Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

המחברים להכיר את BBSRC (BB/P005454/1) עבור תמיכה כספית. מלון NH מומן על-ידי התוכנית חוקר צעיר קרן VILLUM.

1. הכנת תערובת ליפיד/UQ-10/FDLL
הערה: אי קולי ליפידים המשמש עבור ההכנה של ליפוזומים צריך להיות aliquoted ולערבב היטב עם ubiquinone-10 (סובסטרט) ושומנים ארוך באורך הגל פלורסנט התווית על-ידי צבע (לקביעת גודל ליפוזומים) לפני שיחזור.
<ol><li>באמצעות מזרק זכוכית, µL 200 העברה של כלורופורם מל?...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

השיטה המתוארת מתאימה ללמוד פרוטון שאיבה על ידי חלבונים ממברנה הנשימה יכולה להיות מחדש לתוך ליפוזומים והם מסוגלים להחליף אלקטרונים עם הבריכה quinone. פרוטון שאיבה פעילות ניתן לנטר ברמת אנזים יחיד באמצעות צבעי רגיש pH (רציומטרי) במארז ליפוזום לומן (איור 1 א').
השיט?...

מידע על מנגנונים אנזים וקינטיקה מתקבלת בדרך כלל על אנסמבל macroscale הרמה או עם אנזים אוכלוסייה באלפים מיליוני מולקולות, כאשר מידות מייצגים ממוצע סטטיסטי. זה ידוע, עם זאת, כי מקרומולקולות מורכבים כמו אנזימים עשוי להדגים הטרוגניות בהתנהגות שלהם, המנגנונים המולקולריים נצפתה רמה אנסמבל אינם בהכרח חוקיים עבור כל מולקולה. כזה סטיות בסולם מולקולה בודדת בהרחבה אושרו על ידי מחקרים של אנזימים יחיד עם מגוון רחב של שיטות המתעוררים במהלך שני העשורים האחרונים1. ראוי לציין, קרינה פלואורסצנטית גילוי של פעילות אנזים בודדים שימש לחקור הטרוגניות של אנזימים-פעילות-2,-3 או לגלות את אפקט זיכרון כביכול (תקופות של פעילות אנזימים גבוהה על ידי תקופות של לחץ נמוך פעילות ו ולהיפך)4,5.
מחקרים אנזים יחיד רבים דורשים כי האנזימים הם ותשמרו על פני השטח או קבוע במרחב בדרך אחרת להישאר מספיק זמן שם שדה הראייה להשגחה מתמדת. אנזים אנקפסולציה בתוך ליפוזומים הוכח להפעלת האנזים הנייח תוך מניעת כל השפעה שלילית בשל פני השטח-אנזים או חלבון אינטראקציות6,7. בנוסף, ליפוזומים מציעים אפשרות ייחודית ללמוד חלבוני ממברנה אחת שלהם השומנים הטבעיים bilayer הסביבה8,9,10.
מחלקה של קרום חלבונים, מובילים, תרגילים התקה כיוונית של חומרים על פני קרום התא, התנהגות שניתן רק ללמוד כאשר חלבונים הם מחדש לתוך השומנים bilayers (למשל, ליפוזומים)11, 12,13. לדוגמה, רוברטסונית פרוטון, הוצגו על ידי מספר אנזימים רשתות תחבורה אלקטרון prokaryotic ו האיקריוטים, ממלא תפקיד חשוב בנשימה תאית על ידי יצירת כוח המניע-פרוטון המשמש סינתזת ATP. במקרה זה, פרוטונים שאיבה פעילות זה משולב כדי העברת אלקטרונים, למרות מנגנון מפורט של תהליך זה לעיתים קרובות נותרת חמקמקה.
לאחרונה, להדגים את האפשרות זיהוי פלורסנט זוג עם אלקטרוכימיה ללמוד פרוטון שאיבה פעילות של אנזימים יחיד של מסוף ubiquinol אוקסידאז של Escherichia coli (ציטוכרום בו3) מחדש ליפוזומים14. . זה הושג על-ידי ומגעים צבע אטום-ממברנה רגיש pH פלורסנט לתוך לומן של ליפוזומים מקריסטלים של אי coli ליפידים קוטביים (איור 1 א'). כמות חלבון אופטימלי כך רוב ליפוזומים הכיל גם מולקולת אנזים משוקם אין או אחד בלבד (על פי התפלגות פואסון). שני מצעים של ציטוכרום בו3 נמסרו על-ידי הוספת ubiquinone לתערובת השומנים שיצרו ליפוזומים וחמצן (הסביבה) בתמיסה. ליפוזומים הם מכן בדלילות הספוחה על שקוף למחצה ultra-חלקה זהב אלקטרודה, מכוסה טפט שהורכב עצמית של 6-mercaptohexanol. לבסוף, האלקטרודה נטענה על החלק התחתון של תא spectroelectrochemical פשוטה (איור 1B). שליטה אלקטרוכימי של המדינה quinone בריכת חמצון-חיזור מאפשר אחד בגמישות להפעיל או להפסיק את התגובה אנזימטי בכל רגע, בעוד לצבוע רגיש pH משמשת כדי לעקוב אחר השינויים pH בתוך לומן של ליפוזומים כתוצאה פרוטון רוברטסונית מאת אנזימים. על-ידי שימוש ניתן לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית השני, השומנים מכורך הפלורסנט, גודל ונפח של ליפוזומים בודדים ובכך כימות של אנזים פרוטון שאיבה פעילות. בעזרת טכניקה זו, ובייחוד מצאנו כי ציטוכרום בו3 מולקולות מסוגלים להיכנס למצב הדליפה ספונטנית כי כלתה במהירות את הכוח המניע של פרוטון. המטרה של מאמר זה היא להציג את הטכניקה של ליפוזום יחיד מדידות בפירוט.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

משאבות פרוטונים אנזימים של אלקטרון העברה שרשראות כמה תגובות חמצון-חיזור פרוטון רוברטסונית על פני הקרום, יצירת כוח המניע-פרוטון לייצור ATP. מהות קרום חלבונים amphiphilic דורש תשומת לב מיוחדת לטיפול שלהם, שיחזור לסביבה הטבעית השומנים היא הכרחית עבור לומדים תחבורה תהליכים קרום כמו טרנסלוקציה פרוטון. כאן, אנחנו פירוט שיטת שימש במשך החקירה של מנגנון משאבות פרוטונים של קרום אנזימים חמצון-חיזור, לוקח ציטוכרום בו3 Escherichia coli כדוגמה. שילוב של מיקרוסקופיית אלקטרוכימיה, קרינה פלואורסצנטית משמש כדי לקבוע את מצב חמצון-חיזור quinone בריכה וצג pH השינויים לומן. בגלל שהרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאות ליפוזומים ניתן למדוד בו זמנית בעוד התוכן האנזים וניתן לשנותם אנזים יחיד או טרנספורטר לכל ליפוזום. ניתוח האנזים יחיד המתאימים יכול לחשוף דפוסים הדינמיקה פונקציונלי של אנזים זה ייתכן אחרת מוסתר על ידי ההתנהגות של כלל האוכלוסייה. אנו כוללים תיאור של קובץ script עבור ניתוח תמונות אוטומטית.

האיכות של תגית כיסוי זהב-לאחרונה (האלקטרודה) עם סאם של 6MH נבדק לפני כל ניסוי עם עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה. איור 2A מראה נציג קול-קול חלקות שנמדדו בשימוש עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה לפני ואחרי ליפוזומים הם הספוחה. אם האיכות של סאם מספיקה, ספקטרוסקופיה ע?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3 כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

שיטה זו מאפשרת לחקור את פעילות הובלת הפרוטון של אנזימי קרום הנשימה כמו ציטוכרום BO3 בסביבה טבעית של שומנים דו שכבתיים. היתרונות העיקריים של טכניקת אנזים יחיד זו היא האפשרות להתחיל ולהפסיק תגובות אנזימטיות בכל רגע באמצעות אלקטרוכימיה. באמצעות העברת מזרק זכוכית 200 microliters של מלאי כלורופורם של תמצית קוטב השומנים מ Escherichia coli לתוך בקבוקוני זכוכית לעשות חמישה aliquots מיליגרם.הוסף 50 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר ubiquinone 10 שומנים כדי להפוך את היחס הסופי של אחד עד 100 ubiquinone 10 כדי שומנים. לתערובת להוסיף 20 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר אורך גל ארוך צבע פלואורסצנטי שכותרתו FDLL מקוצר השומנים. הומוגניזציה של פתרון הכלורופורם על ידי מערבולת קצרה להתאדות רוב הכלורופורם תחת זרימת חנקן או ארגון עדינה.הסר את עקבות הכלורופורם לחלוטין על ידי אידוי נוסף תחת ואקום למשך שעה אחת לפחות. הוסף 312.5 microliters של 40 מילימולרים MOPS pH 7.4 מאגר אליליקוט אחד של שומנים ubiquinone 10 FDLL יבש לערבב. מערבבים את המערבולת עד שסרט השומנים מושעה לחלוטין ואחריו שתי דקות של טיפול באמבטיה קולית.לאחר מכן להוסיף 125 microliters של 25 מילימולרים HPTS, צבע פלואורסצנטי רגיש pH כי יהיה אנקפסולציה בתוך ליפוזומים. עכשיו להוסיף 137.5 microliters של 250 מילימולר OGP פעילי שטח. לאחר ערבוב באמצעות מערבולת, sonicate את התערובת באמבט מים קולי במשך 10 דקות כדי להבטיח את כל השומנים הם מנוכרים לתוך micelles פעילי שטח.ואז להעביר את הפיזור לתוך צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר. מוסיפים את הכמות הנדרשת של ציטוכרום BO3 ומוסיפים מים טהורים במיוחד כדי ליצור נפח כולל של 50 מיקרוליטרים. דגירה תערובת reconstitution בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות על מערבל רולר.הבא לשקול 50 מיליגרם של microbeads פוליסטירן לתוך כל אחד משני כובעי צינור 1.5 מיליליטר. ואז לשקול 100 מיליגרם של microbeads פוליסטירן לתוך עוד שני כובעי צינור 1.5 מיליליטר. סגור את הכובעים עם סרט פרפין כדי למנוע ייבוש.הוסף את 50 המיליגרם הראשונים של חיידקים פוליסטירן לתוך תערובת reconstitution על ידי הצבת הכובע עם microbeads פוליסטירן על צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עם הפיזור מוכן. ואז לבצע ספין קצר במשך כמה שניות כדי להביא microbeads לתחתית הצינור. דגירה ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס על מערבל רולר כדי לאפשר microbeads פוליסטירן לספוג את החומר הגלישה במשך 30 דקות.חזור על התוספות של חיידקים פוליסטירן ודגירה כדלקמן. מוסיפים 50 מיליגרם של חיידקים במשך 60 דקות של דגירה. לאחר מכן להוסיף 100 מיליגרם של microbeads במשך 60 דקות של דגירה.ולבסוף, להוסיף 100 מיליגרם של microbeads במשך 120 דקות של דגירה. הפרד את פתרון הפרוטאוליפוזום מהמיקרוביאדים הפוליסטירן באמצעות מיקרופיפטית עם קצה דק. לדלל את הפיזור ב 90 מיליליטר של חיץ MOPS בצינור מרכזי במיוחד TI 45.Ultracentrifuge את הפיזור באמצעות סוג 45 TI רוטור ב 125, 000 פעמים G במשך שעה אחת כדי גלולה proteoliposomes. לאחר ultracentrifugation, להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי עם חיץ MOPS מבלי resuspending גלולה. לאחר השלכת חיץ שטיפה, להשעות מחדש את proteoliposomes ב 500 microliters של חיץ MOPS על ידי צינורות אותו קדימה ואחורה עם micropipette קצה דק לפני העברת המתלה צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 12, 000 פעמים G כדי להסיר את הפסולת, להעביר את supernatant שהוא proteoliposomes מחדש לתוך בקבוקון חדש. הדבק עד תשעה מחליקי כיסוי זכוכית על משטח זהב מתאדה באמצעות אפוקסי דו-רכיבים דל פלואורסצנטיות. לרפא את הדבק ב 80 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.רגע לפני השינוי עם שכבת מונו בהרכבה עצמית, נתק את החלקות כיסוי הזכוכית מוופל הסיליקון עם להב. בשל הדקות של מחליקי הכיסוי, יש לדאוג בעת ניתוק החלקות הכיסוי לא לפצח או לשבור את שקופיות הזכוכית. טובלים את הכיסוי הטרי מצופה זהב מחליק לתוך פתרון 6-marcaptohexanol ולהשאיר ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס לילה כדי ליצור את השכבה מונו התאספו עצמית.למחרת, להסיר את החלקות כיסוי מצופה זהב מהתסכול ולשטוף בקצרה עם מים או מתנול ולאחר מכן עם isopropanol. יבש את הכיסוי מצופה הזהב מחליק תחת זרימת גז עדינה. להרכיב את פתק הכיסוי מצופה זהב בתא ספקטרו-אלקטרוכימי כפי שדיאגרמה בפרוטוקול הטקסט.צור קשר עם הזהב עם חוט שטוח מחוץ לאזור המוגדר על ידי גומי O-ring ו לדפוק בחוזקה את התא האלקטרוכימי על גבי זה. הוסף שני מיליליטר של פתרון מאגר האלקטרוליטים והצב את האלקטרודות הייחוס והאלקטרודות העזר בתא. המשך לבדוק את איכות השכבה המונו-שכבתית שהורכבה עצמית והפעל ריקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוסיפים פרוטאוליפוזום לתא האלקטרוכימי ב-0.5 מיליגרם לריכוז שומנים סופי מיליליטר ומערבבים מעט עם פיפטה. המתן 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עד לסיום ספיגת הפרוטאוליפוזום על משטח האלקטרודה. לשטוף את התא על ידי שינוי פתרון החיץ לפחות 10 פעמים, אבל להימנע השארת משטח האלקטרודה יבש לחלוטין.עכשיו, לרוץ ספקטרוסקופיה בלתי תלויה אלקטרוכימית בפוטנציאל תא פתוח כדי לאשר את שכבת מונו התאספו עצמית על האלקטרודה זהב נשאר ללא שינוי. הפעל voltammograms מחזורי עם שיעורי סריקה 10 ו 100 מיליבולטים לשנייה כדי לצפות חמצון אוביקינול קטאלטי הפחתת חמצן על ידי ציטוכרום BO3 בתחילת הפוטנציאלים של הפחתת קווינון אלקטרוכימיים. לשנות את האלקטרודה זהב כמו קודם אבל באמצעות חמישה מיקרוגרם לכל פרוטאוליפוזום מיליליטר.עבור מחקרי אנזים יחיד להפחית את יחס ציטוכרום BO3 כדי השומנים בין 0.1 ו 0.2%Place טיפה של שמן טבילה ולאחר מכן את התא האלקטרוכימי על המטרה 60 פעמים שמן של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. באמצעות מסננים מתאימים עבור פלואורסצנטיות FDLL, להתמקד על פני האלקטרודה. ליפוזומים בודדים צריכים להופיע כנקודות בהירות במגבלת ההתעבהות של מטרת המיקרוסקופ.לצלם תמונה של פלורסנס FDLL. עבור אל אחת מערכות מסנן פלורסנס HPTS במיקרוסקופ כדי לוודא כי פלורנס HTPS גלוי בבירור וניתן להבחין בין הרקע. הגדל את עוצמת האור אם זה לא המקרה.תכנת את תוכנת המיקרוסקופ לביצוע רכישת תמונה מתוזמן על-ידי החלפת שתי ערכות מסנני HTPS. לשם כך, הגדר חשיפה של שנייה אחת ולאחר מכן נווט אל יישומי תפריט. לאחר מכן הגדר/הפעל רכישת ND ובחר שני ערוצי HTPS.הגדר את ההשהיה בין רכישות תמונה לכל הפחות. בניסוי זה להשתמש 0.3 השהיה שנייה ומשך כולל של חמש דקות. התאם את ההגדרות של potentiostat כדי לשנות את הפוטנציאל במהלך רכישת התמונה כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.עכשיו, בו זמנית להפעיל את רכישת תמונה מתוזמן על המיקרוסקופ ואת הרצף הפוטנציאלי על potentiostat על ידי הפעלת ידנית שתי המדידות בו זמנית. המוצגים כאן תמונות פלואורסצנטיות של ליפוזומים נספגים על האלקטרודות בשלושה כיסויים שונים. הצבע המכיל ליפוזומים נראה בתמונות כנקודות בהירות.החלק המרכזי של התמונה היה מולבן כדי לחשוף את רמת הפלורנס ברקע. התמונות בשני ערוצי HTPS הם סופר בלתי נסבל שבו היחס בין שני הערוצים מתאים pH של 7.4 בשימוש בניסוי זה. מספר גדול יותר של ליפוזומים גלויים עם ערוץ FDLL, אשר מציין את נוכחותם של ליפוזומים כי אין HPTS אנקפסולציה.ההבדל בין ערוצי HPTS ו- FDLL בולט יותר בכיסויים גבוהים יותר. אולי בגלל כיסוי ליפוזום גבוה, ליפוזומים נוטים יותר להתפוצץ או להתיך על פני השטח. כאן, השינוי של florescence ליפוזום בשני ערוצי HTPS מוצג כמגרש משטח 3D של האזור המתאים במהלך 300 שניות של הניסוי.הפוטנציאל המצמצם יושם בין 60 שניות ל-180 שניות. ההתוויה המתאימה של יחס עוצמת מדד נפח של שני ערוצי HPTS לעומת זמן מוצגת. מוצגים כאן החציונים של כל השינויים ב- pH של שלפוחית בתוך תמונה אחת כאשר תוכן BO3 של ציטוכרום הוא 1.3%עלייה ב- pH גלויה בבירור כאשר מוחל פוטנציאל בין 0.1 ל- 0.3 וולט.כאשר תוכן BO3 ציטוכרום הוא ערך נמוך בהרבה של 0.1% העקומות החציוני להיות כמעט בלתי ניתן להבחנה מאלה של ליפוזומים ריקים. חשוב להבטיח הסרה מלאה של פעילי שטח מן היתרים ליפוזום מאז שאריות עשוי להגדיל את חדרות של ליפוזומים פרוטונים. שיטות אלה מאפשרות לנו לשאול שאלות ספציפיות על מצע קווינון ליפופילי טבעי בניגוד לאנלוגיות קינונה מסיסות במים המשמשות לעתים קרובות.יתר על כן, ניסויי האנזים היחיד זיהו מצב דליפה שלא היה ידוע קודם לכן שבו החלבון פועל כתעלת פרוטון שבה פרוטונים זורמים בחופשיות לאחור.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...