Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

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1. एक लिपिड/uq-10/fdll मिश्रण की तैयारी
नोट: ई. कोलाई लिपिड ' liposomes तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और अच्छी तरह से ubiquinone-10 (एंजाइम सब्सट्रेट) और लंबी तरंग दैर्घ्य फ्लोरोसेंट डाई-लेबल लिपिड के ?...

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वर्णित विधि श्वसन झिल्ली प्रोटीन द्वारा पंप प्रोटॉन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है जिसे लिपोसोम में पुनर्गठन किया जा सकता है और क्विनोन फंक्शन पूल के साथ इलेक्ट्रॉनों का आदान-प्रदान करने में सक्षम ?...

एंजाइम तंत्र और कैनेटीक्स के बारे में जानकारी आमतौर पर एनसेंबल या मैक्रोस्केल स्तर पर हजारों में एंजाइम जनसंख्या के साथ प्राप्त की है लाखों अणुओं के लिए, जहां माप एक सांख्यिकीय औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह ज्ञात है, तथापि, कि इस तरह के एंजाइमों के रूप में जटिल अणुओं उनके व्यवहार और आणविक एनसेंबल स्तर पर मनाया तंत्र में विषमजनन का प्रदर्शन कर सकते है हर अणु के लिए जरूरी वैध नहीं हैं । व्यक्तिगत अणु पैमाने पर ऐसी विचलन बड़े पैमाने पर पिछले दो दशकों के दौरान उभर तरीकों की एक किस्म के साथ एकल एंजाइमों के अध्ययन द्वारा पुष्टि की गई है1. विशेष रूप से, व्यक्तिगत एंजाइम गतिविधि की प्रतिदीप्ति जांच एंजाइमों गतिविधि2,3 की विषमजनन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है या तथाकथित स्मृति प्रभाव की खोज (उच्च एंजाइमों गतिविधि की अवधि कम की अवधि के द्वारा सफल गतिविधि और इसके विपरीत)4,5.
कई एकल एंजाइम अध्ययनों से यह अपेक्षा की जाती है कि एंजाइमों की सतह पर मैटीरियल या किसी अन्य तरीके से स्थिर रूप से निरंतर अवलोकन के लिए देखने के क्षेत्र में पर्याप्त समय तक रहने के लिए निर्धारित किया जाता है । लिपोसोम में एन्जाइम एन्कैप्सूलेशन एंजाइम स्थिरीकरण को सक्षम करने के लिए दिखाया गया है, जबकि सतह-एंजाइम या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन6,7के कारण किसी भी नकारात्मक प्रभाव को रोकता है । इसके अलावा, लिपोसोम अपने प्राकृतिक लिपिड बिलयर पर्यावरण8,9,10में एकल झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय संभावना प्रदान करते हैं ।
झिल्ली प्रोटीन का एक वर्ग, ट्रांसपोर्टरों, कोशिका झिल्ली भर में पदार्थों की एक दिशात्मक स्थानांतरण अभ्यास, एक व्यवहार है कि केवल अध्ययन किया जा सकता है जब प्रोटीन लिपिड bilayers में पुनर्गठन कर रहे हैं (जैसे, liposomes)11, 12,13. उदाहरण के लिए, प्रोटॉन translocation, प्रोकार्योटिक और यूकर्योटिक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के कई एंजाइमों द्वारा प्रदर्शित, एक प्रोटॉन उद्देश्य एटीपी संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया बल बनाने के द्वारा सेलुलर श्वसन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस मामले में, प्रोटॉन पंपिंग गतिविधि इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण करने के लिए युग्मित है, हालांकि इस प्रक्रिया की विस्तृत व्यवस्था अक्सर मायावी बनी हुई है ।
हाल ही में, हम इस संभावना का प्रदर्शन करने के लिए इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री के साथ फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अध्ययन करने के लिए प्रोटॉन पंप escherichia कोलाई के टर्मिनल ubiquinol ऑक्सीडेस के एकल एंजाइमों की गतिविधि (cytochrome बो3) लिपोसोम में पुनर्गठन14. यह ई से तैयार किए गए लिपोसोम के लुमेन में एक पीएच-संवेदी झिल्ली-अभेद्य फ्लोरोसेंट डाई के एनकैप्सुलेशन द्वारा प्राप्त किया गया था । कोलाई ध्रुवीय लिपिड्स (चित्रा 1a). प्रोटीन की मात्रा को अनुकूलित किया गया था ताकि अधिकांश लिपोसोम या तो कोई या केवल एक पुनर्गठन एंजाइम अणु (प्वासों वितरण के अनुसार) निहित हो । साइटोक्रोम बो3 के दो substrates लिपिड मिश्रण है कि liposomes और समाधान में (परिवेश) ऑक्सीजन का गठन करने के लिए ubiquinone जोड़कर प्रदान की गई । liposomes तो एक अर्द्ध पारदर्शी अल्ट्रा चिकनी सोने इलेक्ट्रोड, 6-mercaptohexanol के एक आत्म इकट्ठे monolayer के साथ कवर पर विरल adsorbed हैं । अंत में, इलेक्ट्रोड एक सरल स्पेक्ट्रोइलेक्ट्रोकेमिकल सेल (चित्रा 1b) के तल पर रखा गया है । क्विनोन फंक्शन पूल रेडॉक्स राज्य के विद्युत नियंत्रण एक flexibly ट्रिगर करने के लिए या किसी भी क्षण में एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए अनुमति देता है, जबकि पीएच संवेदनशील डाई के लिए liposomes के लुमेन के अंदर पीएच परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा प्रोटॉन स्थानांतरण का एक परिणाम के रूप में एंजाइमों. एक दूसरे की प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करके, लिपिड-फ्लोरोसेंट डाई, आकार और मात्रा में व्यक्तिगत लिपोसोम का निर्धारण किया जा सकता है और इस प्रकार एंजाइम प्रोटॉन पंप गतिविधि का परिमाणन । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने विशेष रूप से पाया कि साइटोक्रोम बो3 अणु एक सहज रिसाव अवस्था में प्रवेश करने में सक्षम हैं जो प्रोटॉन प्रेरक बल को तेजी से dissipates । इस लेख का लक्ष्य विस्तार में एकल liposome माप की तकनीक का परिचय है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

इलेक्ट्रॉन अंतरण श्रृंखलाओं के प्रोटॉन-पम्पिंग एंजाइम झिल्ली के पार प्रोटॉन स्थानांतरण के लिए रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं, एटीपी उत्पादन के लिए इस्तेमाल एक प्रोटॉन मकसद बल का निर्माण. झिल्ली प्रोटीन की उभयफिलिक प्रकृति उनके हैंडलिंग पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है, और प्राकृतिक लिपिड वातावरण में पुनर्गठन अपरिहार्य है जब प्रोटॉन translocation की तरह झिल्ली परिवहन प्रक्रियाओं का अध्ययन. यहां, हम विस्तार से एक तरीका है कि प्रोटॉन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली रेडॉक्स एंजाइमों के तंत्र पम्पिंग, साइटोक्रोम एक उदाहरण के रूप में escherichia कोलाई से 3 बो ले । विद्युत रसायन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन क्विनोन पूल के रेडॉक्स राज्य को नियंत्रित करने और लुमेन में पीएच परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के कारण, लाइपोसोम के सैकड़ों एक साथ मापा जा सकता है, जबकि एंजाइम सामग्री एक एकल एंजाइम या liposome प्रति ट्रांसपोर्टर के लिए नीचे बढ़ाया जा सकता है । संबंधित एकल एंजाइम विश्लेषण एंजाइम कार्यात्मक गतिशीलता है कि अंयथा पूरी आबादी के व्यवहार से छिपा हो सकता है में पैटर्न प्रकट कर सकते हैं । हम स्वचालित छवि विश्लेषण के लिए एक स्क्रिप्ट का वर्णन शामिल हैं ।

6mh के एक सैम के साथ सोने की संशोधित कवर स्लिप (इलेक्ट्रोड) की गुणवत्ता विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ प्रत्येक प्रयोग से पहले जाँच की जाती है । चित्रा 2a प्रतिनिधि कोल-?...

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

यहां, हम एक उदाहरण के रूप में साइटोक्रोम बो3 का उपयोग कर, एकल liposomes की लिपिड झिल्ली भर में प्रोटॉन स्थानांतरण के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एकल या एकाधिक एंजाइम युक्त एकल vesicles के लुमेन में विद्युत रसायन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, पीएच परिवर्तन का संयोजन, का पता लगाया जा सकता है और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया ।

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

कार्बोहाइड्रेट अपमानजनक एंजाइमों की उच्च throughput स्क्रीनिंग उपन्यास अघुलनशील chromogenic सब्सट्रेट परख किट का उपयोग

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली में Phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट की एकल अणु सुपर संकल्प इमेजिंग

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

प्रोटीन फिल्म अवरक्त Electrochemistry एक [नाईफ] Hydrogenase द्वारा एच2 ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए प्रदर्शन किया

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...