leerer Liposomen zu unterscheiden. Es ist wichtig, eine vollständige Entfernung des Tensids aus den Liposomendispensationen sicherzustellen, da die Residuen die Durchlässigkeit der Liposomen gegenüber Protonen erhöhen können. Diese Methoden ermöglichen es uns, spezifische Fragen zum natürlichen lipophilen Chinonsubstrat im Gegensatz zu den oft verwendeten wasserlöslichen Chinonanaloga zu stellen.Darüber hinaus identifizierten die Einzelenzymexperimente einen bisher unbekannten Leckzustand, in dem das Protein als Protonenkanal fungiert, in dem Protonen frei rückwärts fließen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...